A穩(wěn)定性、mRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位、翻譯的 起始、延長(zhǎng)或終止或者基因表達(dá)的任一其他階段起作用。遺傳控制元件可以單獨(dú)或者相互 組合發(fā)揮功能。
[0042] "糖蛋白":如本文所用的術(shù)語"糖蛋白"指含有一個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接的寡糖鏈的蛋 白質(zhì)或多肽。寡糖鏈可以由單一糖殘基、糖殘基的單一不分枝的鏈組成或者可以由分枝一 次或多次的糖殘基鏈組成。在一些實(shí)施方案中，寡糖鏈?zhǔn)荖-連接的。在一些實(shí)施方案中， 寡糖鏈?zhǔn)签?連接的。
[0043] "糖基化模式":術(shù)語"糖基化模式"指給定的一種或多種糖蛋白的所觀察到的糖基 化。在寡糖鏈中具有較大數(shù)目的共價(jià)連接的糖殘基的糖蛋白被說成是具有增加的或者更廣 泛的糖基化模式。相反地，在寡糖鏈中具有較少的共價(jià)連接的糖殘基的糖蛋白被說成是具 有減少的或者較不廣泛的糖基化模式。如本文所有的術(shù)語"糖基化模式"也指根據(jù)本發(fā)明 的教導(dǎo)表達(dá)的個(gè)體糖蛋白上的一些不同的糖基化模式的特征性分布。在該意義上，增加的 糖基化模式指所表達(dá)的糖蛋白的糖基化模式的特征性分布的增加。
[0044] "宿主細(xì)胞":如本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"指根據(jù)本發(fā)明操作以產(chǎn)生如本文所述 的具有希望的糖基化模式的糖蛋白的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0045] "雜交瘤"：如本文所用的術(shù)語"雜交瘤"指永生化細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合得 到的細(xì)胞或細(xì)胞后代。這種得到的雜交瘤是產(chǎn)生抗體的永生化細(xì)胞。用于產(chǎn)生雜交瘤的 個(gè)體細(xì)胞可以來自任何哺乳動(dòng)物來源，包括但不限于，大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。 在一些實(shí)施方案中，雜交瘤是三瘤細(xì)胞系，當(dāng)人細(xì)胞和小鼠雜交瘤細(xì)胞系融合產(chǎn)物一一 異雜交骨髓瘤融合后代隨后與漿細(xì)胞融合時(shí)得到三瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方案中，雜交 瘤是產(chǎn)生抗體的任何永生化的雜交細(xì)胞系，如四瘤（quadromas)(見例如，Milstein等 人，Nature, 537:3053, 1983)〇
[0046] "培養(yǎng)基"、"細(xì)胞培養(yǎng)基"、"培養(yǎng)基":如本文使用的這些術(shù)語指為生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞提供營養(yǎng)的含有營養(yǎng)物的溶液。通常，此類溶液提供細(xì)胞的基本生長(zhǎng)和/或存活所需 的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂類和微量元素。此類溶液也可以含有在最小程度 之上增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或存活的補(bǔ)充組分（見下面"補(bǔ)充組分"的定義），包括但不限于，激素和 /或其他生長(zhǎng)因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩沖劑、維生素、核苷或核苷 酸、微量元素（通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物）、氨基酸、脂類和/或葡萄糖或其他能 源。在一些實(shí)施方案中，有利地將培養(yǎng)基配制成對(duì)于細(xì)胞存活和增殖最優(yōu)的pH和鹽濃度。 示例性培養(yǎng)基在表1中顯示，然而本發(fā)明不限于使用這些培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí) 到可以使用備選培養(yǎng)基和/或可以對(duì)表1中所列的示例性培養(yǎng)基的組成進(jìn)行某些改變。在 一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是在細(xì)胞培養(yǎng)開始后加入的補(bǔ)料培養(yǎng)基（見上面的"補(bǔ)料培養(yǎng)基" 的定義）。
[0047] "多肽":如本文使用的術(shù)語"多肽"指通過肽鍵連接在一起的氨基酸的順序鏈。該 術(shù)語用于指任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該術(shù)語不限于長(zhǎng)鏈并且可以 指包含通過肽鍵連接在一起的兩個(gè)氨基酸的最小鏈。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以處理和 /或修飾多肽。例如，可以糖基化多肽（見上面"糖蛋白"的定義）。
[0048] "蛋白質(zhì)":如本文使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)"指作為離散單位發(fā)揮功能的一種或多種多 肽。如果單個(gè)多肽是離散的功能單位并且不需要與其他多肽永久或暫時(shí)物理結(jié)合以便形成 離散的功能單位，那么術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"可以互換使用。如果離散的功能單位由物 理上相互結(jié)合的一種以上的多肽組成，那么術(shù)語"蛋白質(zhì)"指物理上偶聯(lián)并且一起作為離散 單位發(fā)揮功能的多個(gè)多肽。
[0049] "重組表達(dá)的糖蛋白"和"重組糖蛋白":如本文使用的這些術(shù)語指從宿主細(xì)胞表達(dá) 的糖蛋白，所述宿主細(xì)胞已經(jīng)通過人的手操作而表達(dá)該糖蛋白。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì) 胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，此類操作包含一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾。例如，通過導(dǎo) 入一個(gè)或多個(gè)編碼待表達(dá)糖蛋白的異源基因可以遺傳修飾哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。異源重組表 達(dá)的糖蛋白可以與在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中正常表達(dá)的糖蛋白相同或相似。異源重組表達(dá)的 糖蛋白也可以是宿主細(xì)胞外源的，即，與在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中正常表達(dá)的糖蛋白是異源 的。在一些實(shí)施方案中，異源重組表達(dá)的糖蛋白是嵌合的，因?yàn)樵撎堑鞍椎牟糠趾信c在哺 乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中正常表達(dá)的糖蛋白相同或相似的氨基酸序列，而其他部分是宿主細(xì)胞外 源的。備選地，通過活化或上調(diào)一種或多種內(nèi)源基因可以遺傳修飾哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
[0050] "補(bǔ)充組分":如本文使用的術(shù)語"補(bǔ)充組分"指增強(qiáng)生長(zhǎng)和/存活高于最小程度的 組分，包括但不限于，激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽）、 緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素（通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物）、氨基 酸、脂類和/或葡萄糖或其他能源。在一些實(shí)施方案中，可以將補(bǔ)充組分加入最初的細(xì)胞培 養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞培養(yǎng)開始后加入補(bǔ)充組分。
[0051] "效價(jià)":如本文使用的術(shù)語"效價(jià)"指在給定量的培養(yǎng)基體積中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 物產(chǎn)生的重組表達(dá)的糖蛋白的總量。效價(jià)通常以毫克糖蛋白/毫升培養(yǎng)基的單位表示。
[0052] 一些實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0053] 本發(fā)明提供了用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生糖蛋白的改進(jìn)系統(tǒng)。具體地，提供了導(dǎo)致 產(chǎn)生含有希望的糖基化模式的糖蛋白的系統(tǒng)。例如，糖蛋白可以具有更廣泛的糖基化模式 和/或可以具有更類似于天然宿主細(xì)胞應(yīng)用于糖蛋白的寡糖鏈分布的寡糖鏈分布。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明系統(tǒng)的使用可以導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的糖蛋白，其糖基化模式與該糖蛋白在 內(nèi)源人細(xì)胞中表達(dá)時(shí)將存在的糖基化模式相似或相同。在下面詳細(xì)討論本發(fā)明的一些實(shí)施 方案。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些實(shí)施方案的多種修飾在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán) 利要求和其等同方案限定了本發(fā)明的范圍，其不會(huì)且不應(yīng)該局限于某些實(shí)施方案的描述或 受到某些實(shí)施方案的描述的限制。
[0054] 培養(yǎng)基組成
[0055] 多種哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以生長(zhǎng)于 多種化學(xué)上確定成分培養(yǎng)基的一種中，其中培養(yǎng)基的成分是已知和受控的。在一些實(shí)施方 案中，細(xì)胞可以生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基中，其中不是培養(yǎng)基的所有組分都是已知和/或受控的。
[0056] 在過去幾十年內(nèi)已經(jīng)廣泛開發(fā)和公開了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)上確定成 分培養(yǎng)基。確定成分培養(yǎng)基的所有組分被良好表征，并且該確定成分培養(yǎng)基不含有復(fù)雜的 添加劑，如血清或水解物。開發(fā)了早期的培養(yǎng)基制劑以允許細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力的維持，而對(duì) 于蛋白質(zhì)產(chǎn)生關(guān)心很少或者不關(guān)心。最近，開發(fā)的培養(yǎng)基制劑具有維持產(chǎn)生高水平生產(chǎn)性 重組蛋白和/或糖蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物的表達(dá)目的。
[0057] 確定成分培養(yǎng)基通常由水中的已知濃度的基本上50種化學(xué)實(shí)體組成。它們的多 數(shù)也含有一種或多種良好表征的蛋白質(zhì)，如胰島素、IGF-I、轉(zhuǎn)鐵蛋白或BSA，但是其他的不 需要蛋白質(zhì)組分并且因此被稱作無蛋白質(zhì)的確定成分培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的化學(xué)組分落入五個(gè) 大類：氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素和難以良好歸類的雜類。
[0058] 微量元素由以微摩爾或更低水平被包括的多種無機(jī)鹽組成。存在于幾乎所有確定 成分培養(yǎng)基中的四種最通常被包括的微量元素是鐵、鋅、硒和銅。鐵（二價(jià)或三價(jià)鹽）和鋅 通常以微摩爾濃度加入，而其他的通常以納摩爾濃度加入。多數(shù)較不常見的微量元素通常 以納摩爾濃度加入。
[0059] 錳通常作為二價(jià)陽離子（1111(：12或MnSO4)被包括在微量元素中。在早期形式的確 定成分培養(yǎng)基中，它被省略或者以1 μ M級(jí)的高濃度包括（見例如，Barnes和Sato, 1980 [培 養(yǎng)基DMEM/F12]和Kitos等人，1962[培養(yǎng)基MD 705/1])。在最近開發(fā)的確定成分培養(yǎng) 基中，錳常常被包括在內(nèi)，但是以低得多的濃度，如1-5ηΜ范圍的濃度包括在內(nèi)（見例如， Hamilton 和 Ham, 1977 [培養(yǎng)基 MCDB 301]和 Cleveland 和 Erlanger, 1988 [未命名的培養(yǎng) 基])。
[0060] 本發(fā)明包括如下發(fā)現(xiàn)：在含有這些極限濃度之間的錳濃度的確定成分培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白比在常規(guī)培養(yǎng)基（如上述的那些培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn) 生的糖蛋白含有更廣泛的糖基化模式。在一些實(shí)施方案中，錳以約10到600nM的濃度在培 養(yǎng)基中提供。在一些實(shí)施方案中，錳以約20到IOOnM的濃度在培養(yǎng)基中提供。在一些實(shí) 施方案中，錳以約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、 310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、 500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600nM的濃度或者這些濃度內(nèi)的任何范圍 的濃度在培養(yǎng)基中提供。
[0061] 本發(fā)明也包括如下發(fā)現(xiàn)：在含有相對(duì)低水平的谷氨酰胺的確定成分培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白比在含有較高水平谷氨酰胺的常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生 的糖蛋白含有更廣泛的糖基化模式。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中谷氨酰胺的最初水平小 于或等于約8mM。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中谷氨酰胺的最初水平小于或等于約4mM。
[0062] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于他或她的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的具體屬性選擇這些發(fā)明性 范圍內(nèi)的確切的錳濃度，所述屬性包括表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞的特性、待產(chǎn)生的糖蛋白的特性， 和用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中其他組分的存在或缺失。例如，每個(gè)這些大類中N-連接的和 〇-連接的結(jié)構(gòu)之間的差異、或具體寡糖結(jié)構(gòu)之間的差異可以需要生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不同的錳濃 度以便產(chǎn)生更廣泛和/或更天然的寡糖鏈。
[0063] 糖蛋白
[0064] 根據(jù)本教導(dǎo)可以產(chǎn)生能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何糖蛋白。糖蛋白可以從宿主細(xì) 胞的內(nèi)源基因表達(dá)，或者從導(dǎo)入宿主細(xì)胞的異源基因表達(dá)。糖蛋白可以是在自然界中存在 的糖蛋白，或者可以備選地具有通過人的手改造或選擇的序列。待產(chǎn)生的糖蛋白可以從在 自然界單獨(dú)發(fā)生的多肽片段裝配，至少一個(gè)片段含有作為糖基化位點(diǎn)的肽序列。備選地，每 個(gè)多肽片段可以僅僅具有糖基化位點(diǎn)的一部分，當(dāng)多肽片段裝配時(shí)重構(gòu)該糖基化位點(diǎn)。額 外或備選地，改造的糖蛋白可以包括非天然存在的一個(gè)或多個(gè)片段，只要該改造的糖蛋白 含有作為糖基化位點(diǎn)的至少一個(gè)肽序列。
[0065] 可以希望根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的糖蛋白將通?；谟腥せ蛴杏玫纳锘蚧瘜W(xué)活性選 擇。例如，本發(fā)明可以用于表達(dá)任一種藥學(xué)或商業(yè)上相關(guān)的酶、受體、抗體、激素、調(diào)節(jié)因子、 抗原、結(jié)合劑等等。可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的下面糖蛋白的列表僅僅是示例性的，并且不意在 作為限制性引用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解任何糖蛋白可以根據(jù)本發(fā)明表達(dá)并且將能夠基于 他或她的具體需要選擇待產(chǎn)生的具體糖蛋白。
[0066] M血因子
[0067] 已經(jīng)表明凝血因子作為藥學(xué)和/或商業(yè)活性劑是有效的?？紤]到重組凝血因子在 治療諸如血友病的疾病中的重要性，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)化重組產(chǎn)生的凝血因子的糖基化模式是 尤其重要的。例如，凝血因子IX (因子IX或"FIX"）是單鏈糖蛋白，其缺乏導(dǎo)致B型血友 病，其是患者的血液不能凝固的一種疾病。從而，任何導(dǎo)致出血的小創(chuàng)傷都是潛在威脅生命 的事件。
[0068] FIX作為單鏈酶原合成，其通過活性肽的釋放而被活化成兩條鏈的絲氨酸 蛋白酶（因子IXa)。因子IXa的催化結(jié)構(gòu)域位于重鏈中（見Chang等人，J. Cl in. Invest.，100:4, 1997,引入本文作為參考）。FIX有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，包括N-連接的和 〇 -連接的糖類二者。曾經(jīng)認(rèn)為絲氨酸61處的一種具體的0-連接的結(jié)構(gòu)Sia-α 2,3_ Gal-β l，4-GlcNAc-|3 1，3-Fuc-a I-O-Ser)是FIX特有的但是其后來在包括哺乳動(dòng)物 和果幡中的Notch蛋白質(zhì)的一些其他分子上被發(fā)現(xiàn)（Maloney等人，Journal of Biol. Chem. ,275(13) ,2000)。細(xì)胞培養(yǎng)中中國倉鼠卵巢（"CH0"）細(xì)胞產(chǎn)生的FIX在絲氨酸61 寡糖鏈中顯示出一定的變異性。這些不同的糖形和其他潛在的糖形當(dāng)施用于人或動(dòng)物時(shí)可 以具有不同的誘導(dǎo)凝血的能力和/或在血液中具有不同的穩(wěn)定性，導(dǎo)致效率較低的凝血。
[0069] A型血友病在臨床上與B型血友病不能區(qū)分，由人類凝血因子VIII中的缺陷引 起，人類凝血因子VIII是另一種糖蛋白，其作為單鏈酶原合成然后被加工成兩條鏈的活性 形式。本發(fā)明也可以用于控制或改變凝血因子VIII的糖基化模式以便調(diào)節(jié)它的凝血活性。 根據(jù)本發(fā)明可以產(chǎn)生并且可以控制或改變其糖基化模式的其他糖蛋白凝血因子包括例如， 但不限于，組織因子和馮維勒布蘭德（von Willebrands)因子。
[0070] 抗體
[0071] 抗體是能夠特異結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)。考慮到當(dāng)前使用或研宄中的許多抗體作 為藥學(xué)或其他商業(yè)活性劑，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生具有希望的糖基化模式的抗體是尤其重要的。 此外，具有不同的糖基化模式的抗體較不可能在施用它們的個(gè)體中引起免疫應(yīng)答，導(dǎo)致更 有效的治療方案。額外或備選地，在它們的恒定區(qū)中具有不同糖基化模式的抗體可以顯示 出改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)或藥物動(dòng)力學(xué)效應(yīng)功能。額外或備選地，具有不同糖基化模式的 抗體可以在產(chǎn)生它們的細(xì)胞培養(yǎng)條件中更穩(wěn)定，例如，通過更抗細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白酶或 其他組分，使得產(chǎn)生更高最終效價(jià)的抗體。
[0072] 根據(jù)本公開的教導(dǎo)可以使用可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何抗體。在一些實(shí)施方 案中，待表達(dá)的抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體。嵌合抗 體含有來自一種以上生物的氨基酸片段。嵌合抗體分子可以包括例如，來自小鼠、大鼠 或其他物種的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人恒定區(qū)。已經(jīng)描述了多種制備嵌合抗體的方法（見 例如，Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81，6851，1985 ;Takeda 等人，Nature 314, 452, 1985, Cabilly 等人，美國專利號(hào) 4, 816, 567 ;Boss 等人，美國專利號(hào) 4, 816, 397 ; Tanaguchi等人，歐洲專利公布EP171496;歐洲專利公布0173494,英國專利GB 2177096B, 將它們各自引入本文作為參考）。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體是人源化抗體。人源化抗體是嵌合抗體，其中多 數(shù)氨基酸殘基來自人抗體，從而使得遞送到人類受試者時(shí)減小任何潛在的免疫反應(yīng)。在人 源化抗體中，高變區(qū)中的氨基酸殘基被來自非人物種的賦予所希望的抗原特異性或親和性 的殘基替換。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體具有與人抗體有百分之80、85、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99或更高同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，通過引入保守替代、 共有序列替代、種系替代和/或回復(fù)突變優(yōu)化人源化抗體。此類改變的免疫球蛋白分子 可以通過本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)的任一種制備（例如，Teng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，80, 7308-7312, 1983 ;Kozbor 等人，Immunology Today, 4, 7279, 1983 ;01sson 等 人，Meth. Enzymol.，92, 3-16. 1982,各自引入本文作為參考）。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)PCT 公布W092/06193或EP 0239400(各自完整引入本文作為參考）的教導(dǎo)制備改變的免疫球 蛋白分子。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開的教導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以含有顯示出改進(jìn)的糖基化 模式的免疫球蛋白恒定區(qū)或Fc區(qū)。例如，根據(jù)本文教導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以更強(qiáng)烈結(jié)合效應(yīng) 分子或?qū)π?yīng)分子有更高特異性，所述效應(yīng)分子如補(bǔ)體和/或Fc受體，可以控制抗體的幾 種免疫功能，如效應(yīng)細(xì)胞活性、裂解、補(bǔ)體介導(dǎo)的活性、抗體清除、和抗體半壽期。結(jié)合抗體 (如IgG抗體）的Fc區(qū)的典型的Fc受體包括，但不限于，F(xiàn)cy RI、Fe YRII和Fcy RIII和 FcRn亞類的受體，包括這些受體的等位變體和選擇性