專利名稱：：減少多肽自結(jié)合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總的來說，本發(fā)明涉及藥物的經(jīng)皮釋放。更具體地說，本發(fā)明涉及減少多肽藥物自結(jié)合以幫助其經(jīng)皮釋放的方法。
背景技術(shù)：
：治療劑的經(jīng)皮(即通過皮膚)釋放提供了一種舒適、方便且無損傷的給藥技術(shù)。該方法與常規(guī)藥物釋放方式相比有多個優(yōu)點(diǎn)。例如，避免了口服給藥中遇到的吸收和(例如肝臟)代謝速率不穩(wěn)定，并消除了其他一些固有不便-例如胃腸刺激等。經(jīng)皮釋放還可以高度控制特定藥物的血液濃度，是具有狹窄治療指數(shù)、短暫半衰期和強(qiáng)活性的藥物的極其引人注目的給藥途徑。經(jīng)皮釋放可以是被動的，也可以是主動的。由于大小、離子電荷特性和疏水性等因素的影響，許多藥物不適合被動經(jīng)皮釋放?？朔@種局限的一個方法是使用低水平的電流以積極地將藥物通過完整皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)。這種技術(shù)稱作“電轉(zhuǎn)運(yùn)”或“離子電滲”藥物釋放。由于所施加電流的幅度、時間選擇和極性可以使用標(biāo)準(zhǔn)電組件容易地進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此該技術(shù)提供了比被動經(jīng)皮藥物釋放更好控制的方法。在這點(diǎn)上，電轉(zhuǎn)運(yùn)藥物通量可能比相同藥物的被動經(jīng)皮藥物通量大50％到數(shù)個數(shù)量級。電轉(zhuǎn)運(yùn)設(shè)備一般使用至少兩個電極。這兩個電極均被置于與身體的一部分皮膚密切電學(xué)接觸。一個電極叫做作用電極或給體電極，治療劑從此電極釋放到身體內(nèi)。另一個電極叫做對電極或返回電極，它起著密閉通過身體的電路的作用。電極通過與電源、例如電池相連而形成與患者的皮膚相連接的電路，所述電極通常是與能控制通過該設(shè)備的電流的電路系統(tǒng)相連。根據(jù)將要經(jīng)皮釋放的物質(zhì)的電荷，作用或給體電極可以是陽極或陰極。因此，如果將要釋放到體內(nèi)的離子物質(zhì)是帶正電荷的，則正電極(陽極)將是作用電極，而負(fù)電極(陰極)將充當(dāng)對電極，形成回路。另一方面，如果將被釋放的離子物質(zhì)是帶負(fù)電荷的，則陰極將是作用電極，而陽極是對電極。另外，陽極和陰極可能均用于將帶有適當(dāng)電荷的藥物釋放到體內(nèi)。在這種情況下，兩個電極都看作是作用或給體電極。換句話說，陽極可以將帶正電荷的藥劑釋放到體內(nèi)，同時陰極可以將帶負(fù)電荷的藥劑釋放到體內(nèi)?，F(xiàn)有電轉(zhuǎn)運(yùn)設(shè)備還需要一個將被釋放到體內(nèi)的治療劑的貯器或來源。這種藥物貯器與該電轉(zhuǎn)運(yùn)設(shè)備的陽極或陰極相連，以作為一種或多種所需物質(zhì)或藥劑的固定或可更新的來源。貯器和來源的實(shí)例包括Jacobsen的美國專利4，250，878中所述的囊袋；Webster的美國專利4，382，529中所述的預(yù)制凝膠體；和Sanderson等的美國專利4，722，726的附圖中公開的保存藥物液體溶液的玻璃或塑料容器。由于肽類、多肽和蛋白質(zhì)在用常規(guī)給藥途徑如口服釋放給藥時常遇到一些問題，因此本文中特別感興趣的是它們的經(jīng)皮釋放。多肽和蛋白質(zhì)分子口服給藥時，極易在胃腸道中被蛋白酶降解并受到肝臟的廣泛代謝。因此，這些物質(zhì)通常需要胃腸外給藥，以在患者的血液中達(dá)到治療濃度。最傳統(tǒng)的胃腸外給藥技術(shù)是皮下注射和靜脈內(nèi)給藥。然而，多肽和蛋白質(zhì)在它們的生物學(xué)活性方面是天生作用短暫的，需要頻繁注射，經(jīng)常是一天數(shù)次，以維持所需的治療有效濃度?；颊呓?jīng)常感到這種治療方案不方便且令人痛苦。這種治療還存在例如感染的危險。現(xiàn)已作出許多努力去尋找多肽和蛋白質(zhì)藥物(除胃腸外注射以外)的其他有效給藥途徑。特別令人感興趣的是具有較少副作用以及更好的患者配合性的給藥途徑。這樣的途徑一般包括“屏護(hù)”口服給藥，其中多肽／蛋白質(zhì)通過胃的低pH環(huán)境后從膠囊或其他容器中釋放，通過粘膜組織，例如用吸入器通過肺粘膜組織、或用鼻噴霧劑通過鼻粘膜組織釋放，和通過可植入泵釋放。不幸的是，這些可供選擇的多肽／蛋白質(zhì)釋放途徑僅取得有限的成功。許多研究人員已公開了多肽和蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放。R．Burnette等(藥物科學(xué)雜志(1986)75738)的早期研究涉及一種小的三肽分子-促甲狀腺素釋放激素的體外皮膚滲透過程。已發(fā)現(xiàn)電轉(zhuǎn)運(yùn)通量高于被動擴(kuò)散通量。Chien等(藥物科學(xué)雜志(1988)78376)的體外和體內(nèi)研究顯示，加壓素和胰島素經(jīng)電轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行經(jīng)皮釋放是可能的。還參見Maulding等，美國法定發(fā)明注冊號No．H1160，它公開了降鈣素在小型豬體內(nèi)的電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放。然而，多肽和蛋白質(zhì)的經(jīng)皮釋放也遇到了技術(shù)上的困難。例如，由于電極和藥物溶液或電解質(zhì)鹽溶液間的接觸面上的水解可能導(dǎo)致發(fā)生皮膚刺激。這種水解的產(chǎn)物-陽極上的水合氫離子和陰極上的羥離子，與類似電荷的藥物離子競爭釋放到皮膚內(nèi)，從而改變了皮膚的pH值并引起皮膚刺激。Phipps等的美國專利5，533，971中更詳細(xì)地描述了此問題，并報道使用氨基酸緩沖液，包括組氨酸緩沖液，來減少皮膚刺激。此外，某些多肽，特別是對于所治療動物來說不是天然的那些，可能會引起皮膚反應(yīng)，例如過敏或刺激。許多多肽也不穩(wěn)定并迅速降解。關(guān)于這點(diǎn)，1993年7月8日出版的國際申請W093／12812中描述了使用組氨酸緩沖液來化學(xué)穩(wěn)定生長激素制劑。另外，某些多肽藥物在水溶液中迅速聚集，這可能引起釋放和可溶性問題。例如，含水胰島素在藥物制劑相當(dāng)濃度時易形成二聚體，它們又依次自結(jié)合成四聚體、六聚體、疊式(stacked)六聚體和其他聚合物，同時溶解性下降。這些聚集體可能阻塞連續(xù)釋放設(shè)備的機(jī)械部分并難以(即使并非不可能)經(jīng)皮釋放。胰島素制劑中慣用于穩(wěn)定和延長胰島素活性的金屬離子如鋅離子的存在加劇了這種趨向。已進(jìn)行了嘗試來減少蛋白質(zhì)諸如胰島素的自結(jié)合。例如，Ogiso等(生物藥理學(xué)通報(1996)191049-1054)報道在豬胰島素低聚物經(jīng)皮吸收之前使用Gly-HCl緩沖液來促進(jìn)其離解。Bringer等(糖尿病(1981)3083-85)報道，二羧基氨基酸Asp和Glu在它們的等電pH值下可減少胰島素在溶液中的聚集。實(shí)驗(yàn)者解釋說，要使用這些氨基酸來阻止聚集，似乎酸性pH(3．5)是必需的。然而，胰島素在酸中是化學(xué)不穩(wěn)定的。Sibalis等的美國專利4，940，456中描述了用于電解經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)的胰島素組合物，它包括脲、丙基脲、碘化鉀、高氯酸鈉或鹽酸胍作為離解劑。據(jù)報道已研究出自結(jié)合趨向減小了的胰島素類似物。例如，Balschmidt等的美國專利5，164，366描述了缺失某些氨基酸的胰島素類似物，諸如缺失PheB24和PheB25。1992年8月6日公開的國際專利申請WO92／12999描述了一些選定氨基酸殘基被Asp和G1u殘基取代的人胰島素類似物。1987年3月18日公開的歐洲專利申請214，826B1中報道了特別是在B9-B12區(qū)域和B26-B28位置具有氨基酸取代的胰島素類似物，其中取代天然氨基酸的殘基是更親水的。優(yōu)選的氨基酸取代基包括Asp，Glu，Ser，Thr，His和Ile。然而，這些類似物中許多表現(xiàn)出生物活性降低。因此，在經(jīng)皮釋放方面，仍期望有降低多肽藥物如胰島素自結(jié)合的方法。發(fā)明的公開因此，本發(fā)明提供了一種防止胰島素和其他生物活性多肽自結(jié)合、同時有助于這些分子溶解的方法。該方法使用組氨酸化合物，憑藉自結(jié)合的減少，使得蛋白質(zhì)更有效地以治療有效量經(jīng)皮釋放，諸如通過電轉(zhuǎn)運(yùn)和被動經(jīng)皮釋放。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減少多肽形成低聚物的方法。該方法包含將多肽與適量的、足以減小所述多肽的自結(jié)合趨向的組氨酸化合物結(jié)合。在特別優(yōu)選的方法中，組氨酸化合物是L-組氨酸或L-甘氨酰組氨酸，多肽是有或沒有鋅的胰島素化合物，諸如無鋅人胰島素化合物或人LysB28ProB29胰島素類似物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減少人胰島素化合物形成六聚體和更大物質(zhì)的方法。該方法包含將胰島素化合物與約pH7-約pH8的組氨酸化合物混合。組氨酸的濃度至少為約10毫摩爾濃度(mM)。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種利用電轉(zhuǎn)運(yùn)通過身體表面釋放多肽藥劑的方法。該方法包含(a)提供一種包含多肽和組氨酸化合物的組合物，其中組氨酸化合物以足以降低多肽自結(jié)合趨向的量存在于該組合物中；和(b)利用電轉(zhuǎn)運(yùn)通過身體表面釋放該組合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種利用電轉(zhuǎn)運(yùn)通過身體表面釋放人胰島素化合物的方法。該方法包含(a)提供一種包含胰島素化合物和約pH7-約pH8下的組氨酸化合物的組合物，其中組氨酸化合物的濃度為約10毫摩爾濃度至約250毫摩爾濃度；和(b)利用電轉(zhuǎn)運(yùn)通過身體表面釋放該組合物。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種利用被動經(jīng)皮釋放通過身體表面給藥人胰島素化合物的方法。該方法包含(a)提供一種包含所述胰島素化合物和組氨酸化合物的組合物，其中所述組氨酸化合物以足以降低所述胰島素自結(jié)合趨向的量存在于所述組合物中；和(b)利用被動經(jīng)皮釋放通過身體表面給藥所述組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的公開可容易地實(shí)施本發(fā)明的這些以及其他實(shí)施方案。附圖的簡要描述圖1顯示了在pH7．5下組氨酸濃度升高對每六聚體鍵合兩個鋅的野生型人胰島素的溶解性的影響。圖2是可用于本發(fā)明的一種代表性電轉(zhuǎn)運(yùn)藥物釋放設(shè)備的圖解圖。圖3是可用于本發(fā)明的一種代表性被動經(jīng)皮藥物釋放設(shè)備的橫斷面圖。圖4是可用于本發(fā)明的另一種被動經(jīng)皮藥物釋放設(shè)備的橫斷面圖。圖5是利用來自實(shí)施例中表Ⅲ的240mM組氨酸的數(shù)據(jù)所作的、無鋅LysB28proB29人胰島素的平均分子量作為胰島素濃度的函數(shù)圖。圖6是利用來自實(shí)施例中表Ⅲ的0mM組氨酸的數(shù)據(jù)所作的、無鋅LysB28ProB29人胰島素的平均分子量作為胰島素濃度的函數(shù)圖。圖7是利用來自實(shí)施例中表Ⅳ的240mM組氨酸的數(shù)據(jù)所作的、無鋅野生型人胰島素的平均分子量作為胰島素濃度的函數(shù)圖。圖8是利用來自實(shí)施例中表Ⅳ的0mM組氨酸的數(shù)據(jù)所作的、無鋅野生型人胰島素的平均分子量作為胰島素濃度的函數(shù)圖。發(fā)明詳述除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域中公知的常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)、電化學(xué)和生物化學(xué)方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。參見，例如T．E．Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子特性(W．H．FreemanandCompany，1993)；A．L．Lehninger，生物化學(xué)(WorthPublishers，Inc．，1975)；J．S．Newman，電化學(xué)系統(tǒng)(PrenticeHall，1973)；和A．J．Bard與L．R．Faulkner，電化學(xué)方法、基礎(chǔ)與應(yīng)用(JohnWiley＆Sons，1980)。必須注意的是，在本說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的不定和指定單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)的指示物，除非在文章中另有清楚的說明。因此，例如，“一種多肽”包括兩種或多種多肽的混合物，等等。本文中使用下列氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly(G)組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser(S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)纈氨酸Val(V)Ⅰ．定義在描述本發(fā)明時將使用下列術(shù)語，并且這些術(shù)語的定義如下。術(shù)語“多肽”、“多肽藥劑”和“多肽藥物”在本文中可交換使用，代表氨基酸殘基的任何生物活性聚合物。這些術(shù)語包括肽、寡肽、二聚體、多聚體等。這樣的多肽可以是天然來源的，或者可以通過合成或重組產(chǎn)生。這些術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿峄?。本文中定義的多肽藥物或藥劑一般由上面所列20種天然氨基酸中的一種或多種組成，并且還可包括數(shù)種已知氨基酸類似物中的任何種類，這些氨基酸類似物可以是天然產(chǎn)生的，也可以是合成的類似物，例如但不限于高異亮氨酸，2-(亞甲基環(huán)丙基)甘氨酸，S-甲基半胱氨酸，S-(丙烯基)半胱氨酸，高絲氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，高精氨酸，3-(3-羧基苯基)丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸，含羞草氨酸，2-哌啶酸，4-甲基谷氨酸，刀豆氨酸，2，3-二氨基丙酸等。多肽還可以中性或鹽形式存在，例如，酸加成鹽(與類似多肽的游離氨基形成的)，它們是與諸如鹽酸或磷酸等無機(jī)酸形成的，或者是與諸如乙酸、琥珀酸、馬來酸、酒石酸、扁桃酸等有機(jī)酸形成的。從游離羧基形成的鹽還可以是從無機(jī)堿形成的，所述無機(jī)堿是諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，也可以是從諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸等有機(jī)堿形成的。下文中將列出本發(fā)明中可使用的多肽藥劑的實(shí)例。本文中所用的術(shù)語“胰島素化合物”是指具有與天然胰島素或胰島素原相似或相同分子結(jié)構(gòu)的化合物，包括具有與天然胰島素或胰島素原相似或相同的三級構(gòu)象的分子，并且它們保持了胰島素活性，即調(diào)節(jié)血糖水平的能力。這樣的化合物可以包括相對于天然分子的氨基酸添加、取代和缺失，只要這些修飾不破壞胰島素活性即可。具有相對于天然胰島素的氨基酸取代的胰島素化合物的實(shí)例包括LysB28ProB29人胰島素和AspB28人胰島素。另外，出于本發(fā)明的目的，胰島素化合物還可以從任何哺乳動物來源產(chǎn)生，諸如人、牛、犬、馬、羊、豬、鯨魚等。胰島素化合物可以直接從來源有機(jī)體的胰腺提純，或者可以通過重組或合成產(chǎn)生。參見，例如Brange，J．，胰島素的蓋侖制劑，胰島素和胰島素制劑的物理化學(xué)和藥學(xué)方面(Springer-Verlag)中的有關(guān)得到胰島素的各種方法。此外，本文中使用的術(shù)語“胰島素化合物”表示有或沒有結(jié)合金屬的胰島素化合物。關(guān)于這一點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)金屬，諸如鋅和鈣，可延長胰島素的活性并提高分子的物理穩(wěn)定性。因此，用于本發(fā)明方法的胰島素化合物非限制性地包括無金屬的胰島素，以及與適宜金屬結(jié)合的胰島素，包括但不限于具有從約2Zn2+分子／六聚體到約4Zn2+分子／六聚體的胰島素。參見，例如美國專利4，476，118中對這種化合物以及它們的制備方法的描述。下面將更充分地描述本發(fā)明所用的胰島素化合物的其他實(shí)例。本文中所用的術(shù)語“組氨酸化合物”是指氨基酸L-His，以及如下所定義保留了減小所給多肽形成低聚物的能力的L-His的氨基酸類似物。這樣的類似物非限制性地包括含有His的二肽和三肽，諸如但不限于His-Gly，Gly-His，Ala-His，3-甲基-His，1-甲基-His，肌肽，His-Ser和His-Ala。當(dāng)組氨酸化合物的存在使得多肽自結(jié)合生成低聚物如四聚體、六聚體、疊式六聚體和其他聚合物的現(xiàn)象被阻止(例如，低聚物的形成至少被部分阻止)或逆轉(zhuǎn)(例如，已聚集的多肽被離解)時，組氨酸化合物即是“減少了所給多肽的低聚物的形成”。組氨酸化合物減少低聚物形成的能力可以通過評定在所討論的組氨酸化合物存在或不存在時低聚物質(zhì)的存在情況來確定。這種形成可以使用分析超速離心來確定(參見，例如現(xiàn)代分析超速離心，Schuster和Laue編輯，1994，Birkh@user；和生物化學(xué)與聚合物科學(xué)中的分析超速離心，Harding，Rowe和Horton編輯，1992年，TheRoyalSocietyofChemistry)，諸如實(shí)施例中描述的沉降平衡研究，分光光度測定(參見，例如Ogiso等，生物藥理學(xué)通報(1996)191049-1054)，滲透壓測定法，凝膠過濾等。有關(guān)這些方法的描述，參見例如Valdes和Ackers，酶學(xué)方法學(xué)，第6l卷(酶結(jié)構(gòu)，H部分，Hirs和Timasheff編輯)AcademicPress，1979，125-142頁。術(shù)語“被動經(jīng)皮釋放”是指在沒有應(yīng)用電動勢的幫助下，一種或多種將經(jīng)系統(tǒng)循環(huán)分布的藥學(xué)活性多肽藥劑通過身體表面(例如皮膚)的釋放。被動經(jīng)皮釋放可以使用許多手段完成，非限制性地包括直接應(yīng)用于皮膚、經(jīng)皮貼片、提供控制釋放的膜調(diào)節(jié)系統(tǒng)、粘附型擴(kuò)散控制系統(tǒng)、基質(zhì)分散型系統(tǒng)和微量貯器系統(tǒng)。這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的，并且在Remington藥劑學(xué)與實(shí)踐(MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995)中進(jìn)行了詳細(xì)討論。可以使用滲透增強(qiáng)劑來促進(jìn)通過皮膚的吸收。這種滲透增強(qiáng)劑包括溶劑諸如水，包括甲醇、乙醇、2-丙醇等的醇，烷基甲基亞砜，吡咯烷酮，月桂氮酮(1aurocapram)，丙酮，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，四氫呋喃(tetrahydrofurfuryl)；表面活性劑；和諸如脲、N，N-二乙基-間甲苯甲酰胺等化學(xué)制劑。本文中所用的術(shù)語“電轉(zhuǎn)運(yùn)”、“離子電滲療法”和“離子電滲”是指利用對含藥劑貯器的施加電動勢將一種或多種藥學(xué)活性多肽藥劑通過身體表面(例如皮膚)釋放．該藥劑可以通過電遷移、電穿孔、電滲透或其任意組合釋放。電滲透也被稱作電流體運(yùn)動、電對流和電誘導(dǎo)的滲透。一般說來，物質(zhì)電滲透到組織中導(dǎo)致含有該物質(zhì)的溶劑遷移，這是將電動勢施加到治療物質(zhì)貯器的結(jié)果，即，通過其他離子物質(zhì)的電遷移誘導(dǎo)溶劑流動。在電轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，皮膚可能發(fā)生某些改變或變化，諸如在皮膚上形成瞬變的小孔，也稱作“電穿孔”。通過改變或變化身體表面(例如，在皮膚上形成小孔)而增強(qiáng)的物質(zhì)的任何電協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)也包括在本文所用的術(shù)語“電轉(zhuǎn)運(yùn)”內(nèi)。因此，本文中使用的術(shù)語“電轉(zhuǎn)運(yùn)”、“離子電滲療法”和“離子電滲”是指(1)帶電荷的藥劑通過電遷移釋放，(2)不帶電荷的藥劑通過電滲透過程釋放，(3)帶電荷或不帶電荷的藥劑通過電穿孔釋放，(4)帶電荷的藥劑通過電遷移和電滲透相結(jié)合的方法釋放，和／或(5)帶電荷和不帶電荷的藥劑的混合物通過電遷移和電滲透相結(jié)合的方法釋放。利用標(biāo)準(zhǔn)測量方法測定，當(dāng)通過身體表面(例如皮膚或粘膜)的多肽電轉(zhuǎn)運(yùn)通量在組氨酸化合物的存在下與不存在組氨酸化合物時的電轉(zhuǎn)運(yùn)通量相比增加了時，多肽顯示“增強(qiáng)的電轉(zhuǎn)運(yùn)”。例如，經(jīng)皮電轉(zhuǎn)運(yùn)通量可以使用本領(lǐng)域中公知的許多體內(nèi)或體外方法評定。體外方法包括在電轉(zhuǎn)運(yùn)通量室的供體和受體區(qū)室之間夾緊適宜動物的一塊皮膚(例如，人尸皮膚)，使該皮膚塊的角質(zhì)層側(cè)面向供體區(qū)室。使欲釋放的含有藥物的溶液或凝膠與角質(zhì)層接觸，并向各位于區(qū)室之一中的兩電極施加電流。通過在受體區(qū)室中對藥物的量采樣來計算經(jīng)皮藥物通量。用于優(yōu)化經(jīng)皮電轉(zhuǎn)運(yùn)藥物釋放的兩種成功模型是Riviere的分離的豬皮膚瓣模型(Heit等，藥物科學(xué)雜，志(1993)82240-243)，和使用無毛嚙齒動物或豚鼠的分離的無毛皮膚。參見Hadzija等，藥物與藥理學(xué)雜志(1992)44387-390。還參見，例如Ogiso等，生物藥理學(xué)通報(1996)191049-1054，其中有關(guān)評估胰島素經(jīng)皮吸收方法的描述。Ⅱ．實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方式本發(fā)明涉及使用組氨酸化合物來減少多肽分子的自結(jié)合，由此與未經(jīng)處理的多肽的釋放相比增強(qiáng)多肽分子的經(jīng)皮釋放。因此該方法可提高大量物質(zhì)經(jīng)皮釋放的效率，并使原本不適合這種釋放的分子可以經(jīng)皮釋放。另外，該方法提高了如此處理過的多肽藥劑的溶解性，并減小了可能因內(nèi)源性物質(zhì)的聚集而發(fā)生免疫反應(yīng)的可能性。本發(fā)明可用于各種各樣的具有聚集趨向的蛋白質(zhì)和多肽藥劑，諸如許多來源于真核生物、原核生物和病毒的多肽，以及合成肽。這樣的多肽非限制性地包括抗生素和抗病毒劑肽類藥物，抗腫瘤藥，免疫調(diào)節(jié)劑，肽激素諸如胰島素、胰島素原、生長激素、GHRH、LHRH、EGF、抑生長素、SNX-111、BNP、促胰島素(insulinotropin)、ANP和糖蛋白激素諸如FSH、LH、PSH和hCG。本發(fā)明已使用胰島素和胰島素類似物進(jìn)行例示，但并不限于胰島素化合物。選擇胰島素來說明本發(fā)明是基于其具有自結(jié)合成六聚體結(jié)構(gòu)和稱之為“疊式六聚體”的聚合物結(jié)構(gòu)的趨向。這種結(jié)合抑制了該多肽的經(jīng)皮釋放并可在釋放部位引起刺激。本發(fā)明所用的胰島素化合物的實(shí)例包括任何商業(yè)上可獲得的胰島素，諸如來自Sigma，st．Louis，M0的重組人胰島素，它們配制成鋅胰島素的中性溶液或懸液。這種胰島素制劑中每六聚體結(jié)合最少兩個鋅離子，并且胰島素濃度為約0．2至約3．0mM(1mgmL-1-18mgmL-1)。不過，本文中也可使用包括高達(dá)約17mM胰島素的更高濃度胰島素的胰島素制劑。本發(fā)明方法中也可使用沒有金屬如鋅的胰島素，濃度可以在約0．1-30mM范圍內(nèi)。作為本文中的胰島素化合物使用的胰島素類似物包括商業(yè)上可獲得的人胰島素類似物，諸如LysB28和ProB29胰島素，可從Lilly(Indianap01is，IN)公司作為Humalog胰島素lispro注射劑得到，在實(shí)施例中有進(jìn)一步描述；含有精蛋白的胰島素化合物，諸如NPH(NeutralProtamineHagedorn)和中性精蛋白鋅胰島素(可從多個制造商處獲得)；和慢胰島素及兩相胰島素(可從多個制造商處獲得)。參見，例如Remington藥劑學(xué)與實(shí)踐，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年中有關(guān)這些以及其他胰島素化合物的描述。本文中可使用的其他胰島素類似物包括但不限于諸如Marki等在生理學(xué)與化學(xué)雜志(1979)3601619-1632中描述的那些類似物，它們在A鏈的2、5、6、7、8和11位氨基酸以及B鏈的5、7、13和16位氨基酸上有取代；硫酸化胰島素，諸如Albisser等在美國藥典約定，Rockyille，MD(Gueriguian等編輯)，84-95頁中描述的那些；脫P(yáng)he胰島素(B鏈的N-末端氨基酸刪除)；還缺失某些氨基酸的胰島素類似物，諸如缺失PheB24或PheB25(Balschmidt等的美國專利5，164，366)；具有氨基酸取代、特別是在B9-B12區(qū)和B26-B28位上有氨基酸取代的胰島素類似物，其中取代天然氨基酸的殘基是更親水的，并且一般是Asp，Glu，Ser，Thr，His和Ile(1987年3月18日公開的歐洲專利申請214，826B1)；具有被Asp和Glu殘基取代的選定氨基酸殘基的人胰島素類似物(1992年8月6日公開的國際專利申請WO92／12999)，等等。本發(fā)明中可使用的組氨酸化合物包括L-His及其類似物，諸如但不限于含有His的二肽和三肽，諸如His-Gly，Gly-His，Ala-His，3甲基-His，1甲基-His，L-肌肽(也叫做β-Ala-His)，His-Ser和His-Ala。適宜組氨酸化合物的選擇在本領(lǐng)域中是公知的，大半根據(jù)所討論的特定多肽來確定。組氨酸化合物一般將在其等電點(diǎn)下存在，并且濃度為約1mM至330mM，更優(yōu)選約10mM-約250mM，最優(yōu)選約25mM-約250mM。最佳組氨酸濃度取決于許多因素，包括胰島素濃度、其他鹽(例如NaCl)的濃度、是否有鋅存在、是否存在防腐劑、多肽形成低聚物的趨向，等等。一般說來，組氨酸的濃度至少為約10mM。蛋白質(zhì)制劑領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可以容易地針對在特定應(yīng)用或制劑中所用的特定變量(例如，胰島素濃度、鹽濃度、是否存在鋅、有或沒有防腐劑)確定出最佳組氨酸濃度。多肽將以治療有效量存在，也就是足以達(dá)到所需治療結(jié)果的量。所需的精確量將根據(jù)受治療者的不同而變化，取決于受治療者的種類、年齡和一般狀況，所治療疾病的嚴(yán)重程度，以及有關(guān)系的特定多肽藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用例如標(biāo)準(zhǔn)劑量應(yīng)答曲線等容易地確定治療有效劑量。例如，如果多肽是胰島素，它一般將以約0．1-約30mM的濃度存在，更優(yōu)選為0．2-約20mM濃度，最優(yōu)選為約0．3-約17mM濃度，該濃度取決于所用的具體胰島素化合物以及分子中是否包括結(jié)合鋅。當(dāng)L-His與商業(yè)上可獲得的人胰島素(一般包括六聚體和疊式六聚體形式的胰島素)一起使用時，胰島素通常將以約0．2mM-約17mM(1mgmL-1-100mgmL-1)的濃度存在，而L-His以約25-250mM的濃度存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明方法中使用的胰島素和L-His的合適用量。本發(fā)明中可使用的多肽藥物可以是帶負(fù)電荷的、帶正電荷的、或者是中性的，其選擇除了其他因素以外將取決于所用的特定組氨酸化合物，以及所需pH。這些參數(shù)的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，當(dāng)L-His用作組氨酸化合物且該組合物的pH為7-8時，胰島素化合物將是帶負(fù)電荷的。一般而言，最終溶液的pH值將在約pH6至約pH8．5范圍內(nèi)，更優(yōu)選為pH7-約pH8。不過，溶液的pH值也可以根據(jù)該方法中使用的特定多肽和組氨酸化合物而改變。多肽和組氨酸化合物一般存在于諸如水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等可藥用賦形劑中，由此形成溶液或懸液。如果需要，將被給藥的藥物組合物中還可以含有少量無毒輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑、pH緩沖劑等，例如乙酸鈉、單月桂酸脫水山梨糖醇酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯等。適宜賦形劑和添加劑的選擇多半根據(jù)所用的多肽和組氨酸化合物來確定。有關(guān)多肽制劑的討論，參見，例如Remington藥劑學(xué)與實(shí)踐，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年。對于胰島素制劑，這樣的物質(zhì)非限制性地包括防腐劑，諸如對羥基苯甲酸甲酯和酚類(間甲酚)；等滲劑，諸如甘油或鹽，包括但不限于NaCl(一般濃度為約1至約100mMNaCl)；以及其他添加劑和緩沖劑，諸如乙酸鈉，NaPO4，等等。有關(guān)胰島素制劑的討論，參見，例如Brange，J．，膜島素的穩(wěn)定性(KluwerAcademicPublishers)；Brange，J．，膜島素的蓋侖制劑，胰島素和胰島素制劑的物理化學(xué)和藥學(xué)方面(Springer-Verlag)；以及Remington藥劑學(xué)與實(shí)踐，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年。一旦制備了預(yù)期的帶有組氨酸的多肽制劑，就可以使用數(shù)種經(jīng)皮藥物釋放系統(tǒng)中的任何一種將其釋放到受治療者體內(nèi)，并且釋放不限于使用一種特定系統(tǒng)。在例如Myers等的美國專利5，312，326中、Theeuwes等的美國專利5，080，646中、Gyory等的美國專利5，387，189中、和Gyory等的美國專利5，169，383中描述了電轉(zhuǎn)運(yùn)藥物釋放系統(tǒng)的實(shí)例，這些文獻(xiàn)公開的內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。圖2說明了一種可以與本發(fā)明方法聯(lián)合使用的代表性電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放設(shè)備。設(shè)備10包含一個上殼16，一個電路板組件18，一個下殼20，陽電極22，陰電極24，陽極貯器26，陰極貯器28和皮膚相容性粘合劑30。上殼16具有幫助設(shè)備10保持在患者皮膚上的側(cè)翼15。上殼16優(yōu)選由可注射模壓的彈性體(例如乙烯乙酸乙烯酯)組成。印制電路板組件18包括一個與分立元器件40和電池32連結(jié)的集成電路19。電路板組件18通過兩個穿過開口13a和13b的小桿(圖2中未顯示)與上殼16相連，將這兩個小桿的末端加熱／熔化，以將電路板組件18熱力定樁到上殼16上。下殼20利用粘合劑30與上殼16相連，粘合劑30的上表面34與下殼20和上殼16包括側(cè)翼15的底表面粘合。在電路板組件18的下面(部分)顯示出的是鈕扣式電池32。也可以使用其他類型的電池為設(shè)備10提供動力。設(shè)備10一般由電池32，電子回路19、40，電極22、24，和藥物／化合物貯器26、28組成，它們共同集合成一個獨(dú)立單元。電路板組件18的輸出(圖2中未顯示)通過下殼20上形成的凹窩25、25，上的開口23、23’與電極24和22電接觸，是利用電傳導(dǎo)性粘合帶42，42’實(shí)現(xiàn)的。電極22和24依次與藥物貯器26和28的頂側(cè)44，44直接機(jī)械和電接觸。藥物貯器26，28的底側(cè)46’，46通過粘合劑30中的開口29’，29與患者的皮膚接觸。設(shè)備10可選地具有使患者能通過電轉(zhuǎn)運(yùn)自我給予一定劑量藥物的特性。壓下按鈕開關(guān)12，電路板組件18上的電回路將預(yù)定的DC電流輸送到電極／貯器22、26和24、28達(dá)預(yù)定長度的釋放期。按鈕開關(guān)12方便地位于設(shè)備10的頂側(cè)，并容易通過衣服啟動。優(yōu)選在短時間例如3秒鐘內(nèi)雙壓按鈕開關(guān)12以激活設(shè)備釋放藥物，由此減小設(shè)備10意外啟動的可能性。優(yōu)選的是，該設(shè)備利用LED14開始發(fā)光和／或發(fā)出可聽得見的聲音信號形式例如“報警器”傳送給使用者一個可以看見和／或可以聽見的確認(rèn)藥物釋放間隔開始的信號。藥物通過電轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)患者的皮膚，例如在手臂上，在預(yù)定的釋放間隔內(nèi)釋放。陽電極22優(yōu)選由銀組成，陰電極24優(yōu)選由氯化銀組成。貯器26和28均優(yōu)選由聚合物水凝膠材料組成。電極22，24和貯器26，28保持在下殼20上的凹窩25’，25中。按鈕開關(guān)12、電路板組件18上的電子回路和電池32被粘合性地“密閉”在上殼16和下殼20之間。上殼16優(yōu)選由橡膠或其他彈性材料組成。下殼20優(yōu)選由可容易地模壓成凹窩25，25’并剪切形成開口23，23’的塑料或彈性片材料(例如聚乙烯)組成。所裝配的設(shè)備10優(yōu)選是耐水的(即，防止飛濺的)，最優(yōu)選是防水的。該系統(tǒng)具有容易與身體一致的低輪廓，由此允許在穿用部位及其附近自由移動。貯器26和28位于設(shè)備10的與皮膚接觸的一側(cè)并分離開足夠的距離，以防止在正常的操作和使用過程中發(fā)生意外的電短路。設(shè)備10利用圓周形粘合劑30與患者的身體表面(例如皮膚)附著，該粘合劑30具有上側(cè)34和與身體接觸的一側(cè)36。粘附側(cè)36具有粘附性能，可確保設(shè)備10在使用者正?；顒舆^程中保持在身體的適當(dāng)位置上，也允許在預(yù)定的穿用期(例如24小時)后合理地移開。粘合劑上側(cè)34附著于下殼20，并保持下殼20與上殼16粘合。貯器26和28一般包含凝膠基質(zhì)，藥物溶液均勻分散于至少貯器26和28之一中?？梢允褂迷诖蠹s1×10-4M-1．0M范圍內(nèi)或更大濃度的藥物，在該范圍較低部分內(nèi)的藥物濃度是優(yōu)選的。凝膠基質(zhì)的合適聚合物可以實(shí)質(zhì)上包含任何非離子型合成的和／或天然產(chǎn)生的聚合物材料。當(dāng)活性劑是極性的和／或能離子化時，優(yōu)選有極性特性，以增強(qiáng)藥劑的溶解性?？蛇x地，該凝膠基質(zhì)將是可水膨脹的。合適的合成聚合物的實(shí)例包括但不限于聚(丙烯酰胺)，聚(丙烯酸2-羥乙基酯)，聚(丙烯酸2-羥丙基酯)，聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)，聚(正羥甲基丙烯酰胺)，聚(雙丙酮丙烯酰胺)，聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)，聚(乙烯醇)和聚(烯丙醇)。羥基官能縮聚物(即，聚酯，聚碳酸酯，聚氨酯)也是合適的極性合成聚合物的例子。適合用作凝膠基質(zhì)的極性天然產(chǎn)聚合物(或其衍生物)的例子是纖維素醚，甲基纖維素醚，纖維素和羥基化纖維素，甲基纖維素和羥基化甲基纖維素，樹膠諸如瓜爾膠，槐樹膠，刺梧桐樹膠，黃原膠，明膠，及其衍生物。離子聚合物也可用于基質(zhì)，只要可獲得的抗衡離子是藥物離子或其他與活性劑帶相反電荷的離子。因此，本發(fā)明的多肽／組氨酸制劑將被加入到藥物貯器中，例如剛剛描述的凝膠基質(zhì)中，并使用可選地如上文中例舉的電轉(zhuǎn)運(yùn)藥物釋放系統(tǒng)對患者給藥?？梢杂迷S多方式加入藥物溶液，即，通過將溶液浸滲到貯器基質(zhì)中，通過在形成水凝膠之前將藥物溶液與基質(zhì)材料混合，或類似方法。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，可以用被動經(jīng)皮釋放來給藥本發(fā)明的多肽／組氨酸制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，本發(fā)明可以與各種各樣的被動經(jīng)皮釋放系統(tǒng)聯(lián)合使用，在這一點(diǎn)上本發(fā)明沒有限制。有關(guān)被動系統(tǒng)的例子可以參照，但不限于Campbell等的美國專利4，379，454，Gale等的美國專利4，588，580，Campbell等的美國專利4，832，953，Gale等的美國專利4，698，062，Campbell等的美國專利4，867，982，和Hunt等的美國專利5，268，209，其中所公開的任何一種系統(tǒng)都可用于本發(fā)明。圖3和圖4說明了被動經(jīng)皮釋放設(shè)備的兩個實(shí)例。在圖3中，被動經(jīng)皮釋放設(shè)備88包含一個貯器90，該貯器中含有將被經(jīng)皮釋放的制劑。貯器90優(yōu)選為其中含有分散的制劑的基質(zhì)形式。貯器90夾在一個襯墊層92和一個可選的速率控制膜94之間，藥劑可滲透襯墊層92。在圖3中，貯器90由足夠粘稠以維持其形狀的一種材料諸如聚合物形成。如果用較低粘性的材料形成貯器90，諸如用含水凝膠，則襯墊層92和速率控制膜94應(yīng)沿外周密封在一起以防止泄漏。位于膜94下的是皮膚穿孔設(shè)備2，在其面對皮膚的表面上具有連接介質(zhì)65，它通過設(shè)備2中的開口(未顯示)延伸，與膜94接觸。設(shè)備88利用圍繞設(shè)備2外周的接觸粘合層96并可選地通過前面所描述的任何一個實(shí)施方案中的錨定元件附著于身體表面。在大多數(shù)情況下，連接介質(zhì)65一開始就含有藥劑。在粘合層96的暴露表面上通常提供一個可剝離的釋放襯墊(未顯示)，并在將設(shè)備10應(yīng)用于身體表面之前將其除去。另一方面，如放大的圖4中所示，經(jīng)皮治療設(shè)備98可以利用一個有彈性的粘性覆蓋層100粘附到身體表面。設(shè)備98由一個含有藥劑的貯器90組成，該貯器優(yōu)選為其中含有分散的藥劑的基質(zhì)形式。連接介質(zhì)65通過開口8延伸，與貯器90接觸?；蛘?，貯器90中的基質(zhì)可以在一開始就通過開口8延伸到與連接介質(zhì)65接觸，或者貯器和連接介質(zhì)也可以是同一器件?？蓾B透的襯墊層102與貯器90的一個表面相鄰。粘性覆蓋層100使設(shè)備保持在身體表面上。粘性覆蓋層100可以與設(shè)備98的其他部分一起制造，或者以分離形式制造。對于某些制劑，粘性覆蓋層100可能比圖3中所示的接觸粘合層96優(yōu)選。例如，當(dāng)藥劑貯器中含有對接觸粘合層96的粘合性能有不利影響的物質(zhì)(例如油性表面活性劑)時就是這樣?？蓾B透的襯墊層102優(yōu)選稍大于貯器90，從而可以防止貯器90中的藥劑與覆蓋層100中的粘合劑發(fā)生不利的相互作用?？蛇x地，可以在貯器90的身體表面一側(cè)提供一個與圖3中的膜94相似的速率控制膜(圖4中未顯示)。設(shè)備98通常也提供一個可剝離的釋放襯墊(未顯示)，并在將設(shè)備98應(yīng)用于身體表面之前將其除去。貯器90的制劑可以是含水的或不含水的。該制劑設(shè)計成以所需通量釋放藥劑。含水制劑一般包含水和約1至約60重量％的親水聚合物作為膠凝劑，諸如羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥乙基甲基丙烯酸酯和隱形眼鏡中所用的聚合物。典型的非含水制劑由硅樹脂液、硅橡膠、烴類聚合物、聚異丁烯、橡膠或礦物油組成。含有礦物油的凝膠一般還含有1-2重量％的膠凝劑諸如膠態(tài)二氧化硅。其中帶有藥劑的貯器基質(zhì)應(yīng)當(dāng)是與所釋放的藥劑、吸收抑制劑(如果有的話)和它們的任何載體相容的。當(dāng)使用含水基系統(tǒng)時，貯器基質(zhì)優(yōu)選為親水聚合物(例如水凝膠)。當(dāng)使用非含水基系統(tǒng)時，貯器基質(zhì)優(yōu)選由疏水聚合物組成。合適的聚合物基質(zhì)是經(jīng)皮藥物釋放領(lǐng)域中公知的。當(dāng)需要恒定的藥劑釋放速率時，該藥劑以過飽和的濃度存在于基質(zhì)或載體中，超過的量是系統(tǒng)的藥劑釋放期的所需長度的函數(shù)。不過，藥劑也可以以低于飽和的濃度存在，只要多肽／組氨酸制劑和吸收抑制劑(如果有的話)是以足以減少或消除藥劑對皮膚的刺激的用量和給藥持續(xù)時間對相同身體表面部位連續(xù)和廣泛地給藥。除了藥劑以外，連接介質(zhì)還可含有染料，顏料，惰性填充劑，滲透增強(qiáng)劑，賦形劑增粘劑，中性聚合物，表面活性劑，試劑，緩沖劑，增塑劑，和本領(lǐng)域中公知的藥物產(chǎn)品或經(jīng)皮釋放設(shè)備中的其他常規(guī)組分。存在于貯器中的藥劑的量和貯器的大小一般沒有限制，該量等于或大于釋放形式存在時可有效帶來所需的局部和／或系統(tǒng)生理學(xué)和／或藥理學(xué)作用的藥劑量。其中藥劑被釋放的優(yōu)選形式一般決定了要使用的釋放系統(tǒng)的類型，反之亦然。也就是說，通過擴(kuò)散釋放藥劑的被動系統(tǒng)或通過電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放藥劑的電力系統(tǒng)的選擇主要由藥劑的形式?jīng)Q定。例如，對于被動釋放系統(tǒng)，一般已認(rèn)識到當(dāng)藥劑通過角質(zhì)層擴(kuò)散時，藥劑優(yōu)選以其游離堿或酸形式釋放，而不是以水溶性鹽的形式釋放。另一方面，對于電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放設(shè)備，現(xiàn)已認(rèn)識到藥劑一般應(yīng)可溶于水。人們普遍認(rèn)為通過完整皮膚的被動和電轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)皮藥物釋放的通道是不同的，被動釋放通過皮膚的脂質(zhì)區(qū)(即，疏水區(qū))發(fā)生，而電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放通過親水通道或諸如與毛囊和汗腺有關(guān)的那些小孔發(fā)生。在穿透皮膚的情況下，預(yù)期會有通過生成的水性通道的實(shí)質(zhì)性被動流。在穿透皮膚的情況下，用于被動釋放的藥劑一般是親水的(例如，水溶性鹽形式)，而用于電轉(zhuǎn)運(yùn)釋放的藥劑優(yōu)選形式也是親水的(例如，水溶性鹽形式)。對于被動釋放，可以使用離子化藥劑(例如水溶性的)和非離子化藥劑(例如親水的)的混合物。在有關(guān)胰島素被動經(jīng)皮釋放的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，制劑將含有組氨酸緩沖液和無鋅且沒有防腐劑諸如間甲酚或苯酚的胰島素化合物，和自結(jié)合趨向降低了的野生型人胰島素或胰島素類似物，諸如人LysB28proB29胰島素類似物。這樣的制劑使以能更快速擴(kuò)散的低分子量形式存在的胰島素分子的比例增加到最大程度。該多肽／組氨酸制劑還可以使用滲透和壓力驅(qū)動系統(tǒng)釋放，所述系統(tǒng)通過由溶劑傳送的連接流動釋放藥劑。在這樣的系統(tǒng)中，藥劑優(yōu)選在該載體溶劑中具有足夠的溶解性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明可以與各種各樣的滲透和壓力驅(qū)動系統(tǒng)聯(lián)合使用，在這一點(diǎn)上本發(fā)明不限于特定的設(shè)備。有關(guān)滲透和壓力驅(qū)動系統(tǒng)的實(shí)例，可以參考以下文獻(xiàn)Eckenhoff的美國專利4，340，480，Theeuwes等的美國專利4，655，766，Eckenhoff的美國專利4，753，651，Gross等的美國專利5，279，544，Theeuwes的美國專利4，655，766，Gross等的美國專利5，242，406，和Eckenhoff的美國專利4，753，651，其中公開的每一種系統(tǒng)均可用于本發(fā)明。盡管本發(fā)明已結(jié)合其優(yōu)選的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解前面的描述以及后面的實(shí)施例是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。Ⅲ．實(shí)驗(yàn)材料人胰島素(通過在大腸桿菌中表達(dá)而制得)、β-乳球蛋白、L-組氨酸(堿)和絲氨酰胺(Serinamide)從Sigma(St．Louis，M0)購得。Sigma胰島素制劑含有約0．4％Zn，相當(dāng)于約2個鋅原子／胰島素六聚體。Humalog(LysB28ProB29人胰島素類似物)以及Humlin(人胰島素注射劑)，二者均是重組DNA來源并由Lilly(Indianapolis，IN)制造，它們是從商業(yè)藥房中購得的。L—組氨酸(堿)從J．T．Baker(Phillipsburg，NJ)以及Sigma(St．Louis，MO)得到。冰醋酸從J．T．Baker(Phillipsburg，NJ)得到。鹽酸從Mallinckrodt(Paris，KY)購得。氯化鈉(NaCl)由Aldrich(St．Louis，MO)提供。溶菌酶從WorthingtonBiochemical公司(FreeholdNJ)得到。L-甘氨?；?L-組氨酸二肽由BachemBioscience公司(KingofPrussia，PA)合成。方法無鋅的人胰島素的制備可從商業(yè)來源獲得的所有人胰島素含有約2個結(jié)合鋅分子／胰島素六聚體。與野生型人胰島素(可從Sigma獲得或作為HumulinR獲得)和LysB28ProB29類似物(可作為Humalog獲得)結(jié)合的鋅可以通過對10mM乙酸在4℃下長時間透析而除去。在使用HumlinR和Humalog的情況下，可注射胰島素的pH在透析之前首先使用冰醋酸和1N鹽酸從中性pH調(diào)節(jié)到pH3．5。然后將透析后的胰島素冷凍干燥。對冷凍干燥物質(zhì)的鋅分析表明殘余的鋅少于0．03鋅／六聚體。L-組氨酸和L-甘氨?；?L-組氨酸緩沖液的制備用Milli-Q水(Millipore，Medford，MA)來制備所有緩沖液。這些緩沖液在使用前通過0．22μm醋酸纖維素酯膜過濾。252mML-組氨酸溶液的pH值在22℃下約為pH7．62±0．1，1ML-甘氨?；?L-組氨酸緩沖液的pH值在22℃下約為pH7．68±0．1。絲氨酰胺緩沖液的制備制備100mM絲氨酰胺緩沖液母液并將pH調(diào)節(jié)至7．5+0．1。存在于L-組氨酸和L-甘氨?；?L-組氨酸緩沖液中的胰島素的制備制備用分析超速離心進(jìn)行的每個實(shí)驗(yàn)所用的胰島素母液。母液的濃度通過將等分試樣稀釋到6M鹽酸胍(Pierce，Rockford，IL)中并用分光光度計(Aviv，14DS型，Lakewood，NJ)檢驗(yàn)其吸光度而確定。在使用276nm處摩爾消光系數(shù)1．109mLmg-1cm-1確定樣品的濃度之前修正樣品的光散射吸光度。對于含有組氨酸的制劑，胰島素母液用250mM或330mML-組氨酸制成。對于L-甘氨?；?L-組氨酸，胰島素母液用260mM和／或1ML-甘氨?；?L-組氨酸緩沖液制備。一般說來，對于含有約2鋅／六聚體的野生型胰島素，用L-組氨酸或L-甘氨?；?L-組氨酸制備不超過10mM(約60mgmL-1)的母液。對于沒有組氨酸的制劑，用10mMNaCl制備含有7．1mgmL-12鋅／六聚體的野生型胰島素的母液，用NaOH將其調(diào)節(jié)至pH7．5。在無鋅的野生型和／或LysB28proB29人胰島素類似物的情況下，可以用0．1MNaCl，pH7．5和／或250mM組氨酸，0．1MNaCl，pH7．5制備不超過17mM(約100mgmL-1)的母液。在22℃下，在1M甘氨酰-組氨酸緩沖液中的胰島素母液的pH約為7．68±0．1，在250mM組氨酸中為7．62±0．1。在進(jìn)行分析超速離心操作之前，用有或沒有適量NaCl的組氨酸或甘氨酰-組氨酸緩沖液稀釋該胰島素母液，以使胰島素的濃度在最低2mgmL-1(0．35mM)到最高40mgmL-1(7mM)之間變化。胰島素溶解于其中的L-組氨酸緩沖液的終濃度在10mM至252mM之間變化。對于L-甘氨?；?L-組氨酸，存在于250和750mM緩沖液中的含有2鋅／六聚體的野生型胰島素制劑用超速離心機(jī)進(jìn)行檢驗(yàn)。此外，向一些存在于L-組氨酸或L-甘氨?；?L-組氨酸緩沖液中的胰島素樣品中加入終濃度為50和100mM的氯化鈉。溶菌酶＆β-乳球蛋白的制備用含有0、100或250mML-組氨酸的0．15MNaCl制備溶菌酶溶液(15mgmL-1)。含有組氨酸的溶液在21℃下的pH為7．60±0．1；沒有L-組氨酸的溶菌酶溶液的pH用稀堿調(diào)節(jié)至相同pH。類似地，在0．15MNaCl中的β-乳球蛋白的pH用稀堿調(diào)節(jié)至與在250mML-組氨酸中的β-乳球蛋白的pH相同，為pH7．74±0．1。在分析超速離心機(jī)中的沉降平衡研究各種胰島素制劑的沉降平衡實(shí)驗(yàn)在32℃下使用分析型超速離心機(jī)(XL-A或XL-I型；Beckman，PaloAlto，CA)進(jìn)行。使用瑞利干涉光學(xué)和／或掃描UV／可見光學(xué)在不同轉(zhuǎn)速下得到所有樣品的沉降平衡數(shù)據(jù)。對于后者，在數(shù)個波長處檢測胰島素樣品的吸光度掃描，例如在248、288、291和295nm。在操作開始時，用設(shè)在上述波長的單色儀裝置得到的掃描數(shù)據(jù)估計摩爾消光系數(shù)值。用這些值來計算不同條件下胰島素的摩爾結(jié)合平衡常數(shù)。吸光度掃描中的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)記錄為徑向距離增加0．002cm時的10次掃描的平均值。對于干涉光學(xué)系統(tǒng)，使用675nm的光得到胰島素以及溶菌酶樣品的沉降平衡數(shù)據(jù)。在1cm路徑中1mgmL-1多肽溶液的條紋置換測定為2．77條紋(McMeekin等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(1962)7151-156；Doty和Geiduschek，393-460頁，在蛋白質(zhì)1A中，由Neurath和Bailey編輯，AcademicPress，NY(1943)；Perlmann和Longsworth，美國化學(xué)會會志(1948)702719-2724)。用該值來計算胰島素和溶菌酶樣品的摩爾結(jié)合常數(shù)。人胰島素的單體分子量測定為5796gmol-1，使用殘基微分比容的Cohn和Edsall值根據(jù)氨基酸組成計算出的微分比容為0．727mLg-1。在溶菌酶的情況下，單體的分子量測定為14315gmol-1，微分比容值為0．703mLg-1(Sophianopoulos等，生物化學(xué)雜志(1962)2371107)。對于β-乳球蛋白，在280nm處得到UV吸光度掃描數(shù)據(jù)，單體的分子量測定為18400gmol-1。后者的微分比容為0．747mLg-1(Kelly和Reithel，生物化學(xué)(1971)102639-2644)，用于計算摩爾結(jié)合常數(shù)的消光系數(shù)為0．97mLg-1cm-1(Wetlaufer和Lovrien，生物化學(xué)雜志(1964)243596)。所有蛋白質(zhì)在L-組氨酸的存在下的有效浮力分子量使用已占體積模型計算(Jacobsen等，生物化學(xué)(1996)3513173-13179)，其中BAM值簡單地設(shè)定為單體分子量乘以微分比容。L-組氨酸和L-甘氨?；M氨酸的微分比容測定為0．641mLg-1(370-381頁，蛋白質(zhì)、氨基酸和肽(1943)，Cohn和Edsall編輯，HafnerPublishing，N．Y．)。離心后，從干涉和吸光度掃描得到的數(shù)據(jù)用已知方法進(jìn)行分析，包括Shire等，生物化學(xué)(1991)307703-7711中的基于公式9的算法。所用的算法包括一種改進(jìn)方法，其中擬合參數(shù)用(BM1)1／2代替(B)1／2。此分析得到了使用者指定模型的結(jié)合常數(shù)的估計值。該模型可以是理想單體的(最簡單的模型)或者可以是與一種、兩種、三種或更多種特定大小的聚集體處于化學(xué)平衡的單體的。最可能的模型是將實(shí)驗(yàn)吸光度與理論吸光度之間差值的平方和減至最小的模型，即，差值的均方根最小的模型。實(shí)施例1L-組氨酸對胰島素溶解性極限的影響為了確定L-組氨酸對2鋅／六聚體野生型人胰島素的溶解性極限的影響，將不同濃度的胰島素與L-組氨酸混合。如圖1中所示，在緩沖液中使用L-組氨酸提高了含有胰島素的緩沖溶液的最大胰島素濃度。沒有L-組氨酸，在pH7．5，10mMNaCl和室溫下，帶有2鋅／六聚體的胰島素達(dá)到的最高濃度為7．1mgmL-1或1．2mM。有250mM組氨酸在其等電點(diǎn)下存在時，胰島素溶液的濃度高達(dá)16．5mM，表現(xiàn)出濃度升高了15倍。實(shí)施例2不存在NaCl時等電點(diǎn)下的L-組氨酸和L-甘氨?；?組氨酸對胰島素自結(jié)合的影響為了確定不存在NaCl時L-組氨酸和L-甘氨?；?組氨酸在其等電點(diǎn)對自結(jié)合的影響，如上所述進(jìn)行沉降平衡研究。如表1中所示，L-組氨酸濃度升高使得六聚合平衡常數(shù)降低。在pH7．5下，不存在任何組氨酸時，沉降平衡數(shù)據(jù)(在32℃和轉(zhuǎn)速為18K-48K下收集的)可以擬合二聚體六聚體結(jié)合模型，Ink2-6值為52．6。非理想系數(shù)B考慮因緩沖液的離子強(qiáng)度非常低而引起的非理想作用。假定存在單一分子量物質(zhì)，使用最簡單的模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到M平均／M1值為5．5，提示不存在任何組氨酸時胰島素聚集體的平均大小稍小于六聚體。在鋅的存在和中性pH下，3個胰島素二聚體裝配形成六聚體的觀察結(jié)果與公開的數(shù)據(jù)(Brange，胰島素的蓋侖制劑(1987)SpringerVerlag)一致。將在pH7．6±0．1、20-252mM組氨酸存在時在多種轉(zhuǎn)速下收集的沉降平衡數(shù)據(jù)擬合二聚體六聚體結(jié)合模型。隨著組氨酸的濃度從20mM升高至252mM，觀察到六聚合化平衡常數(shù)降低。用胰島素觀察組氨酸的作用，離心池中的胰島素的濃度從最低0．01mM(0．1mgmL-1)至最高13mM(75mgmL-1)。盡管事實(shí)表明組氨酸極大地提高了胰島素的溶解性(在250mMhis，pH7．5±0．1中，溶解性極限為16．5mM)，但在這些條件下并非所有聚集的胰島素都是二聚體和六聚體。在用超速離心機(jī)檢驗(yàn)的最高胰島素加載濃度(6mM)下也發(fā)現(xiàn)了多六聚體的聚集體。當(dāng)樣品在20krpm轉(zhuǎn)速下達(dá)到平衡時，僅有80％的最初加載到池中的胰島素保留在溶液中。剩余20％胰島素在池底部聚結(jié)成大的不溶的聚集體。粗略的計算顯示這些聚集體的平均分子量超過100000，相當(dāng)于約3個胰島素六聚體。甘氨酰-組氨酸是組氨酸類似物中的一種，檢測其對胰島素自結(jié)合的影響。在250mM時，甘氨酰-組氨酸也減小了胰島素形成六聚體的趨向，但不如組氨酸那么有效。利用單一物質(zhì)模型對使用干涉光學(xué)在50k轉(zhuǎn)速下獲得的沉降平衡進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在甘氨酰-組氨酸中胰島素的平均分子量是四聚體的分子量(表1)。作為對比，在252mM組氨酸(在超速離心機(jī)中檢驗(yàn)的最高濃度)下，胰島素的平均分子量是二聚體的分子量。用也調(diào)節(jié)至pH7．5±0．1的另一種緩沖液絲氨酰胺取代組氨酸沒能減小野生型胰島素在中性pH下發(fā)生自結(jié)合的能力。表Ⅰ．使用二聚體-六聚體結(jié)合模型進(jìn)行分析，在32℃和pH7．5±0．1下不存在氯化鈉時，各種緩沖液對野生型人胰島素(帶有2鋅／六聚體)的自結(jié)合的影響緩沖液I．S．Mavg／M1Ink2-6r．m．s．B沒有添加劑12．85．552．60．0061．8E-6絲氨酰胺1225．225．00．00801．7E-638mM組氨酸13．34．220．70．00805．5E-620mM組氨酸25．63．318．30．01447．7E-6113mM組氨酸36．32．314．20．006～0240mM組氨酸46．32．614．40．02352．0E-6252mMgly-his527．54．318．20．04647．9E-7250mMI．S．是緩沖液的離子強(qiáng)度，單位mMB(g-2Lmol)是非理想系數(shù)，基于胰島素二聚體計算r．m．s．是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論數(shù)據(jù)之間差值的均方根Mavg／M1是對于單一物質(zhì)非理想模型，沉降物質(zhì)的平均分子量除以胰島素單體的分子量Ink2-6是從三個二聚體形成六聚體時的結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)1對0．34mM胰島素樣品在18k，24k，28k，34k和48k轉(zhuǎn)速下于291nm檢測UV吸光度掃描得到的2對0．69mM胰島素樣品在15k，20k，25k和30k轉(zhuǎn)速下于291nm檢測UV吸光度掃描得到的3對0．35mM胰島素樣品在24k，28k，34k和48k轉(zhuǎn)速下于291nm檢測UV吸光度掃描得到的4從6mM胰島素樣品在50k轉(zhuǎn)速下的干涉光學(xué)得到的5從3和6mM胰島素樣品在50k轉(zhuǎn)速下的干涉光學(xué)得到的實(shí)施例3在NaCl的存在下L-組氨酸和L-甘氨?；?組氨酸在等電點(diǎn)對帶有2鋅／六聚體的野生型人胰島素自結(jié)合的影響為了確定存在NaCl時L-組氨酸和L-甘氨?；?組氨酸在其等電點(diǎn)對胰島素自結(jié)合的影響，如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)用氯化鈉使pH7．5樣品的離子強(qiáng)度增加至約100mM時，在沒有組氨酸緩沖液的情況下，野生型人胰島素大部分以六聚體存在。如表II中所示，當(dāng)胰島素樣品中組氨酸的濃度從50mM升高至226mM時，六聚合化平衡常數(shù)有適度的降低。該作用沒有不存在鹽時觀察到的(參見表I)那么顯著。在226mM，即在100mM離子強(qiáng)度下檢測的最高組氨酸濃度下，基于單一胰島素物質(zhì)的假設(shè)計算出的Mavg／M1值約為6。相反，不存在NaCl時，在pH7．6+0．1的252mM組氨酸中胰島素主要為二聚體。此外，在226mM組氨酸和100mMNaCl存在下，不論開始時加載的胰島素濃度如何，以等于或小于十二聚物的平均大小沉降的胰島素的終濃度為約2mM。其余胰島素樣品在20k轉(zhuǎn)速時聚結(jié)到池的底部。因此，在含有100mMNaCl的組氨酸緩沖液中形成極大聚集體的胰島素的百分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于沒有NaCl的組氨酸緩沖液中的百分?jǐn)?shù)值。在后者的情況下，產(chǎn)生大聚集體沉積的胰島素濃度范圍是約4．8mM。這些結(jié)果顯示，組氨酸對胰島素自結(jié)合的影響取決于介質(zhì)的離子環(huán)境。初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，從2個六聚體形成胰島素十二聚物的吉布斯自由能作為緩沖液離子強(qiáng)度的平方根的函數(shù)升高。在L-甘氨酰-L-組氨酸的情況下，向野生型人胰島素樣品中加入50mMNaCl(使總離子強(qiáng)度升高至77．5mM)得到的六聚合化平衡常數(shù)與在226mM組氨酸和100mMNaCl中對胰島素觀察到的結(jié)果接近(表Ⅱ)。組氨酸在其等電點(diǎn)是兩性離子，并且其對胰島素的作用似乎是特異性的。例如，如表Ⅱ中所示，在pH7．5±0．1下，在約100mM離子強(qiáng)度下，使用另一種兩性離子-?；撬釠]能降低胰島素的六聚合化平衡常數(shù)。表Ⅱ．使用二聚體-六聚體結(jié)合模型進(jìn)行分析，在32℃和pH7．5+0．1下，50和100mM氯化鈉存在時，L-組氨酸和L-甘氨?；?L-組氨酸對2鋅／六聚體的野生型人胰島素的自結(jié)合的影響50mMNaCl緩沖液I．S．Mavg／M1Ink2-6r．m．s．組氨酸1a564．814．30．009240mMgly-his277．54．416．70．087247mM100mMNaCl緩沖液I．S．Mavg／M1Ink2-6r．m．s．沒有添加劑31035．823．90．007?；撬?1035．824．60．010113mM組氨酸41044．821．10．00950mM組氨酸51064．520．70．012113mM組氨酸61054．419．60．007206mM組氨酸1b1066．415．60．009226mM1a對3mM和6mM胰島素樣品在20k和30k轉(zhuǎn)速下于295nm檢測吸光度掃描得到的1b用Ink6等鏈常數(shù)為4．24的二聚體-六聚體-等鏈(isodesmic)六聚體理想模型對3mM和6mM的胰島素樣品在20k和30k轉(zhuǎn)速下于295nm檢測吸光度掃描得到的2從3和6mM胰島素樣品在50k轉(zhuǎn)速下的干涉光學(xué)得到的3對0．35mM胰島素樣品在18k，24k，34k和48k轉(zhuǎn)速下于291nm檢測UV吸光度掃描得到的4對0．7mM胰島素樣品在15k，20k，25k，30k和40k轉(zhuǎn)速下于288nm檢測UV吸光度掃描得到的5對胰島素樣品在15k，20k，25k，30k和40k轉(zhuǎn)速下于288nm(0．35mM)和248nm(0．7mM)檢測UV吸光度掃描得到的6對0．35mM胰島素樣品在15k，20k，25k和30k轉(zhuǎn)速下于248nm檢測UV吸光度掃描得到的Ink6iso是形成等鏈六聚體的結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)實(shí)施例4在等電點(diǎn)下的L-組氨酸對野生型無鋅胰島素和無鋅LysPro胰島素類似物的自結(jié)合的影響如上所述，在32℃下，用XL-I分析型超速離心機(jī)，對天然的野生型人胰島素(無鋅，來自Sigma和HumulinR以及無鋅的LysB28ProB29胰島素類似物(從Lilly公司的Humalog精制)作為組氨酸(pH7．5)濃度升高的函數(shù)進(jìn)行沉降平衡研究。在多種轉(zhuǎn)速下獲得干涉數(shù)據(jù)，將其匯總，并使用擬合多種模型的非線性回歸進(jìn)行全面分析。在100mMNaCl，pH7．5的存在下，從都不含鋅的野生型和LysB28ProB29人胰島素獲得的數(shù)據(jù)均可以擬合含有單體、二聚體、六聚體和等鏈六聚體的模型。如表Ⅲ中所示，對于無鋅的LysPro類似物，Ink12值沒有隨組氨酸的濃度發(fā)生顯著改變，但I(xiàn)nk6iso顯示隨著組氨酸濃度的升高顯著降低。結(jié)果提示組氨酸對LysPro胰島素類似物的自結(jié)合性能有影響。表示蛋白質(zhì)聚集程度的簡潔方法是從結(jié)合平衡常數(shù)計算平均分子量。文獻(xiàn)中詳細(xì)描述了數(shù)種這樣的平均值(參見，例如“生物化學(xué)和聚合物科學(xué)中的分析超速離心”，S．E．Hardin，A．J．Rowe和J．C．Horton編，RoyalSocietyofChemistry，Cambridge，1992)。一種是Mn或稱數(shù)均分子量，定義為C總／∑(ci／Mi)，其中ci是分子量為Mi的第ⅰ種物質(zhì)的重量濃度。第二種平均值類型，Mw，叫做重均分子量，定義為∑ciMi／c總。不過也可定義更高的分子量平均值，諸如Mz，其中Mz=∑ciMi2／∑ciMi。圖5顯示了LysPro胰島素類似物在240mM組氨酸存在下的這三種平均值的濃度依賴性(從表Ⅲ中240mM組氨酸的InK12，InK26和InK6iso值計算)，而圖6顯示了不存在組氨酸時的類似圖形(從表Ⅲ中0mM組氨酸的InK值計算)。圖7顯示了在240mM組氨酸存在下無鋅野生型胰島素的類似圖形(從表IV中240mM組氨酸的InK12，InK26和InK6iso值計算)，而圖8顯示了不存在組氨酸時的類似圖形(從表Ⅳ中0mM組氨酸的InK值計算)。這些圖形證明，組氨酸的存在實(shí)質(zhì)上降低了胰島素的平均分子量，并且這種作用對于LysPro類似物更明顯。<tablesid="table1"num="001"><table>表ⅢLysB28proB29人胰島素類似物(無鋅)在100mMNaCl，pH7．5中，32℃下每種條件5種轉(zhuǎn)速(12，18，24，34，50k)得到干涉數(shù)據(jù)，將其匯總并全面分析。[his]In(K12)In(K26)In(K6iso)rms[胰島素]范圍06．5014．16．070．0491×10-5-9．0mM106．714．06．020．1121×10-5-7．3mM205．8814．25．850．2051×10-5-10．0mM406．014．15．660．1771×10-5-10．0mM806．7413．65．860．1711×10-5-11．0mM1606．5913．55．620．1711×10-5-10．6mM2406．7113．25．000．1511×10-5-11．2mM</table></tables>In(K6iso)=6．01-0．0037[組氨酸]，p=0．004In(K12)是從2個胰島素單體形成二聚體時的結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)In(K26)是從3個二聚體形成胰島素六聚體時的結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)In(K6iso)是形成疊式六聚體時的結(jié)合常數(shù)的自然對數(shù)每種條件下胰島素的加載濃度為4mM。在離心過程中，胰島素在整個離心池中重新分配。表中記錄的[胰島素]范圍反映了對于每種條件在各種轉(zhuǎn)速下觀察到的[胰島素]的范圍。<tablesid="table2"num="002"><table>表Ⅳ野生型人胰島素(無鋅)在100mMNaCl，pH7．5中，32℃下每種條件5種轉(zhuǎn)速(12，18，24，34，50k)得到干涉數(shù)據(jù)，將其匯總并全面分析。[his]In(K12)In(K26)In(K6iso)rms[胰島素]范圍08．818．77．240．0931×10-5-4．7mM1010．117．97．170．0691×10-5-4．5mM207．919．17．000．1021×10-5-4．8mM408．818．87．000．0851×10-5-4．6mM808．518．86．690．0651×10-5-4．2mM16010．018．07．050．0211×10-5-2．1mM2249．916．66．650．1251．5×10-5-15mM2408．518．56．580．0731×10-5-4．2mM</table></tables>In(K12)=9．06(均值)(s．e．m．=0．273)(對[組氨酸]沒有明顯依賴性)In(K6iso)=7．116-0．002[組氨酸]，p=0．02除了224mM組氨酸以外的每種條件下，胰島素加載濃度為2mM。在224mM組氨酸下，所報道的數(shù)據(jù)是通過將從1、3和6mM胰島素加載濃度下得到的3個數(shù)據(jù)合并后得到的。實(shí)施例5在其等電點(diǎn)時L-組氨酸對其他蛋白質(zhì)自結(jié)合的影響使用上述方法還研究了L-組氨酸對溶菌酶和β-乳球蛋白的自結(jié)合的影響。對溶菌酶和β-乳球蛋白已進(jìn)行了充分研究，它們在堿性pH下主要以單體-二聚體平衡存在(Kim等，化學(xué)評論(1977)77659-690)。用單體-二聚體-四聚體系統(tǒng)比用一個更簡單的單體-二聚體系統(tǒng)能更好地模擬在堿性pH下的溶菌酶沉降平衡數(shù)據(jù)(Holladay，博士論文(1973)Emory大學(xué))。沒有L-組氨酸的溶菌酶在4℃下的自結(jié)合行為通過對14k，18k和30krpm下的干涉條紋數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析來評定。表V中給出了結(jié)果。BeckmanXL-I系統(tǒng)的條紋測量中的預(yù)期干擾約為0．02-0．04條紋。用理想的單體-二聚體-四聚體(1-2-4)系統(tǒng)最好地描述了4℃下的數(shù)據(jù)。注意任何含有二聚體大小以上的聚集體的模型得到基本上相等的In(K12)估計值。既然有關(guān)L-組氨酸對溶菌酶二聚合的影響的這些結(jié)果(在下文中)沒有表現(xiàn)出模型依賴性，于是用理想的1-k2-4系統(tǒng)進(jìn)行模擬。包括第二維里系數(shù)在內(nèi)并沒有顯著降低差值的r．m．s．。等鏈Ⅰ型具有以相同結(jié)合常數(shù)存在的所有聚集體。Ⅱ型只有均等(even)聚集體存在。Ⅲ型具有與假定等鏈的隨后結(jié)合步驟不同的二聚合常數(shù)。Ⅳ型假定僅存在均等聚集體，并且二聚合常數(shù)與假定等鏈的隨后結(jié)合步驟不同。等鏈模型的公式是本領(lǐng)域中公知的，并已進(jìn)行了描述(Tang等，生物物理學(xué)與化學(xué)(1977)7121-139)。注意等鏈模型IV的In(K14)為17．9，接近于用1-2-4模型得到的估計值。對于所有等鏈模型來說，預(yù)計超過四聚體的聚集體的量非常小。表VI中給出了L-組氨酸對溶菌酶二聚合的影響。表VI中的結(jié)果是利用理想的1-2-4模型(單體-二聚體-四聚體)并對相差4krpm的兩種轉(zhuǎn)速進(jìn)行全面分析得到的。表Ⅶ中給出了L-組氨酸在三種溫度下對β-乳球蛋白二聚合的影響。對于這兩種蛋白質(zhì)來說，看起來溫度的升高使得二聚合平衡常數(shù)適度降低。有關(guān)此分析，隱含假定在L-組氨酸的存在下任何聚集體的有效浮力分子量是單體的有效浮力分子量的整數(shù)倍。這意味著任何聚集體的BAM范圍是單體的BAM范圍的整數(shù)倍。由于在現(xiàn)實(shí)中聚集體的整個形狀很可能與單體的形狀不太相同，因此有可能溶菌酶和β-乳球蛋白的二聚合常數(shù)的適度降低反映了“聚集體的浮力分子量是單體的浮力分子量的整數(shù)倍”這一假設(shè)是失敗的。不過必須注意In(K12)的返回值沒有表現(xiàn)出對單體浮力分子量的幾個百分點(diǎn)的變化敏感。表Ⅴ自結(jié)合模型的選擇對溶菌酶在150mMNaCl，pH7．6，4℃下的In(K12)的影響，來自對在14k，18k和30k轉(zhuǎn)速下得到的干涉數(shù)據(jù)的全面分析模型In(K12)In(K附加)差值r．m．s．1-26．728n．a(chǎn)．0．1141-2-45．43117．9(1-4)0．036非理想型1-2-45．43618．00．036等鏈Ⅰ型5．552n．a(chǎn)．0．048等鏈Ⅱ型5．582n．a(chǎn)．0．054等鏈Ⅲ型5．2475．7160．037等鏈Ⅳ型5．5775．9660．0411-2表示其中單體與二聚體平衡存在的模型1-2-4表示其中單體與二聚體和四聚體平衡存在的模型InK1-2是從2個單體形成一個二聚體的平衡常數(shù)InK1-4是從4個單體形成一個四聚體的平衡常數(shù)表VI使用3mm中心板(centerpiece)在多種轉(zhuǎn)速下測定L—組氨酸對溶菌酶在pH7．6，150mMNaCl下的自結(jié)合的影響使干涉數(shù)據(jù)全面地擬合含有平衡存在的單體-二聚體-四聚體的模型而得到的。InK1-2和InK1-4分別是從單體形成二聚體和四聚體時的平衡常數(shù)。2圓括號中的值是InK的引導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)誤差(bootstrapstandarderror)表Ⅶ使用3mm中心板在多種轉(zhuǎn)速下測定在pH7．6，150mMNaCl下L-組氨酸對β-乳球蛋白的自結(jié)合的影響4℃20℃32℃InK1InK1InK1緩沖液14k&amp;18K16k&amp;20K22k&amp;26K沒有添加劑11．34(0．12)10．26(0．12)9．28(0．03)250mMhis9．52(0．06)8．48(0．02)8．03(0．02)1使吸光度數(shù)據(jù)全面地擬合基線偏移量(baselineoffset)浮動的理想單體-二聚體模型而得到的。圓括號中給出了InK值的引導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)誤差。方括號中的數(shù)字表示差值的均方根?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)，顯然組氨酸和組氨酸類似物能降低有或沒有鋅的胰島素和胰島素類似物的自結(jié)合。在含有2鋅／六聚體的野生型胰島素的情況下，在所檢測的濃度范圍內(nèi)，pH7．5下的沉降平衡數(shù)據(jù)可以擬合不存在NaCl的非理想二聚體-六聚體模型，或擬合100mMNaCl存在下的理想二聚體-六聚體模型(當(dāng)加載胰島素濃度低于1mM時)。另外，無論是否存在NaCl，組氨酸濃度對天然人2鋅／六聚體胰島素的InK26值有顯著影響。不存在鋅時，組氨酸對LysPro類似物的影響比對野生型胰島素的影響更顯著。組氨酸也能降低完全不相關(guān)的其它蛋白質(zhì)諸如溶菌酶和β-乳球蛋白的自結(jié)合。因此，本文公開了降低多肽藥劑自結(jié)合并提高其溶解性的方法。盡管已稍詳細(xì)地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)理解可以進(jìn)行明顯的改變而不背離如所附的權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.一種減少多肽形成低聚物的方法，所述方法包含將所述多肽與量足以減小所述多肽的自結(jié)合趨向的組氨酸化合物混合。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中的組氨酸化合物是L-組氨酸。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中的組氨酸化合物是L-甘氨酰-組氨酸。4.權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中的多肽是胰島素化合物。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中的胰島素化合物是人胰島素化合物。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中的胰島素化合物是無鋅的人胰島素化合物。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中的胰島素化合物是人LysB28ProB29胰島素類似物。8.權(quán)利要求4所述的方法，其中胰島素六聚體的形成減少。9.權(quán)利要求4所述的方法，其中組氨酸化合物的濃度至少為約10mM。10.權(quán)利要求4所述的方法，其中組合物的pH約為pH7-8。11.多肽和組氨酸化合物在制備可用于經(jīng)電轉(zhuǎn)運(yùn)通過身體表面釋放多肽藥劑的組合物中的用途，其中所述組氨酸化合物以足以減小所述多肽自結(jié)合趨向的量存在于所述組合物中。12.權(quán)利要求11所述的用途，其中的組氨酸化合物是L-組氨酸。13.權(quán)利要求11所述的用途，其中的組氨酸化合物是L—甘氨酰-組氨酸。14.權(quán)利要求11-13任一項所述的用途，其中的多肽是胰島素化合物。15.權(quán)利要求14所述的用途，其中的胰島素化合物是人胰島素化合物。16.權(quán)利要求15所述的用途，其中的胰島素化合物是無鋅的人胰島素化合物。17.權(quán)利要求15所述的用途，其中的胰島素化合物是人LysB28ProB29胰島素類似物。18.權(quán)利要求14所述的用途，其中胰島素六聚體的形成減少。19.權(quán)利要求14所述的用途，其中組氨酸化合物的濃度為約10mM至約250mM。20.權(quán)利要求14所述的用途，其中組合物的pH約為pH7-8。21.權(quán)利要求20所述的用途，其中胰島素化合物與組氨酸化合物的摩爾比為約1∶10-約1∶1000。22.人胰島素化合物和組氨酸化合物在制備可用于經(jīng)被動經(jīng)皮釋放通過身體表面釋放多肽藥劑的組合物中的用途，其中所述組氨酸化合物以足以減小所述多肽自結(jié)合趨向的量存在于所述組合物中。23.權(quán)利要求22所述的用途，其中的組氨酸化合物是L-組氨酸。24.權(quán)利要求22所述的用途，其中的組氨酸化合物是L-甘氨酰一組氨酸。25.權(quán)利要求22所述的用途，其中的胰島素化合物是無鋅的人胰島素化合物。26.權(quán)利要求22所述的用途，其中的胰島素化合物是人LysB28ProB29胰島素類似物。27.權(quán)利要求22所述的用途，其中組氨酸化合物的濃度為約10mM至約250mM。28.權(quán)利要求22所述的用途，其中組合物的pH約為pH7-8。全文摘要本發(fā)明公開了減小多肽藥物自結(jié)合趨向的方法。該方法利用組氨酸化合物并可使用經(jīng)皮釋放技術(shù)使多肽藥劑更有效釋放。文檔編號A61K38/28GK1278737SQ9881110公開日2001年1月3日申請日期1998年11月3日優(yōu)先權(quán)日1997年11月12日發(fā)明者I·K·M·侖申請人:阿爾薩公司