專利名稱：單鏈雙功能的糖蛋白激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地，涉及通常為異二聚體的某些糖蛋白激素的修飾形式。本發(fā)明涉及絨毛膜促性腺激素(CG)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的經(jīng)修飾的單鏈形式，它們能夠提供兩種效果或功能，或者一般能夠作為天然激素的促效劑和／或拮抗劑而起作用。
背景技術(shù)：
在人體中，四種重要的糖蛋白激素異(源)二聚體(LH、FSH、TSH和CG)具有相同的a亞基和不同的β亞基。這些激素中的三種也幾乎存在于所有其它的脊椎動物中；而目前僅在靈長類以及懷孕母馬的胎盤和尿中發(fā)現(xiàn)CG。
PCT申請WO90／09800(1990年9月7日出版，在此引用作為參考)描述了這些激素的許多修飾形式。一種重要的修飾是用人絨毛膜促性腺激素或其變異體的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)對β亞基進(jìn)行C端延伸。也描述了這些激素的其他突變蛋白。CTP是從人絨毛膜促性腺激素β亞基的112-118位中任一位置延伸至145位的氨基酸序列。該P(yáng)CT申請描述了通過保守性氨基酸置換而獲得CTP延伸變異體，而不破壞CTP的改變清除特性的能力。此外，PCT專利申請WO 94／24148(1994年10月27日公布，在此引用作為參考)描述了通過在C末端以外的位置延伸或插入CTP而修飾這些激素，而且CTP片段比從112-118位延伸至145位的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亞基還在申請人的兩篇文章中有描述LaPolt，P．S．等人；Endocrinoloy(1992)1312514-2520和Fares，F(xiàn)．A．等人，Proc Natl Acad SciUSA(1992)894304-4308。這兩篇文章在此引用作為參考。
人絨毛膜促性腺激素異源二聚體形式的晶體結(jié)構(gòu)已發(fā)表在幾乎同時(shí)出版的兩篇文章中。一篇是Lapthorn，A．J．等人，Nature(1994)369455-461，另一篇是Wu，H．等人，Structure(1994)2545-558。這些文章的結(jié)果總結(jié)于Patel，D．J．Nature(1994)369438-439中。
PCT申請WO91／16922(1991年11月14日公布)描述了異源二聚體糖蛋白激素的多種嵌合的及其他修飾形式。一般而言，該文獻(xiàn)針對分別涉及各種α或β鏈的α亞基或β亞基的嵌合物。簡單地列在該申請中而沒有給出其他說明的一個(gè)構(gòu)建物將基本上整個(gè)人絨毛膜促性腺激素的β鏈與α亞基前體蛋白(即含有該亞基的分泌信號序列)融合在一起。
另外兩個(gè)公布的PCT申請描述了這些激素的單鏈形式，其中α和β亞基被共價(jià)相連，形成如下通式的融合肽∶β(接頭)nα或α(接頭)nβ式中n為0或1，而α和β為這些激素的各亞基。Moyle，W．RPCT申請WO95／22340(1995年8月24日公布)；以及本發(fā)明人的申請WO96／05224(1996年2月22日公布)。這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容也在此引用作為參考。
上述單鏈糖蛋白激素的一類形式，即胱氨酸橋連(bridge)的數(shù)目被減少的形式，公開于美國申請No．08／933，693(1997年9月19日申請)。該申請?jiān)诖艘米鳛閰⒖肌?br> 目前已發(fā)現(xiàn)，通過將兩個(gè)β亞基包含在一個(gè)單鏈內(nèi)使其共用一個(gè)共同的α亞基，可以構(gòu)建出一種單鏈形式的糖蛋白激素，它們有更強(qiáng)的促效劑和／或拮抗劑活性，和／或它們是雙功能的。這些形式可以含有如上述文獻(xiàn)中描述的各種CTP延伸片段和插入片段以及α和β亞基的天然形式的變異體和CTP的變異體。
本發(fā)明公開的內(nèi)容本發(fā)明提供了糖蛋白激素的單鏈形式，它含有兩個(gè)相同或不同的β亞基。本發(fā)明的單鏈形式可以是糖基化、部分糖基化或非糖基化的，而且存在于天然糖蛋白激素或其變異體中的α和β鏈可以任選地通過接頭成分(linker moiety)而連接。特別優(yōu)選的接頭成分包括羧基端肽(CTP)單元，它或者是完整的單元或者是其一部分所構(gòu)成的變異體。產(chǎn)生的單鏈激素或者保留或增強(qiáng)了未修飾的異源二聚體形式激素的活性，或者是該活性的拮抗劑。如果兩個(gè)β亞基不同，那么它們作為促效劑和／或拮抗劑而呈現(xiàn)雙功能。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種糖基化或非糖基化的下式蛋白質(zhì)β1-(接頭1)m-α-(接頭2)n-β2(1)；或β1-(接頭1)m-β2-(接頭2)n-α(2)；或α-(接頭1)m-β1-(接頭2)n-β2(3)式中，各β1和β2具有脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或是所述氨基酸序列的變異體(其中所述變異體在本文中已有定義)?！唉痢敝讣棺祫游锾堑鞍准に卅羴喕蚱渥儺愺w；“接頭”指共價(jià)相連的成分，它以合適的距離將β1和β2亞基與α亞基，以及將β1和β2亞基相互間隔開。各m和n獨(dú)立地為0或1。
在所有上述例子中，單鏈形式保留了構(gòu)象，因此在單鏈形式中包含整個(gè)亞基是不必要的。因此，本發(fā)明包括上式(1)、(2)和(3)的化合物，它含有α和／或β亞基的片段，其中這些形式保留了含完整亞基的對應(yīng)形式所表現(xiàn)的生物活性。
另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白的重組材料和方法，涉及含有本發(fā)明蛋白的藥物組合物，涉及對本發(fā)明蛋白特異的抗體，以及涉及其應(yīng)用的方法。
附圖簡述

圖1顯示了在與hCG的競爭下，化合物CGβ-α-CTP-FSHβ與LH受體的結(jié)合情況。
圖2顯示了在與FSH的競爭下，圖1中化合物與FSH受體的結(jié)合情況。
發(fā)明的實(shí)施方式在人體中有四種“糖蛋白”激素構(gòu)成一個(gè)包括人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH)和促甲狀腺激素(TSH)在內(nèi)的家族。如此處所用，“糖蛋白激素”指該家族的所有成員。所有這些激素都是由α亞基和β亞基構(gòu)成的異二聚體，其中對于某一物種而言在該組中的α亞基氨基酸序列是相同的，而β亞基因視家族成員的不同而不同。因此，一般情況下這些糖蛋白激素是由相互結(jié)合但非共價(jià)相連的α和β亞基構(gòu)成的異二聚體。大多數(shù)脊椎動物產(chǎn)生FSH、TSH和LH；絨毛膜促性腺激素只在包括人在內(nèi)的靈長類和懷孕母馬中發(fā)現(xiàn)。
在動物中，各激素的α和β亞基由不同的基因編碼，而且分別合成，然后被裝配成非共價(jià)相連的異二聚體復(fù)合物。在本發(fā)明的化合物中，β亞基被直接連于α亞基成為一個(gè)一級結(jié)構(gòu)必然為線性的單鏈分子。由二級和三級結(jié)構(gòu)因素和構(gòu)象所賦予的三維結(jié)構(gòu)，在外觀上與異二聚體形式十分相似，從而使β亞基所代表的異二聚體的功能得以表現(xiàn)。然而，通過亞基結(jié)構(gòu)的適當(dāng)變化，本發(fā)明的化合物可以具有促效劑或拮抗劑活性；例如，如果β亞基是不同的，化合物可表現(xiàn)出針對某一糖蛋白激素受體的拮抗劑活性，但是又表現(xiàn)出對另一受體的促效劑活性，或者可以對兩種受體都有促效劑活性或拮抗劑活性。本發(fā)明化合物所表現(xiàn)出的活性譜，取決于選擇的各α和β亞基、連接成分的性質(zhì)、以及α和β亞基的取向。
在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，式(1)、(2)或(3)化合物是融合蛋白，其中α和β亞基直接地或通過肽接頭而頭對尾地相連。在只有基因編碼的氨基酸構(gòu)成序列時(shí)，該化合物可重組合成。然而，并不需要將本發(fā)明化合物局限于這種方式；α和β亞基以及接頭可包括非基因編碼的氨基酸。此外，接頭可以是肽之外的物質(zhì)，例如二羧酸或酸酐、二胺、或雙功能接頭(例如Pierce Chemical CoRockford，IL出售的)等。此外，這些亞基可以按融合蛋白所需要的頭對頭或尾對尾構(gòu)型、以及頭對尾構(gòu)型直接地或通過接頭而相連。在這些情況下，用標(biāo)準(zhǔn)活化技術(shù)，對于頭對頭構(gòu)型而言，兩個(gè)氨基可以通過酸酐或通過任何二羧酸衍生物而連接；兩個(gè)羧基可以通過二胺或二醇連接。
但是，為了方便起見，最優(yōu)選的形式是頭對尾構(gòu)型，其中形成標(biāo)準(zhǔn)的肽鍵，而且化合物可以通過重組技術(shù)或肽合成技術(shù)制備成融合蛋白，它或者是諸反應(yīng)成分的單鏈，或者較佳地，連接了整個(gè)序列的各部分。
不論各實(shí)例如何，α和β亞基在靠近其N端和C端的位置處與該分子的其余部分連接。優(yōu)選的是，這些亞基直接在其末端相連，然而這種連接也許是單純的“靠近”型。一般地，“靠近”表示在末端的10個(gè)氨基酸之內(nèi)，較佳地在5個(gè)氨基酸之內(nèi)，更佳地在2個(gè)氨基酸之內(nèi)的一個(gè)位置，最佳地為末端本身。
亞基組份如此處所用，α亞基，和FSH、LH、TSH和CG的β亞基以及異二聚體形式一般與其常規(guī)定義相同，指具有本領(lǐng)域中已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其等位變異體，而不論其所表現(xiàn)的糖基化方式或氨基酸側(cè)鏈的其他衍生變化。
這些肽的“天然”形式是指具有從相關(guān)脊椎動物組織中分離出的氨基酸序列、而且具有本領(lǐng)域中已知氨基酸序列的肽或其等位變異體。
這些蛋白質(zhì)和CTP單元(見下文)的“變異體”形式，指通過例如定點(diǎn)突變或其他重組操作而產(chǎn)生的或者人工合成的、在天然蛋白質(zhì)氨基酸序列中具有故意改變(包括截短)的蛋白質(zhì)。
這些改變由1-10、較佳地1-8、更佳地1-5個(gè)氨基酸變化構(gòu)成，包括缺失、插入和取代，其中最佳的是保守性氨基酸取代。得到的變異體必須保留活性以影響天然激素的相應(yīng)活性，即或者它們必須保留天然激素的生物學(xué)活性從而能起促效劑作用，或者它們必須起拮抗劑的作用，通常是能夠與天然激素的受體結(jié)合但不能實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
按常規(guī)含義，“保守性類似物”指這樣的類似物，其中被取代的殘基與進(jìn)行取代的殘基屬于同一氨基酸種類。如本領(lǐng)域中熟知的那樣，氨基酸已分類成幾組，例如參見Dayhoff，M．等人，Atlas of Protein Sequences andStructure(1972)5∶89-99。通常，酸性氨基酸被歸在一組；堿性氨基酸被歸在一組；中性親水氨基酸被歸在一組；等等。更具體的分類情況列于WO 96／05224，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
一組優(yōu)選變異體是其中α或β亞基或兩者的糖基化位點(diǎn)被改變的變異體。本文所述的激素四成員家族(quartet)的部分有用變異體在美國專利5，177，193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作為參考)。如其所述，可以通過破壞相關(guān)位點(diǎn)，或者通過選擇產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞而改變糖基化方式。
氨基酸序列的改變也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式被包括在變異體中，例如缺失C末端85-92位中部分或全部氨基酸的α亞基突變型。此外還包括缺失N末端的1-10個(gè)氨基酸的α亞基。
突變蛋白還包括非關(guān)鍵區(qū)域被改變或被去除的突變蛋白。這種缺失和改變可包括整個(gè)環(huán)，從而缺失或改變遠(yuǎn)大于10個(gè)氨基酸的序列。但是變異體必須至少保留受體結(jié)合域和／或涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域。
有相當(dāng)多的文獻(xiàn)涉及此處所述的激素四成員家族的變異體，而且從這些文獻(xiàn)中明顯地知道，可以制備大量可能具有促效劑和拮抗劑活性的變異體。公開的這些變異體參見Chen，F(xiàn)．等人，Molec Endocrinol(1992)6914-919；Yoo，J．等人，JBiol Chem (1993)26813034-13042；Yoo，J等人，J BiolChem(1991)26617741-17743；Puett，D．等人，Glycoprotein Hormones，Lusbader，J．W．等人，EDS，Springer Verlag New York(1994)122-134；Kuetmann，H．T．et al(ibid)P103-117；Erickson，L．D．等人，End ocrinology(1990)1262555-2560；和Bielinska，M．等人，J Cell Biol(1990)111330a(Abstract 1844)。
其他的變異體包括其中有一個(gè)或多個(gè)胱氨酸連接被缺失的種類，這典型地是通過用中性氨基酸置換一個(gè)或兩個(gè)參與連接的半胱氨酸而實(shí)現(xiàn)。特別優(yōu)選的可被缺失的胱氨酸連接是位于26位和110位之間以及23位和72位之間的胱氨酸連接。
此外，已表明，激素四成員家族的β亞基可以以嵌合形式構(gòu)建從而提供嵌合體兩種組份的生物學(xué)功能，或者通常提供生物學(xué)功能改變的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88760-764；Moyle，Nature(1994)368251-255描述的方法構(gòu)建具有FSH和LH／CG活性的嵌合分子。如這些文章中所述，用FSH-β的101-109位氨基酸置換CG-β亞基中的相應(yīng)殘基可得到具有hCG和FSH二者活性的類似物。
如本文所用，“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，因?yàn)樗鼈冎g的長度區(qū)別是不確定的。
如上所述，在構(gòu)成本發(fā)明的具有或不具有連接成分的化合物時(shí)，被用作α和β亞基的“變異體”可以是該亞基的完整氨基酸序列或僅是其一部分。
“變異體”還包括含插入在非關(guān)鍵區(qū)域的CTP(或變異的CTP)的α和／或β鏈。
α和β亞基的“非關(guān)鍵”區(qū)域是生物學(xué)活性(包括促效劑和拮抗劑活性)非必需的分子區(qū)域。通?？蓪⑦@些區(qū)域從結(jié)合位點(diǎn)、前體剪切位點(diǎn)和催化區(qū)域中去除。對引導(dǎo)合適折疊、與受體結(jié)合和催化活性等至關(guān)重要的區(qū)域，應(yīng)加以評估。應(yīng)注意，在二聚體情況下是關(guān)鍵的某些區(qū)域在單鏈形式下會變成非關(guān)鍵的，因?yàn)橛煞肿铀x予的構(gòu)象限制可能會消除這些區(qū)域的關(guān)鍵性。非關(guān)鍵區(qū)域的確定可以方便地通過缺失或修飾候選區(qū)域然后對所需活性進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y試即可實(shí)現(xiàn)。因修飾而導(dǎo)致活性損失的區(qū)域是關(guān)鍵的；而改變后導(dǎo)致相同或相似活性(包括拮抗劑活性)的區(qū)域被認(rèn)為是非關(guān)鍵的。
應(yīng)再次強(qiáng)調(diào)，“生物學(xué)活性”指對天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些區(qū)域?qū)ψ儺愺w作為拮抗劑起作用至關(guān)重要，盡管拮抗劑不能直接提供激素的生理效應(yīng)。
例如，對于α亞基，33-59位被認(rèn)為是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，而羧基端20個(gè)氨基酸的延伸段是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)／受體結(jié)合所必需的。與β亞基進(jìn)行裝配中的關(guān)鍵殘基至少包括殘基33-58，尤其是37-40。
當(dāng)非關(guān)鍵區(qū)域“靠近”N末端或C末端時(shí)，插入可以位于該末端10個(gè)氨基酸中的任何位置，更佳地在5個(gè)氨基酸中，最佳地為末端本身。
如本文所用，“CTP單元”指在人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基端發(fā)現(xiàn)的、在C末端從氨基酸112-118延伸至殘基145的氨基酸序列，或指其一部份。因此，每個(gè)“完整”CTP單元含有28-34個(gè)氨基酸，其長度取決于CTP的N末端。
“部分”CTP單元指這樣的氨基酸序列，它位于位置112-118至145(含145本身)，但是從最短的“完整”CTP單元(即從118-145位)中缺失至少一個(gè)氨基酸。這些“部分”序列包括在“變異體”的定義內(nèi)。“部分”CTP單元宜含有至少一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。激素的某些非糖基化形式是拮抗劑，因此可以作為拮抗劑使用。CTP單元在絲氨酸殘基處含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于121(位點(diǎn)1)、127(位點(diǎn)2)、132(位點(diǎn)3)和138(位點(diǎn)4)位。用于促效劑的CTP部分形式可含有一個(gè)或多個(gè)按在天然CTP序列中的次序排列的這些位點(diǎn)，盡管介于中間的位點(diǎn)可以刪略。
在某些情況下，可以插入或使用串聯(lián)式的CTP單元作為接頭?！按?lián)式”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少兩個(gè)“CTP單元”。每個(gè)CTP單元可以是完整的或是片段，可以是天然的或變異的。在串聯(lián)式延伸或插入中的所有CTP單元可以是相同的，也可以互不相同。
“接頭成分”是將α和β序列連接在一起而又不干擾其活性的組成部分，這些活性由作為異二聚體成員的同一α和β所表現(xiàn)，或者它發(fā)生了改變使其活性從促效劑轉(zhuǎn)變成拮抗劑活性。活性水平可以在合理的范圍內(nèi)變動，但是接頭的存在不能使單鏈形式基本上喪失其促效劑和拮抗劑活性。單鏈形式并不是前肽而是成熟的蛋白質(zhì)，而且必須表現(xiàn)出與該異二聚體(異二聚體的元件形成其組成)的激素活性有關(guān)的活性。
雙功能激素的優(yōu)選例本發(fā)明的雙功能激素可用重組技術(shù)進(jìn)行最有效和最經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)。因此，優(yōu)選的是那些僅含有基因編碼的氨基酸的α和β鏈、CTP單元和其他接頭成分形式的融合蛋白。然而，如上所述，有可能用肽合成技術(shù)或其他有機(jī)合成技術(shù)來構(gòu)建至少某單鏈激素的部分，因此含有非基因編碼的氨基酸和非肽型接頭的變異體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在最佳實(shí)施例中，β1亞基的C-末端是共價(jià)地(可任選地通過接頭)連于成熟α亞基的N-末端，該α亞基又共價(jià)地(可任選地通過接頭)連于β2亞基。連接可以是直接肽連接，其中一個(gè)亞基的C末端氨基酸與另一亞基的N末端直接通過肽鍵而相連；但是，在許多情況下，最好在兩個(gè)末端之間含有接頭成分。在大多數(shù)情況下，接頭成分在兩個(gè)鏈之間至少提供一個(gè)β轉(zhuǎn)角。因此，在接頭中存在脯氨酸殘基也許是有利的。
(應(yīng)理解，在所討論的構(gòu)成單鏈形式的亞基末端之間的連接中，一個(gè)或多個(gè)末端也可以通過如上所述的取代和／或缺失而改變。)在一組特別優(yōu)選的實(shí)施例中，連接是頭對尾型，接頭成分含有一個(gè)或多個(gè)CTP單元和／或其變異體或截短形式。用于這種接頭成分的CTP單元的優(yōu)選形式在下面描述。
此外，接頭成分可含有共價(jià)地(最好可以釋放)連于接頭成分的藥物。將藥物偶聯(lián)于接頭成分的方法以及使其釋放的方法是常規(guī)方法。
如上所述，CTP和其變異體除了位于接頭成分中之外，還可以包括在構(gòu)成單鏈激素的各亞基的任何非關(guān)鍵區(qū)域中。
盡管CTP單元宜包含在接頭成分中，應(yīng)理解該接頭可以是能提供α和β亞基適當(dāng)空間關(guān)系的任何合適的共價(jià)結(jié)合材料。因此，對于頭對尾構(gòu)型，接頭一般是二價(jià)成分，例如含有任意數(shù)目的、但通常小于100個(gè)、更佳地小于50個(gè)的氨基酸的肽，它具有適當(dāng)?shù)挠H水性／疏水性比率以便在溶液中能提供適當(dāng)?shù)拈g隔和構(gòu)象，或者是可賦予這些特性的非肽型接頭。通常，接頭應(yīng)有均衡的親水性，從而位于周圍溶液中并且不干擾α和β亞基或者兩個(gè)β亞基之間的相互作用。較佳地，接頭含有通常由肽接頭中脯氨酸提供的β轉(zhuǎn)角，或者含有絲氨酸和／或甘氨酸殘基。可以使用具有上述正確特性的任何合適的聚合物，其中包括肽接頭。
特別優(yōu)選的本發(fā)明的雙功能激素例子包括頭對尾構(gòu)型的βFSH-α-βFSH；α-βFSH-βLH；βFSH-α-βLH；βLH-α-βLH；α-βLH-βFSH；βLH-α-βFSH；βTSH-α-βTSH；βTSH-βFSH-α；βTSH-α-βFSH；βCG-α-βCG；α-βCG-βFSH；α-βCG-βTSH；βCG-βFSH-α；βCG-α-βTSH；βFSH-CTP-αβFSH；α-βFSH-CTP-βLH；βFSH-CTP-α-βLH；βLH-CTP-αβLH；α-βLH-CTP-βFSH；βLH-α-CTP-βFSH；βLH(δ115-123)-α-βFSH；βLH(δ115-123)-CTP-α-βFSH；βCG-CTP-αCTP-βFSH-CTP-CTP；βTSH-CTP-CTP-αβFSH-CTP-CTP；βFSH-CTP-CTP-α-βLH；βLH-CTP-CTP-βLH-α；βCG-CTP-CTP-α-βTSH；βCG-CTP-CTP-βLH-α；βFSH-CTP-βLH(δ115-123)-CTP-α；等。
人類的亞基形式也是特別優(yōu)選的。在上述構(gòu)建物中，“CTP”指CTP或其變異體(包括截短片段)，如No．96／05224中所述。
對于應(yīng)用于人體，人類形式的α和β亞基是理想的。應(yīng)理解，在其他脊椎動物中的對應(yīng)形式可用于獸醫(yī)用途。因此，牛、羊、馬、豬、貓、犬和其他動物特有的FSH、TSH和LH亞基，適用于影響這些物種自身的各病癥。
可以包含在接頭成分中的合適藥物包括肽或蛋白質(zhì)，例如類胰島素生長因子；表皮生長因子；酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子；血小板衍生的生長因子；各種集落刺激因子(CFS)，例如粒細(xì)胞CFS、巨噬細(xì)胞CFS等；以及各種細(xì)胞因子如IL-2、IL-3和多種其他白細(xì)胞介素蛋白質(zhì)；各種干擾素；腫瘤壞死因子等?？梢园糜卺尫胚@些藥物的合適的切割位點(diǎn)如蛋白酶的靶序列，而該蛋白酶的靶位點(diǎn)并不存在于α和β亞基中。肽類或蛋白質(zhì)類藥物的優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)構(gòu)建物可以方便地通過單基因的重組表達(dá)而生產(chǎn)。另外，也可以使用小分子藥物如抗生素、消炎藥、毒素等。
一般地，包含在接頭成分中的藥物可以是需要在激素通常結(jié)合的受體附近發(fā)揮作用的藥物。還可提供將藥物從接頭的包含形式中釋放出來的合適方法，例如通過在下面的“制備方法”一節(jié)中所述的引入酶催化裂解位點(diǎn)的方法。
其他修飾本發(fā)明的單鏈蛋白質(zhì)還可以用公知的方法進(jìn)行偶聯(lián)或衍生從而對氨基酸序列進(jìn)行衍生變化，例如磷酸化、糖基化、對通常的糖基化形式進(jìn)行去糖基化、酰化、對氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾(如將脯氨酸轉(zhuǎn)變成羥基脯氨酸)，以及與那些翻譯后修飾(已發(fā)現(xiàn)普遍存在)類似的修飾形式。
本發(fā)明的激素的糖基化狀態(tài)尤為重要。激素可以以非糖基化形式制備，這可通過在原核宿主中生產(chǎn)，或通過突變亞基和／或CTP單元中一般存在的糖基化位點(diǎn)。非糖基化和部分糖基化的激素可以通過對糖基化位點(diǎn)的操作來制備。當(dāng)然，糖基化形式也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
正如本領(lǐng)域中熟知的那樣，本發(fā)明的單鏈蛋白質(zhì)也可偶連于標(biāo)記物、載體、固相載體等，這取決于所需的用途?？梢允褂闷錁?biāo)記形式來跟蹤其代謝結(jié)果；用于該目的的合適標(biāo)記物包括(尤其是)放射性同位素標(biāo)記物如碘131、锝99、銦111等。這些標(biāo)記物也可用于介導(dǎo)在測試系統(tǒng)中對單鏈蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測；在該例子中，可以使用放射性同位素以及酶標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、生色標(biāo)記物等。使用這類標(biāo)記物可對有關(guān)受體進(jìn)行定位，因?yàn)樗鼈兛捎米鬟@些受體的導(dǎo)向式(targ eting)試劑。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可偶聯(lián)于載體以便在制備與這些新的修飾形式發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體的過程中增加其免疫原性。用于該目的的合適載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉類毒素等?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)技術(shù)將本發(fā)明的修飾肽與載體相連，包括使用雙功能接頭。
可以使用類似的連接技術(shù)及其他技術(shù)，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)偶聯(lián)于固相載體。偶聯(lián)后，可以將這些蛋白質(zhì)用作親和試劑，分離所需的、與其有特異反應(yīng)的組份。因此，它們可用于純化和分離與適當(dāng)β亞基發(fā)生作用的受體。
制備方法構(gòu)建本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。如上所述，如果僅含有基因編碼的氨基酸，而且單鏈?zhǔn)翘幱陬^對尾構(gòu)型，那么目前最實(shí)際的方法是通過表達(dá)編碼所需蛋白質(zhì)的DNA而重組合成這些材料。含有編碼單鏈形式(包括變異形式)的核酸序列的DNA可以由天然序列制備，或者從頭人工合成，或者組合使用這些技術(shù)。定點(diǎn)誘變、連入額外序列、擴(kuò)增反應(yīng)(如PCR)和構(gòu)建合適表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)目前都是本領(lǐng)域中眾所周知的。編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全部DNA可以用標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)合成，最好引入限制性酶切位點(diǎn)以方便連接。可將用于轉(zhuǎn)錄和翻譯包含的編碼序列的合適控制元件提供給DNA編碼序列。眾所周知，目前已有可以與大量不同宿主相容的表達(dá)系統(tǒng)，這些宿主包括原核宿主如大腸桿菌或枯草桿菌和真核宿主如酵母、其他真菌(如曲霉和鏈孢霉屬)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)、鳥類細(xì)胞等。
宿主的選擇尤其應(yīng)涉及翻譯后加工，特別是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子內(nèi)的糖基化位點(diǎn)的性質(zhì)所控制；但是，占據(jù)該位點(diǎn)的糖的性質(zhì)主要由宿主的性質(zhì)所決定。因此，本發(fā)明激素性質(zhì)的微調(diào)可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇宿主而實(shí)現(xiàn)。
α亞基部分(其中α亞基是修飾的或非修飾的)的一種特別優(yōu)選的基因形式是“小基因”(minigene)構(gòu)建物。如本文所用，α亞基“小基因”指在Matzuk，M．Met al，Mol Endocrinol(1988)295-100中描述pM2／CG α或pM2／I構(gòu)建物中所公開的基因構(gòu)建物。
對于重組生產(chǎn)，可使用已用表達(dá)系統(tǒng)修飾的宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)從而產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。此處使用的術(shù)語如下“修飾的”重組宿主細(xì)胞，即“經(jīng)修飾從而含有”本發(fā)明的重組表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，指這樣的宿主細(xì)胞，它已經(jīng)用方便的引入方法(包括轉(zhuǎn)染、病毒感染等)處理從而含有此表達(dá)系統(tǒng)?！靶揎椀募?xì)胞”是指細(xì)胞含有該表達(dá)系統(tǒng)而不論該表達(dá)系統(tǒng)是整合入染色體還是位于染色體之外?！靶揎椀摹奔?xì)胞對于包含表達(dá)系統(tǒng)可以是穩(wěn)定的，或者編碼序列可被瞬時(shí)表達(dá)。簡而言之，帶有本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的“修飾的”重組宿主細(xì)胞是指，當(dāng)天然不含有該表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，通過引入操作而含有該表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，而不論用何種方式實(shí)現(xiàn)這種引入。
“表達(dá)系統(tǒng)”指含有待表達(dá)的編碼核苷酸序列及其相伴的、實(shí)現(xiàn)編碼序列表達(dá)所必需的控制序列的DNA分子。典型地，這些控制序列包括啟動子、終止調(diào)控序列以及(在某些情況下)操縱子或其他調(diào)控表達(dá)的序列?？刂菩蛄惺悄切┰O(shè)計(jì)用于在特定重組宿主靶細(xì)胞中發(fā)揮作用的序列，因此必須選擇宿主細(xì)胞使之與構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)中的控制序列相容。
如果需要分泌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，那么還要包含編碼信號肽的其他核苷酸序列，從而產(chǎn)生操作性連于(operably linked)所需單鏈激素的信號肽，進(jìn)而產(chǎn)生前體蛋白。一旦分泌，信號肽被切除，釋放出成熟的單鏈激素。
如本文所用，“細(xì)胞”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“細(xì)胞系”可互換使用而不必在意其細(xì)微區(qū)別。在需要區(qū)分它們的地方，會在上下文中清楚地表明。對于都可以表示的場合，所有含義的都包括在內(nèi)。
產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞裂解液中獲得(如果產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi))，或者從培養(yǎng)基中獲得(如果是分泌的)。從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收重組蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，而且可以用已知技術(shù)如色譜法、凝膠電泳、選擇性沉淀等純化這些蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的全部或部分激素可以用本領(lǐng)域已知的肽合成技術(shù)直接合成。合成的部分可以連接起來，而在接頭成分中所含藥物的釋放位點(diǎn)可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法引入。當(dāng)然，對于那些含有非基因編碼的氨基酸的例子以及采用頭對頭或尾對尾構(gòu)型的例子，合成工作至少部分是處于蛋白質(zhì)水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的頭對頭連接，可以通過含有與氨基起反應(yīng)的功能基團(tuán)的接頭如二羧酸衍生物而實(shí)現(xiàn)。在C端或靠近C端的位置的尾對尾連接，可以通過二胺、二醇或其組合的接頭而實(shí)現(xiàn)。
抗體本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生與這些新化合物起特異性免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體可以用于各種診斷和治療用途。
抗體一般是用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案在哺乳動物如兔、小鼠、羊或大鼠中制備，并且抗體作為多克隆抗血清進(jìn)行效價(jià)測定以保證免疫充分。然后收獲多克隆抗血清以用于例如免疫測定。來自宿主的分泌抗體的細(xì)胞，如脾細(xì)胞或外周血白細(xì)胞，可以用已知的技術(shù)進(jìn)行永生化處理并篩選，以產(chǎn)生對本發(fā)明的蛋白質(zhì)呈免疫特異性的單克隆抗體。“抗體”包括其保留所需免疫特異性的任何片段，例如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)v等。因此，抗體也可以用重組技術(shù)制備，通常是分離出至少編碼單克隆抗體可變區(qū)(具有合適特異性)的核苷酸序列并構(gòu)建合適的表達(dá)系統(tǒng)。這種方法允許進(jìn)行任何所需的修飾，例如產(chǎn)生Fv形式、嵌合形式、“人源化”形式等。
“對本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫特異性的”指在確定親和性或非親和性所考慮的普通參數(shù)內(nèi)，抗體能特異性地結(jié)合于本發(fā)明的化合物，但不結(jié)合于異二聚體或其亞基本身或僅包括一個(gè)β亞基的任何單鏈形式。應(yīng)理解，特異性是一個(gè)相對概念，可以選擇任意的限度，例如特異性結(jié)合可相差100倍或更多。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)的免疫特異性抗體與其針對的單鏈蛋白質(zhì)的反應(yīng)比與相應(yīng)異二聚體、現(xiàn)有技術(shù)的單鏈形式或各亞基的反應(yīng)至少大100倍。這些抗體的獲得，可以通過例如選擇與本發(fā)明化合物結(jié)合的抗體并且舍去也結(jié)合異二聚體、亞基或現(xiàn)有技術(shù)單鏈形式(描述于WO95／22340和WO96／05224)的那些抗體。
配方和用法可用已知的、與單鏈形式相應(yīng)的異二聚體類似的方法，來配制和施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，配制和施用方法會隨所用的具體激素或激素組合而有所不同。然而，與異二聚體相比，施用的劑量水平和頻率也可以改變，尤其考慮到如果存在CTP單元，那么生物學(xué)半衰期會因其存在而延長。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的配方是典型的用于蛋白質(zhì)或肽藥物的配方，如在Remington′s Pharmac eutical Sciences(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中所述的配方。蛋白質(zhì)的給藥一般是通過注射，例如靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、或腹膜內(nèi)注射，或者使用透粘膜或透皮給藥的配方。這些配方一般含有表面活性劑或滲透劑如膽鹽、梭鏈孢酸等。這些配方還可以以氣霧劑或栓劑形式，或者在透皮給藥中以皮膚膏藥(patch)形式給藥?？诜o藥也是可行的，只要配方能防止本發(fā)明的肽在消化道中被降解。
劑量規(guī)定和配方的優(yōu)化可按常規(guī)方法并如本領(lǐng)域中通常進(jìn)行的那樣進(jìn)行。這些配方也可修改以包含適合獸醫(yī)應(yīng)用的那些成分。
本發(fā)明的化合物可以用于許多方面，最明顯地是作為激素異二聚體形式的替代物。因此，與異二聚體相同，本發(fā)明的促效劑形式的單鏈激素可用于治療不育癥(作為體外受精技術(shù)的輔助劑)以及其他與天然激素相關(guān)的治療方法。這些技術(shù)適用于人和其他動物。當(dāng)然，在其品種衍化方面對單鏈蛋白的選擇取決于采用何種方法。應(yīng)意識到，賦予那些含兩種不同β亞基的化合物的雙重功能，為以前不能得到的治療提供了機(jī)會。
本發(fā)明化合物還可以以類似于異二聚體的方式用作試劑。
此外，本發(fā)明化合物可用作診斷工具，以檢測生物樣品中抗體的存在與否，該抗體結(jié)合于天然蛋白質(zhì)的程度達(dá)到了結(jié)合單鏈化合物相關(guān)部分的程度。它們還可以作為評估各種樣品中這些激素水平的試劑盒中的對照試劑。評估激素本身的水平或針對它們的抗體的水平的方法是本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法?？梢允褂酶鞣N涉及放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等標(biāo)記技術(shù)的競爭性和直接分析試驗(yàn)。
本發(fā)明化合物還可用于檢測和純化與天然激素結(jié)合的受體。因此，本發(fā)明化合物可以偶聯(lián)于固相載體，用于受體或抗激素抗體的親和色譜層析制備。得到的受體本身可用于在篩選治療和候選試劑的試驗(yàn)中評估激素作為候選藥物的活性。當(dāng)然，當(dāng)β亞基不同時(shí)，必須考慮這些化合物中β亞基的雙重特異性。然而，當(dāng)兩個(gè)β亞基相同時(shí)，它們提供了一種針對相關(guān)受體的強(qiáng)有力的親和純化工具。
最后，唯一地與本發(fā)明的單鏈激素反應(yīng)的抗體可用作純化工具，用于分離隨后制備物中的這些材料。它們還可用于監(jiān)測這些化合物作為藥物給藥后的水平。
下列實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1帶備CGβ-α-CTP-FSHβ用現(xiàn)有的編碼各亞基相關(guān)部分的核苷酸序列來制備編碼標(biāo)題化合物的核苷酸序列。CGβ區(qū)域編碼人CGβ的145個(gè)氨基酸；編碼α亞基的核苷酸序列編碼人α的92個(gè)氨基酸(作為小基因)；編碼CTP的序列編碼人絨毛膜促性腺激素118-145位的28個(gè)氨基酸；而FSHβ的編碼區(qū)域編碼人FSHβ亞基的111個(gè)氨基酸。
按Sachais，βBiol．Chem(1993)2682319所述的方式，將含有CGβ外顯子3、α小基因、CTP和βFSH的擴(kuò)增片段插入pM2HA-CGβexonl，2(一種衍生自pM2且含CGβ外顯子1，2的表達(dá)載體)的SalI位點(diǎn)。含CGβ外顯子1，2的pM2在Matzuk，M．M．等人，Proc Natl Acad Sic USA(1987)846354-6358和Matzuk，M．M．等人，JCell Biol(1988)1061049-1059中有描述。首先，將在CGβ外顯子3下游含有α小基因的片段插入該載體，從而獲得pM2-HACGβα。然后pM2-HACGβα用ScaI進(jìn)行酶切，再與ScaI限制性消化過的pBIIKS(+)α-CTP-FSH連接。形成的表達(dá)載體pM2-HACGβ-α-CTP-FSH，當(dāng)插入合適宿主時(shí)，產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
實(shí)施例2CGβ-α-CTP-FSHβ的產(chǎn)生和活性將實(shí)施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，通過放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)在SDS凝膠上的免疫沉淀而評估該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生情況。
收集培養(yǎng)基，濃縮，然后測試其與人LH受體(預(yù)計(jì)會結(jié)合于βCG-α部分)的結(jié)合情況。對于該試驗(yàn)，LH受體的制備是通過將編碼完整人LH受體的cDNA插入表達(dá)載體pCMX(Oikawa，J．X-C等人，Mol Endocrinol(1991)5759-768)。將處于指數(shù)生長期的293細(xì)胞用該載體并用Chen，C．等人，Mol Cell Biol(1987)72745-2752中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致LH受體在表面上表達(dá)。
在該試驗(yàn)中，將表達(dá)人LH受體的細(xì)胞(2×105／管)與lng標(biāo)記的hCG一起溫育，并與濃度逐漸增加的未標(biāo)記hCG或數(shù)量逐漸增加的待測樣品在22℃競爭18小時(shí)。在樣品存在時(shí)，標(biāo)記的下降便表明樣品的結(jié)合能力。在該試驗(yàn)中，對于293細(xì)胞中的人LH受體，異二聚體型hCG具有野生型的活性(這與以前的測定相同)，而含CGβ-α-CTP-FSHβ的培養(yǎng)基也表現(xiàn)出活性。這些結(jié)果示于圖1。如圖所示，異二聚體的hCG(實(shí)心方塊)和本發(fā)明的雙功能單鏈蛋白(實(shí)心圓圈)都成功地與標(biāo)記的hCG競爭LH受體。雙功能化合物的效力稍低，因?yàn)棣羴喕然┒吮恍揎棥?br> 同樣，圖1還顯示了另一試驗(yàn)的結(jié)果，其中測試了來自被修飾從而含有兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞的不同數(shù)量的培養(yǎng)上清。一種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生單鏈FSHβ-α；另一系統(tǒng)產(chǎn)生hCG的β亞基。形成的非共價(jià)相連的單鏈FSHα-β／CGβ復(fù)合物(實(shí)心三角形)也成功地競爭結(jié)合。
類似地，還測試了來自含CGβ-α-CTP-FSHβ的培養(yǎng)基上清與293細(xì)胞中表達(dá)的FSH受體的結(jié)合情況。該試驗(yàn)按上述方式進(jìn)行，不同點(diǎn)在于用表達(dá)人FSH受體的細(xì)胞替換表達(dá)人LH受體的細(xì)胞，并且將標(biāo)記的FSH用作競爭劑。該試驗(yàn)的結(jié)果示于圖2。
如圖所示，單鏈的標(biāo)題化合物(實(shí)心圓圈)成功地與FSH(實(shí)心方塊)競爭結(jié)合。在另一無關(guān)的試驗(yàn)中，同樣如圖2所示，不同類型復(fù)合物(即非共價(jià)地連于CGβ的單鏈FSHβ-α)的混合物(與非復(fù)合的且過量的單鏈FSHβ-α(實(shí)心三角形)混合而成)，是一種出色的競爭劑。
實(shí)施例4構(gòu)建其他的表達(dá)載體按與實(shí)施例1類似的方式，制備產(chǎn)生單鏈雙功能FSHβ-CTP-α-CGβ、α-FSHβ-CTP-CGβ、CGβ-βFSH-CTP-α和β LH-CTP-βFSH-CTP-α的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。收獲培養(yǎng)上清液，并如上所述針對LH受體和FSH受體進(jìn)行測試。這些化合物也表現(xiàn)出結(jié)合于兩種受體的能力。
權(quán)利要求
1．一種糖基化或非糖基化的、具有促效劑和／或拮抗劑活性的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有下式β1-(接頭1)m-α-(接頭2)n-β2(1)；或β1-(接頭1)m-β2-(接頭2)n-α(2)；或α-(接頭1)m-β1-(接頭2)n-β2(3)式中，各β1和β2具有脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或是該氨基酸序列的變異體；“α”指脊椎動物糖蛋白激素α亞基或其變異體；“接頭”指共價(jià)相連的成分，它將β1和β2亞基與α亞基，以及將β1和β2亞基相互間隔開，從而有效地保留了所述活性；以及各m和n獨(dú)立地為0或1。
2．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該m和n是1。
3．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，至少一個(gè)該接頭成分包含一針對糖蛋白激素受體的藥物，或者其中至少一個(gè)接頭是CTP或其變異體。
4．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，β1是FSH、LH、或TSH的β亞基，并通過全長或部分CTP單元或其變異體而延伸至靠近其C末端的一個(gè)位置。
5．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，α亞基或者一個(gè)或多個(gè)β亞基，或兩者都通過將CTP單元或其變異體插入非關(guān)鍵區(qū)域而被修飾，和／或其中的所述接頭成分包括CTP或其變異體。
6．如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該變異體相對于所述序列的天然形式而言含有1-5個(gè)保守的氨基酸替換，和／或所述變異體是所述序列的截短形式。
7．一種藥物組合物，其特征在于，它含有與適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑相混合的權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
8．一種被偶連于固相載體的權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
9．一種對權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)有免疫特異性的抗體。
10．一種DNA或RNA分子，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
11．一種表達(dá)系統(tǒng)，它用于產(chǎn)生糖蛋白激素的促效劑和／或拮抗劑，其特征在于，該表達(dá)系統(tǒng)含有編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的第一核苷酸序列，該序列操作性地連于能夠?qū)崿F(xiàn)所述第一核苷酸序列表達(dá)的控制序列。
12．如權(quán)利要求11所述的表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，它還含有編碼信號肽的第二核苷酸序列，該信號肽操作性地連于所述第一核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)。
13．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它經(jīng)修飾以含有權(quán)利要求11所述的表達(dá)系統(tǒng)。
14．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它經(jīng)修飾以含有權(quán)利要求12所述的表達(dá)系統(tǒng)。
15．一種產(chǎn)生單鏈蛋白質(zhì)的方法，該單鏈蛋白質(zhì)是糖蛋白激素的促效劑和／或拮抗劑，其特征在于，該方法包括在產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞；和從培養(yǎng)物中回收所述蛋白質(zhì)。
16．一種產(chǎn)生單鏈蛋白質(zhì)的方法，該單鏈蛋白質(zhì)是糖蛋白激素的促效劑和／或拮抗劑，其特征在于，該方法包括在產(chǎn)生該糖所述蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞；和從培養(yǎng)物中回收所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了糖蛋白激素的單鏈促效劑和/或拮抗劑。這些蛋白質(zhì)具有式:(1)β
文檔編號A61K38/24GK1290301SQ98811235
公開日2001年4月4日 申請日期1998年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月17日
發(fā)明者I·布伊米, D·本－梅納漢 申請人:華盛頓大學(xué)