專利名稱：：用于監(jiān)測水解活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及監(jiān)測水解酶的活性的方法和監(jiān)測生物大分子水解消化的方法。具體而言，本發(fā)明是關(guān)于使用熒光染料監(jiān)測蛋白質(zhì)和/或肽消化或者蛋白酶活性的方法。
背景技術(shù)：
：水解酶對許多生物過程是必需的，所述生物過程包括凋亡、細(xì)胞分化、骨再造、凝血、疾病狀態(tài)、癌侵襲、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和多種病原性生物的感染周期等等。利用具有各種底物特異性的大量已知水解酶已經(jīng)開發(fā)了許多測定法，由于這些測定法需要不同的特異性底物，因而不能簡便fej"它們進(jìn)^^目互的比較。通常，例如對于蛋白酶類，這些測定法是基于蛋白酶底物的肽類似物，所述肽類似物通過水解鍵斷裂后出現(xiàn)的分光光度變化(吸收或熒光)而被連續(xù)地監(jiān)測(例如W02003/089663及其參考文紀(jì)。該方法可以被應(yīng)用于探索一賄列的特異性、測量特定水解酶的活性以及應(yīng)用于推定抑制劑的分析，但是不能應(yīng)用于比較不同蛋白酶的活性，原因M物的選擇是有限的而且可用的底物僅適用于幾種蛋白酶。另夕卜，例如M白或BSA等常用底物蛋白質(zhì)可以被熒光團(tuán)強(qiáng)烈標(biāo)記，并且猝滅的減少可被用作蛋白酶活性的量度(例如Jones,etal.AnalyticalBiochemistry(1997)251(2)，144-152)。然而，所述底物被不均勻標(biāo)記并且形成的肽被不確定地標(biāo)記，這/f吏得無法進(jìn)行后續(xù)的肽分析來探索序列特異性。蛋白的物理標(biāo)記也姊響蛋白酶消化該蛋白的能力。Spenceretal.(Anal.Biochenu(1975)64，556-566)已經(jīng)報(bào)道了一種多P宗某些蛋白酶對含疏水口袋的完R白質(zhì)底物(例如BSA、a-i^白、脲酶和過氧化氫酶)的水解活性的方法，這種跟蹤方法通it^所述口袋中釋放熒光團(tuán)即1-苯胺基-8-恭璜酸鹽來實(shí)現(xiàn)。然而，這種方法不具有普適性；僅僅適用于含有疏水口袋的蛋白質(zhì)。現(xiàn)有技術(shù)包含的方法需要形成染料標(biāo)記的蛋白酶底物。然而，這些方法會影響所述底物，因?yàn)樗鰳?biāo)記在性質(zhì)上通常是非蛋白質(zhì)的并且常常體積較大，所以它們作為所述蛋白酶天然底物的合理模型的有效性受到質(zhì)疑。無染料的方法包括電泳、HPLC和質(zhì)譜法。然而，這些方法4艮費(fèi)力，不適合于實(shí)時測量，并且也難以提取動力學(xué)數(shù)據(jù)。而且，用多種蛋白酶進(jìn)行蛋白水解消化通常是蛋白組學(xué)中蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的第一步，并且是重要的一步。DM的水解已經(jīng)可以通過DNA結(jié)合染料的置換進(jìn)行測定，所述染料例如PicoGreen(Tolun，etal.,NucleicAcidsResearch(2003)31(18)，elll/l-elll/6)或溴4匕乙錠(例如Ferrarietal.，NucleicAcidsResearch(2002)30(20)，ell2/l-e112/9)。這些方法不是基于焚光標(biāo)記的底物，而是基于DNA普遍的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)l吏得可以通過DNA小溝中或嵌入位點(diǎn)處的染料的置換實(shí)時監(jiān)測核酸酶或螺旋酶的活性。如果能夠?yàn)槠渌乃饷?例如蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶等)開發(fā)這種類型的測定法將是有利的。因此，亟需用于測定水解酶活性的快速并且簡便的實(shí)時測試法，所述方法是定量的并且可進(jìn)行例如不同蛋白酶(具有彼此獨(dú)立的底物)的比較。蛋白組學(xué)上甚至有更大的需求，它需要測定水解酶活性以使得可對生成的片段進(jìn)行質(zhì)譜法或HPLC分析。因此，也需要新的和多用途的方法來監(jiān)測蛋白質(zhì)或肽的消化過程，其中產(chǎn)生的肽和其他片段能夠被用于進(jìn)一步的下游分析。因此，本發(fā)明的目標(biāo)^^服或改進(jìn)現(xiàn)有才支術(shù)的至少一個缺點(diǎn)，或者是提供另外的有效方案。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供一種測定水解試劑的活性的方法，包括步驟1:在存在一種焚光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下；以及步驟2:隨時間監(jiān)測所述染料的熒光，其中熒光隨時間的變化指示所述水解試劑對所述生物分子的消化。所述生物分子可以是任何生物大分子。然而，所述生物大分子優(yōu)選為蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)組(proteome)。所述變化可以是熒光的增加或減少。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測水解試劑對生物分子的消化的方法，包括步驟1:在存在一種熒光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下；以及步驟2:隨時間監(jiān)測所述染料的熒光，其中熒光隨時間的變化指示所述水解試劑對所述生物分子的消化。才艮據(jù)第三方面，本發(fā)明提供一種確定水解試劑對生物分子消化的終點(diǎn)的方法，包括步驟1:在存在一種熒光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下；和步驟2:隨時間監(jiān)測所述染料的熒光變化，其中熒光不再變化時即表示所述生物分子的消化終點(diǎn)。根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測水解試劑對生物分子的消化的方法，包括步驟l:使一種生物分子與一種水解試劑接觸形^X應(yīng)混合物，步驟2:使所述反應(yīng)混合物的第一樣品與一種熒光染料接觸并測定第一樣品的熒光，步驟3:使步驟1的反應(yīng)混合物處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下，并且步驟4:在所述生物分子的消化過程的所需時間點(diǎn)，使所述反應(yīng)混合物的第二樣品與一種熒光染料接觸；以及步驟5:測定所述第二樣品的熒光，其中所述第4品的熒^目對于所述第一樣品的熒光的變化，指示所述水解試劑對所述生物分子的消化的程度。上述方法的一個實(shí)施方案考慮了在消化過程中定期對所述反應(yīng)混合物取樣，并且在每個樣品中加入焚光染料之后測定焚光隨時間的變化，直至觀察到的熒光不再減少。所述方法的變化方案可以被應(yīng)用于確定生物大分子消化的終點(diǎn)。隨時間測定熒光可以有利于提供表示反應(yīng)速率常數(shù)的數(shù)據(jù)。在測量之前，該亞取^樣(sub-sampled)的>^混合物被適當(dāng)?shù)剽?。根?jù)第五方面，本發(fā)明提供一種用于前述任一方面的方法中的熒光染料或其組合物。根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供一種用于前*利要求任一項(xiàng)的方法中的試劑盒，包括熒光染料、一種或多種水解試劑、以及任選地包括所述水解試劑的標(biāo)準(zhǔn)底物，以及關(guān)于如何使用所述試劑盒監(jiān)測生物大分子的消化的說明書。優(yōu)選地，所述試劑盒包含一種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)或肽底物，或者任何其他的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。優(yōu)選地，所述試劑盒包含適合于所述酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖劑。優(yōu)選的緩沖劑包括Good緩沖劑(Good'sbuffer)的一種，例如N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸、BES等。^^TT水解的生物分子可以被應(yīng)用于本發(fā)明中。所述生物分子可以是任何大小/分子量的，但優(yōu)選是大分子。所述大分子最優(yōu)選是碳水化合物、脂質(zhì)、肽/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)組、磷蛋白、糖蛋白或寡核苷酸。技術(shù)人員應(yīng)知曉，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"生物分子"包括天然存在的分子以及合成的分子，其中所述合成的分子可以包含與天然存在的分子相似的部分；或者它們的類似物、同源物、矛汴生物或修飾物(其中所述4務(wù)飾物可以通過/用生物途徑或者通過合成途徑制備)。本發(fā)明的生物分子一fel:兩個或多個a酸形成的a酸寡聚物/多聚物，即任意大小的肽、多肽或蛋白質(zhì)；兩個或多個核酸形成的寡聚物/多聚物，即DNA(包括cDNA、gDNA和^f沐非編碼DNA)或RNA(包括mRNA、tRM、RMi、siRNA或任何非編碼RNA等)；或者脂質(zhì)或其部分中發(fā)現(xiàn)的寡聚物/多聚物。技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明還涉及生物分子的混合物?？梢允褂萌魏蔚目伤獾纳锎蠓肿?。然而，所述生物大分子優(yōu)選是碳水化合物、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或者它們的混合物。所述生物分子可以存在于基因組、蛋白質(zhì)組或細(xì)胞提取物中。另夕卜，優(yōu)選的生物大分子是能夠被水解試劑切割或消化的蛋白質(zhì)、AUl蛋白質(zhì)組。優(yōu)選地，所述底物具有提高的疏水性。任何提供這種提高的疏水性的方法都是合適的。然而，蛋白質(zhì)變性劑(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為洗滌劑)以非變性的量使用以提高蛋白質(zhì)疏水性，從而增加或改變所述熒光染料的結(jié)合。這些洗滌劑包括但不限于SDS、LDS、曲拉通X-100(tritonX-100)、CHAPS、ALS、CTAB、DDA0、D0C等。優(yōu)選地，所述疏7jc試劑改變所述生物分子的疏水性。在本說明書中，應(yīng)認(rèn)為所述術(shù)語一種或多種蛋白質(zhì)還包括重組蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)或肽可以存在于一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)/肽混合物中，例如存在于整個蛋白質(zhì)組中。所述水解試劑優(yōu)選是酶，并且更優(yōu)選是蛋白水解的試劑，例如能夠在至少一個位置切割生物分子的蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶或核酸酶。能夠在本發(fā)明中使用的7jc解酶的非限制性實(shí)例有羧酸酯水解酶、發(fā)u酯水解酶、磷酸單酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸單酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸單酯水解酶、磷酸三酯水解酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸外切酶(exodeoxyribonuclease)、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的核糖核酸夕卜切酶(exoribonuclease)、產(chǎn)生3，-磷酸單酯的核糖核酸夕卜切酶、對核糖核酸或脫，糖核酸有活性的外切核酸酶、對核糖核酸或脫g糖核酸有活性的外切核酸酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶(endodeoxyribonuclease)、產(chǎn)生非5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、對改變的磁基具有特異性的位點(diǎn)特異性脫，糖核酸內(nèi)切酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶、產(chǎn)生非5，-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶、對核糖核酸或脫，糖核酸有活性的核糖核酸內(nèi)切酶、對核糖核酸或脫IUt糖核酸有活性的核糖核酸內(nèi)切酶、糖苷酶(即水解(Ht#S^t基的酶)、水解N^IJ^^^的酶、硫S^三^J^M^解酶(trialkylsulfoniumhydrolase)、S^K解酶、#JliS|、二AkJl"、二JlfciJlkJl和三RiJ;W、tt^自、絲氨酸型mW、金屬mW、半WL酸型皿酶、co誠、絲氨酸內(nèi)JlkJl、半跳酸內(nèi)誠、天4^氨酸內(nèi)誠、金屬內(nèi)麟、蘇氛酸內(nèi)肖。優(yōu)選的熒光染料應(yīng)與蛋白質(zhì)或皿水性地結(jié)合或相互作用。在一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是SYTOX綠。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是Hoechst33342。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是碘化丙啶(propidiumiodide)。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是ANS。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是印icocconone。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是尼羅紅。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是BODIPYFLCs神經(jīng)酰胺(BODIPYFLC5ceramide)。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是5-十八^^氨基熒光素。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是SYPR0橙。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是花青染料(cyaninedye)。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料選自于laurdan/prodan家族染料。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是dapoxyl衍生物。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是芘染料(pyrenedye)。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是二苯己三烯衍生物。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是羅丹明衍生物。在另一個實(shí)施方案中，所述熒光染料是香豆素衍生物。但是，根據(jù)本文的教導(dǎo)，顯然任何疏水活性染料(hydrophibiclyactivedye)在本發(fā)明的方法中都是有用的。有用染料的實(shí)例有花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物ANS及其類似物、苯乙烯染料(styryldye)、尼羅紅、兩親熒光素、羅丹明和香豆素，或者在對其環(huán)境親脂性作出顯著改變其熒光行為的AJI(疏水活性)的^f沐其他熒光團(tuán)。而且，根據(jù)本文的教導(dǎo)，可清楚地知曉衍生生物分子的酶，例如改變蛋白質(zhì)疏水性的轉(zhuǎn)移酶(例如曱基轉(zhuǎn)移酶;羧曱基-、甲?；?及相關(guān)的轉(zhuǎn)移酶；絲轉(zhuǎn)移酶和氨曱?；D(zhuǎn)移酶；脒基轉(zhuǎn)移酶；轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase)和轉(zhuǎn)醛醇酶(transaldolase);StJ^轉(zhuǎn)移酶；^tj^轉(zhuǎn)移酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶、；X^基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)移其#基的酶；轉(zhuǎn)移^i^芳基的酶；轉(zhuǎn)氨酶CtJ^轉(zhuǎn)移酶)；將基轉(zhuǎn)移酶(oximinotransferase);例如蛋白激Sl^轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的酶；硫轉(zhuǎn)移酶；磺基轉(zhuǎn)移酶；CoA轉(zhuǎn)移酶；和竭基轉(zhuǎn)移酶(selenotransferase)),能夠與所述的染料相互作用從而可以實(shí)時監(jiān)測轉(zhuǎn)移酶活性。優(yōu)選地，所述熒光染料對其環(huán)境的親脂性的^是其熒光行為顯著改變。優(yōu)選地，所述生物分子的水解14Ui不受所述焚光染料的影響。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"印icocconone及相關(guān)染料"意欲包括印icocconone本身以;^如WO2004/085546中具#^>開的相關(guān)熒光染料，該文獻(xiàn)內(nèi)^it過引用的方式全文納A4^文。根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供一種用于測定和/或檢測水解消化反應(yīng)的產(chǎn)物的方法，包括步驟l:對一種生物分子進(jìn)行水解消化以獲得蛋白質(zhì)或肽片段，步驟2:使所述蛋白質(zhì)或肽片段與一種熒光染料接觸，以及步驟3:檢測所述染料的熒光變化，其中所述的染料焚光變化與所述蛋白質(zhì)或肽片段的量成比例。根據(jù)前a利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子是生物大分子。優(yōu)選在一種緩沖劑存在時進(jìn)行所述水解，例如一種Good緩沖劑或一種N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖劑。優(yōu)選隨時間測量焚光以提供表示^JI速率系數(shù)的數(shù)據(jù)。優(yōu)#1』終點(diǎn)時終止所述消化，并且在消化終止以后進(jìn)一步分析所it^J^^物。所iiii一步的分析可以選自于M量指紋謙法(P印tidemassfingerprinting)(PMF)、肽i普法和HPLC。在其他的實(shí)施方案中，可以在所述熒光染料中加入堿。在另外的實(shí)施方案中，所述生物分子來自于生物樣品或食品樣品。所述生物分子可以是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物。所述生物分子優(yōu)選是碳水化合物或碳水化合物混合物。所述生物分子優(yōu)選是糖蛋白或淀粉。所述生物分子優(yōu)選;O旨質(zhì)。所述生物分子優(yōu)選是植物油。所述生物分子優(yōu)選是寡核苷酸。所述生物分子優(yōu)選是DM。所述試劑盒也可以包含選自于以下的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或肽底物BSA、脫鐵運(yùn)鐵蛋白、ot-,白、P-錄白、碳酸酐酶、胎球蛋白、鮭魚精DNA、可溶淀#滅油。下文將僅通過示例的方式并參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案圖1.使用印icoccononeUex540±10nm，Xem630±10nm)作為才艮告染料，PNGaseF對胎球蛋白去糖基化的實(shí)時監(jiān)測的動力學(xué)(A)，以及通過SDS-PAGE驗(yàn)汪所述消化(B)。對帶熒光團(tuán)的^5^斤i^t蛋白(空心方刻進(jìn)行^目指數(shù)式締合/解離模型(Y-Y最pexp(l-klX)+跨距*6叉？(-1^說+平臺)擬合，并且確定的kl和k2值作為kl和k2的固定值被應(yīng)用于酶PNGaseF對胎球蛋白的酶水解(空心圓)的^4目指數(shù)式締合/解離方程(Y-跨距l(xiāng)*exp(1-klX)+跨距2*exp(-k2X)+跨距3*exp(l-k3X)+平臺)中。插圖顯示水解的導(dǎo)出動力學(xué)常數(shù)和半衰期。B表示天然(2it)和去糖基化的胎球蛋白(3it)的SDS-PAGE驗(yàn)證1錄示L匿標(biāo)記物(97、66、45、30、20.1和14.4kDa)，4iiX是酶PNGaseF(48.4kDa)。圖2.DNA酶1對鮭魚精雙鏈DNA的水解的實(shí)時監(jiān)測的動力學(xué)，使用Hoechst33342(Xex355nm,入加460nm)(A)、SYTOX一綠(入ex485nm，入e^520nm)(B)和^f匕丙啶(入ex540±10nm,入加630±10nm)(C)作為報(bào)告染料。對使用染料的DM的熒光數(shù)據(jù)(空心方射和使用DM酶和染料的DNA的熒光數(shù)據(jù)(空心圓)進(jìn)行進(jìn)程曲線擬合。對于每種情況，對帶熒光團(tuán)的所述蛋白質(zhì)進(jìn)行單相指數(shù)式衰減(Y=i^3￡*exp(-kX)+平臺)擬合，并且k的值作為kl的固定值被應(yīng)用于DNA加DM酶的二相指數(shù)式衰減中"=跨距hexp(-klX)+跨距2豐exp(-k2X)+平臺)。插圖示出水解的準(zhǔn)一級(pseudo-firstorder)動力學(xué)常數(shù)和半衰期。D表示對佳月Hoechst33342(2道和3if)、SYT0X-綠(4道和5ii)和捵化丙啶(6道和7道)的DM樣品水解進(jìn)行的基于DM凝膠電泳的^^E:1道和8錄示SPP1DNA襯量標(biāo)記物。圖3.使用印icocconone(入ex540±10nm，入加630±10nm)作為才艮告染料，a-淀粉酶水解淀粉實(shí)時監(jiān)測的動力學(xué)。A為淀粉酶與淀粉混合后印icocconone的焚光減少，B中加入了曲扭逸X-100(0.02%)洗滌劑。對于每種情況，對所述帶熒光團(tuán)的蛋白質(zhì)(空心方塊)進(jìn)行單相指數(shù)式衰減(Y-跨距*exp(-kX)+平臺)擬合，并且k的值作為kl的固定值被應(yīng)用于淀粉加淀粉酶(空心圓)的二相指數(shù)式衰減中(Y-跨距l(xiāng)*exp(-klX)+跨距2*exp(-k2X)+平臺)。插圖示出水解的準(zhǔn)一級動力學(xué)常^L和半衰期。圖4.l狄B0DIPYFLCs神經(jīng)^^(入ex485nm，入柳520nm)作為報(bào)告染料，堿性磷酸酶對P-錄白(P"CN)去磷酸化的實(shí)時監(jiān)測動力學(xué)。對帶熒光團(tuán)的^5^斤述磷蛋白(空心方刻進(jìn)行單相指數(shù)式遞增(Y-i^距豐exp(l-kX)+平臺)擬合，并且確定的k值作為kl的固定值凈i^用于磷酸酶對所述磷蛋白的酶水解(空心圓)的二相指數(shù)式遞增(Y-跨距hexp(l-klX)+跨距2本exp(l-k2X)+平臺)中。插圖示出堿性磷酸酶水解p-i^白的導(dǎo)出動力學(xué)常數(shù)和半衰期。圖5.使用5-十/Vilt^氨基熒光素(入ex485nm，Xem520nm)作為報(bào)告染料，脂肪酶(O.OlyL，Greasex⑧)對ll^莧油水解的實(shí)時監(jiān)測動力學(xué)。方ifel不佳月酶的梯3莧油的實(shí)時數(shù)據(jù)，圓圈是加X^旨肪酶的歉跪油。對帶熒光團(tuán)的僅橄晚油(空心方刻i^f亍單相指數(shù)式衰減(Y=i^i^*exp(-kX)+平臺)擬合，并且確定的k值作為kl的固定值雌用于脂肪酶對所述油酶7jc解(空心圓)的二相指數(shù)式衰減中仃=跨距hexp(-klX)+i^距2化xp(-k2X)+平臺)。插圖示出水解的導(dǎo)出動力學(xué)常數(shù)和半衰期。圖6.4吏用熒光團(tuán)印icocconone(入ex540±10nm,Xem630±10nm)作為報(bào)告染料i^宗非特異性蛋白酶(木瓜蛋白酶)消化四種不同蛋白質(zhì)的實(shí)時監(jiān)測實(shí)例。對于每種情況，對帶熒光團(tuán)的所述蛋白質(zhì)(空心方^)進(jìn)行單相指數(shù)式衰減(Y-跨距texp(-kX)+平臺)擬合，并且k的值作為kl的固定值^JI用于蛋白質(zhì)加木瓜蛋白酶(空心圓)的二相指數(shù)式衰減(Y-跨距hexp(-klX)+跨距2*exp(-k2X)+平臺)中。BSA(A)、錄白(B)、脫鐵運(yùn)鐵蛋白(C)和碳酸酐酶(D)作為示例被示出。插圖示出消化的準(zhǔn)一級動力學(xué)常數(shù)和半衰期。E表示^J!J木瓜蛋白酶消化不同蛋白的SDS-PAGE^ii:1道，L匿標(biāo)記物(97、66、45、30、20.1和14.4kDa);2道，BSA;3道，BSA/木瓜蛋白酶；4道，a-終白；5道，妙白/木;^蛋白酶；6道，脫鐵運(yùn)鐵蛋白；7道，脫鐵運(yùn)鐵蛋白/木瓜蛋白酶；8道，碳酸酐酶(牛)；9道，碳酸酐酶/木瓜蛋白酶；10道，^M^瓜蛋白酶。圖7.本實(shí)例顯示使用多種熒光團(tuán)監(jiān)測蛋白酶對BSA的水解。使用SYPR0橙(A)、尼羅紅(B)和印icocconone(C)實(shí)時監(jiān)測胰蛋白酶的蛋白酶解，并且使用ANS實(shí)時監(jiān)測木瓜蛋白酶的蛋白酶解(D)。對于每種情況，對帶熒光團(tuán)的^;斤述蛋白質(zhì)(空心方刻i^f亍單相指數(shù)式衰減(Y=i^i^*exp(-kX)+平臺)擬合，并且確定的k值作為kl的固定值,用于蛋白質(zhì)加蛋白酶(空心方射的二相指數(shù)式衰減(Y-跨距hexp(-klX)+跨距2*exp(-k2X)+平臺)中。每幅圖的插圖示出水解的導(dǎo)出動力學(xué)常數(shù)和半衰期。E表示^J)不同熒光團(tuán)進(jìn)行的胰蛋白酶(2-7道)和木瓜蛋白酶(8-9if)的BSA蛋白酶解的SDS-PAGE被2和3道，SYPR0橙；4和5道，尼羅紅；6和7道，印icocconone;8和9道，ANS。1i!X化L匿標(biāo)記物aUi至下為97、66、45、30、20.1和14.4kDa)。圖8.在無報(bào)告染料的情況下進(jìn)行牛血清白蛋白(BSA;空心圓)和碳酸酐酶(CA;倒三角)的胰蛋白酶消化。在標(biāo)定時間點(diǎn)對每個^JI亞取樣，并JL^加入才艮告染料(epicocconone)和讀取焚光之前用亮肽素(leupeptin)(A)或大豆胰蛋白酶抑制劑(B)猝3U^蛋白酶活性。插圖示出消化的^^見一^it率常數(shù)，該常Kbl通過將所述數(shù)據(jù)用單相指數(shù)式衰減擬合計(jì)算得出。圖9.^J^l熒^艮告染料(印icocconone;Xex540±10nm，Xem630±10nm)的、水解酶W夷蛋白酶)對復(fù)雜的蛋白質(zhì)組(酵母)進(jìn)行胰蛋白酶消化的實(shí)時監(jiān)測動力學(xué)。對帶熒光團(tuán)的>(^斤絲蛋白(空心方^)進(jìn)行J^目指數(shù)式締合/解離模型(Y=Y最^exp(l-klX)十i^距豐exp(-k2X)+平臺)擬合，并且確定的kl和k2值作為kl和k2的固定值^用于酶即胰蛋白酶F對酵母蛋白質(zhì)組進(jìn)^SI水解(空心圓)的三相指數(shù)式締合/解離方程(Y-跨距l(xiāng)*exp(l-klX)+跨距2*exp(-k2X)+跨距3*exp(l-k3X)+平臺)中。插圖示出水解的導(dǎo)出動力學(xué)常數(shù)和半衰期。通過殘差顯示蛋白質(zhì)組加染料(空心方W和蛋白質(zhì)組加水解酶和染料(空心圓)的擬械度。圖10.使用印icocconone作為報(bào)告染料，M在和不存在非變性量的洗滌劑(SDS)時碳酸酐酶(CA)的胰蛋白酶消化的實(shí)時監(jiān)測。CA加SDS但無胰蛋白酶(空心方刻顯示出熒光的慢衰減，而存在胰蛋白酶(空心圓)時顯示出熒光的指數(shù)式衰減。不存在SDS時信號很低(倒三角)，狄由于CA周圍的疏水性減少。圖11.N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(藍(lán)色)、胰蛋白酶(黃色)、牛血清白蛋白(紅紫色)和胰蛋白酶消化的BSA謹(jǐn)綠色)的熒光變化的原始數(shù)據(jù)。圖12.來自0-128分鐘的亞取樣BSA胰蛋白酶消化液(含有印icocconone)的皿電泳(A)，電泳前用^ip樣緩沖絲85iC下猝滅。包含除胰蛋白酶之外所有組分的對照皿(B)在128分鐘內(nèi)沒有顯示出變化。用De印Purple總蛋白質(zhì)染色劑(De印PurpleTotalProteinStain)對:^染色。首itt示L匿標(biāo)記物，末道顯示過夜孵育產(chǎn)物。圖13.從圖12中顯示的亞取樣樣品的選通區(qū)域(gatedregion)測定的總熒光強(qiáng)度。圖14.來自圖11的原始數(shù)據(jù)的動力學(xué)分析。A是N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.4)中印icoccone反應(yīng)的分析，顯示染色的形成和隨后的分解。示出了4^見一級常數(shù)。分解的速率M用于計(jì)算胰蛋白酶消化的一^il率常數(shù)(B)。對來自圖13的蛋白質(zhì)皿的數(shù)據(jù)分析得到類似的結(jié)果(C)。圖15.通過SDS-PAGE顯示胰蛋白酶消化物。l道標(biāo)記物；2道M蛋白酶(T=0);3道T=0(無J!^蛋白酶)；4道T=O(剛加AJI蛋白酶以后)；5道T=0.25h;6道T=0.5h;7道T=1h;8道T=6h;9道T=18h;10道^J1蛋白酶(T=18)圖16.實(shí)時監(jiān)測通過印icocconone跟蹤的BSA消化的糜蛋白酶動力學(xué)。圖17.實(shí)時監(jiān)測通過epicocconone跟蹤的BSA消化的胰蛋白酶動力學(xué)。圖18.實(shí)時監(jiān)測通過SYPR0橙JM宗的BSA消化的胰蛋白酶動力學(xué)。上圖顯示出SYPR0橙隨時間對BSA的反應(yīng)(r2=0.9995)，下圖顯示除了加XJ^蛋白酶外其他M相同的瓦應(yīng)。測得胰蛋白酶水解速率為0.1466分鐘—1(r2=0.9739)。圖19.FluroProfile測試。第1和第2行是在37匸下孵育18小時的未消化BSA樣品(無胰蛋白酶)的兩份平行樣(duplicatesamples)。第3和第4行是在37。C下孵育18小時的消化的BSA樣品(^蛋白酶)的兩份平行樣。所述樣品被連續(xù)地進(jìn)行4倍稀釋以最0到1/1024的稀釋液(見圖示標(biāo)注)。第5和第6行分別是BSA標(biāo)準(zhǔn)樣和抑JWJl標(biāo)準(zhǔn)樣，從250jugmL—i連續(xù)稀釋至61ngmL_1。第一列含有50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液作為對照。圖20.熒^目對于4倍連續(xù)辨「^^^圖。圖21.熒ibf目對于已知BSA濃度(根據(jù)表A2繪即。圖22.A.BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.抑肽酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖23.用尼羅^IJM宗胰蛋白酶消化，尼羅紅是另一種在疏7W境中焚光增加的染料。上圖顯示尼羅紅隨時間對BSA的反應(yīng)(r2=0.9969)，下圖顯示除了加X^蛋白酶外其他M相同的^JL測得4^蛋白酶水解速率為0.1302憤—1(r2=0.9894)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明是基于如下的發(fā)現(xiàn)，即熒光染料對于疏水環(huán)境的反應(yīng)可以被用來以非破壞方式跟蹤水解酶的活性。由于所述染料不是永久性地共價^奮飾底物，它們不會顯著地影響酶的活性。不希望拘囿于理論，水解終產(chǎn)物親水性的增加導(dǎo)致對環(huán)境敏感的熒光團(tuán)產(chǎn)生的熒光同時減少。更具體地，本發(fā)明是基于一項(xiàng)意外的發(fā)現(xiàn)，即當(dāng)熒光染料印icocconone被應(yīng)用于含有蛋白質(zhì)和水解酶(例如木瓜蛋白酶等)的水解^JI中的時候，它的熒光隨所述蛋白消化的進(jìn)行(直至消化完成)而降低。Epicocconone、其矛汙生物和用途已記載于申請?zhí)枮镻CT/AU2004/000370的國際專利申請(PCT公布號W02004/085546)中，其內(nèi)^if過引用的方式全文納入本文。Epicocconone和相關(guān)染料已經(jīng)被成功的應(yīng)用于(特別用于)蛋白質(zhì)和其他生物大分子的檢測和定量中。這些方法^于隨蛋白質(zhì)濃度的升高，例如印icocconone等染料的熒光會增強(qiáng)。；^文描述的研究而言，假定消化的蛋白樣品的熒光強(qiáng)度隨時間相對于蛋白消化產(chǎn)生的暴露賴氨酸g的增加而成比例地增加。然而，意料O卜的是，木瓜蛋白酶消化的BSA(牛血清白蛋白)中含有的epicocconone卻顯示出熒光的iSit減少，所述熒光可有^bW蹤所述消化過程并iL^蛋白質(zhì)消化完成時iiJ'J最低水平，這已經(jīng)由SDS-PAGE證實(shí)。不希望拘囿于理論或任何具體的作用機(jī)理，可形成蛋白質(zhì)或肽的較小肽片段的水解消化似乎可改變蛋白質(zhì)的電荷密度或疏水性，從而影響它與疏水活性熒光染料的相互作用，這轉(zhuǎn)而又減少了所述染料的熒光。而且，加入非變性量的表面活性劑(例如SDS、曲4iifX-100或CTAB)顯著地增加經(jīng)水解的蛋白和未水解的蛋白的熒光之間的差異。這個原理可以被廣泛地應(yīng)用于可釋放比起始物極性更大或極性更小的產(chǎn)物的所有水解酶或者其他水解試劑中，也可應(yīng)用于針對其環(huán)境的疏水性而產(chǎn)生反應(yīng)時其量會增加或減少的所有熒光團(tuán)。如上文所述，顯然在蛋白酶的蛋白質(zhì)消化過程中觀察到的印icocconone等疏水活性染料熒光的減少Hfeit用于其>(&^水活性熒光染料。例如以下的染料家族花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物、ANS及其類似物、苯乙烯染料、尼羅紅、兩親熒光素、羅丹明和香豆素，或者對其環(huán)境親脂性作出顯著改變其熒光行為的^的4沐糾熒光團(tuán)。具有類似性質(zhì)的絲染料應(yīng)是本領(lǐng)域技權(quán)員已知的。而且，上述的原理以及^吏用熒光染料觀察到的效應(yīng)可以被應(yīng)用于^^T有以下用途的方法中蛋白質(zhì)的切割或消化，或者將基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)或生物分子(例如轉(zhuǎn)移酶、激酶)。基于上述原理，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測定例如蛋白酶等水解酶活性的方法，該方法是通過將所述水解酶與一種合適的底物(例如蛋白質(zhì)或肽)和一種能夠與所述底物相互作用的焚光染料混合，并且測定或觀察熒光隨時間的減少或增加(變化)，這樣可指示所述水解酶的活性。在這些應(yīng)用中可以4吏用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)底物，例如BSA等。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下的方法，所述方法監(jiān)測例如磷酸、ui另一個實(shí)施;案中r本發(fā)明涉及這樣一種方法，所述方法實(shí)時或者通過連續(xù)取樣監(jiān)測例如蛋白質(zhì)等生物分子在類似于上述的反應(yīng)中的水解消化，并且還檢測或觀察熒光隨時間的減少或增加，以此指示水解消化過程。本文描述的方法容易進(jìn)行自動化技術(shù)或連續(xù)流式技術(shù)處理。下文將通過參考非限制性的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。本文提供的蛋白酶的實(shí)例包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，熒光染料的實(shí)例包括印icocconone、ANS、尼羅紅和SYPRO橙，它們僅作為方便的系統(tǒng)以證明本發(fā)明的原理和可行性。本文提供的水解酶的其他實(shí)例包括酯酶(磷酸酶、脂肪酶、DNA酶)和糖基化酶(淀粉酶、PNGase),它們也只是為了方〗更證明本發(fā)明的可用性。提供的合適熒光團(tuán)的其他實(shí)例包括SYT0X綠、Hoechst33342、；^匕丙咬、印icocconone、B0DIPYFLC5神經(jīng)St^或5-十八itJ^氨基熒光素，它們也只是為了方便證明本發(fā)明廣泛的應(yīng)用。初步實(shí)施例實(shí)施例A:使用epicocconone實(shí)時監(jiān)測胰蛋白酶的消化該研究的目的是確定例如epicocconone等熒光染料是否能夠祐月于胰蛋白酶的蛋白質(zhì)消化的實(shí)時監(jiān)測。A.l材料N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(50mM，pH8.4，Sigma-AldrichB3876)BSA(50mM的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichA3059)胰蛋白酶(l慮HC1中20pg/20nL，Sigma-AldrichT6567)珙乙纖(IOOmM的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，1M,Sigma-Aldrich16125)DTT(100mMN,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad161-0611)透明底96孑Ul(Greinerbio-one，655096)Epicocconone(DMS0中，24mM，F(xiàn)LU0R0technics)De印Purple總蛋白質(zhì)染色劑(GEHealthcare)NuPAGENovex12%Bis-Tris^R(Invitrogen，NP0341)L匿才示i己物(AmershamBiosciences,17-0446-01)A.2設(shè)備Typhoon9200(AmershamBiosciences)FluoStar(BMG)電泳系統(tǒng)(XCellSureLock，Invitrogen)A.3方法A.3.1制備用于消化的BSA1在N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.4)中進(jìn)行胰蛋白酶消化。2用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備10mg/mL的BSA。3將100pL的BSA樣品應(yīng)用于胰蛋白酶消化。A.3.2還原和綠化1在所述100pL的BSA樣品中加入5pL的DTT儲液，在8(TC下維持10W中使所述樣品絲。2在所述樣品中加入4pL的硤乙^^液，在室溫下維持45分鐘-1小時使所述樣品^^化。3在所述樣品中加入20pL的DTT,在室溫下維持45分鐘-1小時以中和樣品中殘余的碘乙Sfe^。A.3.3使用印icocconone(FluoStar測定法)實(shí)時監(jiān)測胰蛋白酶消化1把來自上文3.2的經(jīng)還原且變性的BSA樣品用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25pL+225pLN，N-雙(2—羥乙基)甘氨酸緩沖'⑧。計(jì)算BSA的摩爾濃度為約4nM。2取兩份100jiL的所述樣品(步驟1)分別加到微量滴定板上。對照包括基于N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消^f懷沖液、^M1蛋白酶樣品和未消化的BSA樣品(無胰蛋白酶)。3將印icocconone儲液用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個相應(yīng)孔中加入100yL稀釋的印icocconone溶液。終濃^|_12juM。此時需要大約10分鐘獲^^適的FluoStar設(shè)置^K4以1:40的比例加入用1mMHC1重新配制的胰蛋白酶(Sigma-AldrichT6567)。5FluoStar(Ex/Em=540/630±12)每2^4中實(shí)時監(jiān)測熒M生直至6小時。FluoStari殳置如下溫度，10次閃光/循環(huán)，180個循環(huán)。6利用Excel圖樹所述數(shù)據(jù)作圖(圖11)。A.3.4通過SDS-PAGE顯示胰蛋白酶消化物1將上文3.2得到的還原且變性的BSA樣品用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25ML+225mLN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖紀(jì)。計(jì)算BSA的摩爾濃度為約4pM。2將100jaL的所述樣品(步驟l)加入1.5mL的微型管(microtube)中。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化鍰沖液和未消化的BSA樣品(無胰蛋白酶)。3將印icocconone儲液用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個相應(yīng)孔中加入100pL稀釋的印icocconone溶液。終濃JLA12jiM。在此時(0時間點(diǎn))，取出15jaL樣品，與15jiL的蛋白^^a樣緩沖液(2x)混合，于85X:下變性5分紳。4以1:40的比例加入用1mMHC1重新配制的胰蛋白酶。然后將所述樣品管在371C下孵育。5在2、4、8、16、32、64、128^4t時和過"(18小時)進(jìn)行亞取樣。在每個糾點(diǎn)取出15jaL樣品，立即與15yL的蛋白^^o樣緩沖液(2x)混合，于85'C下變性5^"HH^于-80X:。6對上述亞取樣的樣品進(jìn)行SDS-PAGE(Nupage，12。/。BT劍^)電泳，并且用DeepPurple對^J^進(jìn)行染色顯示。7用Typhoon掃描儀(Ex:Em=532:560LP;440PMT)對De印Purple染色8顯示消化的(圖12A)和未消化的(圖12B)蛋白質(zhì)樣品的所有艦泳道被等同Ati^通，并Jit過ImageQuant(v5."軟件測定熒光強(qiáng)度。A.4數(shù)據(jù)分析和結(jié)果這些研究的結(jié)果總結(jié)在圖11至14中。BSA和BSA+胰蛋白酶與印icoccononeM的原始數(shù)據(jù)按所述的測定獲得，并且^JIPrism0(1^4.0.3,GraphPadSoftware,SanDiegoCA，USA)對其進(jìn)行簡單一級動力學(xué)模型擬合。對于BSA與印icocconone在N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液中的反應(yīng)，明顯有至少兩個^Jl，一個是印icocconone與BSA的時間^l^'I"生締^^和接著的較慢的解離，和/或該熒光綴合物的光漂白。用一個簡單的締合/解離模型/〃-ei/^-^"/+>^^2夂"/^"^"+^值0)0"0111)^^^以該過程，其中第一項(xiàng)是指信號的指數(shù)式增加，第二項(xiàng)是指數(shù)式減少。圖11中的值減去背景熒光(N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸+胰蛋白酶)并且才娥實(shí)驗(yàn)的實(shí)際起始時間(估計(jì)為首次讀^10^#)進(jìn)#^。從該模型獲得0.9992的f2值(圖14)。由于信號隨時間的衰減是印icocconone與蛋白質(zhì)(以^^推定的肽)的相互作用特征，所以k2的值被應(yīng)用于J^蛋白酶動力學(xué)的分析。使用了一個^f目指數(shù)式衰減(/=跨距7/"/^-i7"/+跨距+"f,其中k2被設(shè)定為只使用BSA時獲得的值。因此，在所述實(shí)驗(yàn)條件下估計(jì)的胰蛋白酶的4^見一^4率常氣t0.109min—1(r2=0.9871)。實(shí)際的動力學(xué)明顯更復(fù)雜，但是這是一個很好的近似值，對于在許多情況下的水解活性的監(jiān)測都將是非常有用的。對亞取樣的反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行類似的分析，但是不包括信號隨時間衰減相關(guān)的項(xiàng)，因?yàn)閷τ谀ǘ栽擁?xiàng)并非相關(guān)項(xiàng)。因此，觀察到的表觀一Mit率常:0.3136分鐘1(r2=0.9757)。然而，觀察到很少的點(diǎn)具有大的95%的置信區(qū)間(0.1976至0.4296^4f1)。結(jié)合相對不嚴(yán)密的測定模式(例如在亞取樣過程中繼續(xù)胰蛋白酶消化造成較高的表觀速率常數(shù))，表明了使用印icocconone的胰蛋白酶消化的原位監(jiān)測與亞取樣的繁瑣方法相當(dāng)，并且所述染料的存在不會顯著地影響酶動力學(xué)。還利用碳酸鹽緩沖液(冊4110)3,100mM或50mM，pH8.2)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，并且將其結(jié)果與用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液時獲得的結(jié)弱目比較。所述比較的結(jié)^E圖15中示出。Sigma-Aldrich蛋白質(zhì)組學(xué)級胰蛋白酶(T6567)在兩種消化緩沖液中效果銅艮好。所述消化似乎在0.5-1小時內(nèi)到*點(diǎn)。示出的^:據(jù)表明，經(jīng)還原Jb^^化的BSA^I^蛋白酶快速地消化，并且該過程可以用對環(huán)境敏感的熒光染料進(jìn)行原位跟蹤。實(shí)施例B-使用印icocconone監(jiān)測糜蛋白酶對BSA消化的動力學(xué)B.1材料N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(50mM，pH7.4，B3876)BSA(50慮N，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸中10mg/mL，A3059)糜蛋白酶(C4129,1mMHC1中，1mg/mL)CaCl2(R0水中，1M)碘乙縱(IOOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，1M，16125)DTT(100mMN,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad-161-0611)Epicocconone(DMSO中，24mM，F(xiàn)luorotechnics)FluoStar(BMG)透明底96孑U^(Greinerbio-one，655096)B.2方法B.2.1制備用于消化的BSA1.在N,N-雙(2-幾乙基)甘氨酸緩沖液中進(jìn)行糜蛋白酶的消化。2.用50慮N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備10mg/mL的BSA。3.將100pL的BSA樣品應(yīng)用于糜蛋白酶的消化。B.2.2還原、娛J^化和中和1.在所述BSA樣品(100jaL)中加入5jiL的DTT儲液，加熱(80X:)10分鐘使所述樣品縣。2.在所述樣品中加入哄乙酰胺(4jiL)儲液，在室溫下維持45分鐘-l小時使所述樣品^4化。3.在所述樣品中加入DTT(20jLiL)，并在室溫下孵育45分鐘-1小時以中和殘余的碘乙酰胺。B.2.3使用印icocconone(FluoStar測定法)實(shí)時監(jiān)測糜蛋白酶消化1將來自2.2的還原且變性的BSA樣品用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25juL+225jaLN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖紀(jì)。計(jì)算BSA的摩爾濃度為約6yM。2取兩份100jLiL的所述樣品(步驟1)分別加到微量滴定H對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消4m沖液、僅糜蛋白酶樣品和未消化的BSA樣品(無糜蛋白酶)。3將epicocconone儲液用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍，并il^E每個孔中加入100jiL。終濃^^12jiM。此時需要大約10^l中獲齡適的FluoStar設(shè)置糾。4加入2pLCaCl25以1:30的比例加入用1mMHC1重新配制的糜蛋白酶(C4129)。6使用FluoStar(Ex/Em=540/630-12)每2分鐘實(shí)時監(jiān)測熒M生直至6小時。FluoStar設(shè)置如下溫度，30*C;10次閃光/循環(huán)，180個循環(huán)。7利用Excel圖樹所述數(shù)據(jù)作圖(圖11)。B.3.結(jié)果和討論圖16顯示了對糜蛋白酶消化BSA的動力學(xué)的實(shí)時監(jiān)測。它還示出了類似于胰蛋白酶的動力學(xué)模式(圖17)，即在未消化的BSA中熒光呈指數(shù)增加而在消化的BSA中呈指數(shù)衰減。在這些情況下獲得的糜蛋白酶的表觀一^il率常狄0.0447min—\實(shí)施例C-通過加入SYPRO橙跟蹤BSA的胰蛋白酶消化C.1材料按照上文的實(shí)施例2。SYPRO橙(在DMSO中，24函，MolecularProbes),用50mMN,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。C.2方法按照實(shí)施例2,不同^Jt是Fluorostar讀;feK義(platereader)i史置為480nm'^L和600(±10nm)帶通的發(fā)射濾光片。C.3結(jié)果結(jié)a明，另一種在疏水環(huán)境中熒光增加的染料SYPRO橙在蛋白質(zhì)消化的實(shí)時分析中的絲與印icocconone類似(圖18)。*#^地，通iti^i宗熒光隨時間的下降可以提^u^蛋白酶消化的4^見一m率常數(shù)。該染料獲得了一個相it似的值(k-0.1466分"^—,。Epicocconone和SYPRO^^之間明顯的不同是，用印icocconone時觀察到的熒光的累積在用SYPRO橙時不明顯，并且用SYPRO橙時熒光的光漂白/衰減比用epicocconone時快。實(shí)施例D-使用FiuoroProfile對胰蛋白酶消化后(18小時)產(chǎn)生的肽定量D.1材料和儀器N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(50mM，pH8.4，B3876)BSA(50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL，A3059)胰蛋白酶(lmMHC1中20pg/20pL，T6567)捵乙驗(yàn)(IOOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，1M,16125)DTT(100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad—161-0611)透明底96孑Ul(Greinerbio-one，655096)BSA標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma-Aldrich，A3059)抑JI;kil標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma-Aldrich，A1153)FluoroProfile(Sigam-Aldrich)9200Typhoon掃描儀(AmershamBiosciences)D.2方法1.如前所述，將BSA變性、還原、娛基化并中和以用于胰蛋白酶消化，簡要100iuLBSA樣品(10mg/mL)5jiL用N，N—雙(2-鞋乙基)甘氨酸制備的200mM的DTT:70X:10^4中4jiL用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸制備的1M的IDA:室溫下45辨20jaL用N，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸制備的200mM的DTT:室溫下45分鐘2.在還原、；^^化和中和以后，將上文的BSA樣品用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(50jiL的所述樣品+450pL的50mMN,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖'^)，得到用于胰蛋白酶消化的樣品，即對未消化BSA分別在T=0小時和T^N(過夜)亞取樣的兩份平行樣，和消化的BSA(加入2.5nL的1mMHC1)的兩份平行樣，以財(cái)消化的BSA分別在T=0小時和T=0N亞取樣(加入2.5pL(含2.5pg)胰蛋白酶)的兩份平行樣。3.在胰蛋白酶消化的終點(diǎn)，加入lpL的10%TFA^^在-80X:。計(jì)算用于消化的BSA的量為749pg/mL。D.2.1樣品制備對未消化的BSA(兩份平行樣)和消化的BSA(兩份平行樣)，用50mM的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸連續(xù)地4倍稀釋所述樣品以最賄到1/1024的稀釋液。用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液新鮮配制BSA并JL^續(xù)稀^^到從61ngml/i至lmgmL—、范圍的系列辨「釋液。用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液新鮮配制抑JliJl^ilJl:續(xù)稀釋得到從61ngmL—'至lmgmL—、范圍的系列稀釋液。D.2.2FluoroProfile測定一種FluoroProfile試劑盒工作混合液由8份50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸、1份A部分和1份B部分制得。將樣品(50jiL)加入96孑U1中，并JL^E每個孔中加入FluoroProfile工作溶液(50iliL)。在室溫下孵育樣品30分鐘。使用Typhoon掃描儀在532/610(Ex/Em)讀取熒光。D.3結(jié)果D.3.1未消化的和消化的BSA的熒光水平的FluoroProfile分析圖19示出了進(jìn)4亍樣品FluoroProfile測定的樣品平板的typhoon掃描圖像。如表Al和圖20中所示，消化的BSA樣品的熒M著高于未消化樣品。表Al.連續(xù)稀釋的未消化(第3列)的和消化的BSA樣品(第7列)的熒光。通過FluoroProfile測試所述樣品并且用Typhoon掃描4義讀取熒光。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>將所述未消化的和消化的樣品(被連續(xù)稀釋)的熒光相對于用于胰蛋白酶消化的BSA濃度作圖(表A2和圖21)。計(jì)算所述用于胰蛋白酶消化的BSA(變性的)濃度為749ng/mL(見表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表A4.用抑肽酶標(biāo)準(zhǔn)物對消化的BSA(BSA+胰蛋白酶)定量。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在FluoroProfile測試中觀察到消化的BSA中熒光增加，其中A部^pB部分#^皮用作胰蛋白酶消化18小時后取的亞樣品。使用原始BSA標(biāo)準(zhǔn)物(圖22A)和抑JlkJl標(biāo)準(zhǔn)物(圖22B),觀察到所述消化的BSA的熒光增加比未消化的BSA高約50%和67%(表A3和表A4)。實(shí)施例E-通itio入尼羅紅跟蹤BSA的胰蛋白酶消化E.l材料按照上文的實(shí)施例2。尼羅紅(乙醇中，20mM，Sigma-Aldrich，73189)，用50mM的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。E.2方法按照實(shí)施例2,不同之處是Fluorostar讀板儀設(shè)置為520nm'狄和630(±10nm)帶通的發(fā)射濾光片。E.3結(jié)果結(jié)W明，尼羅紅在蛋白質(zhì)消化的實(shí)時分析中的表現(xiàn)也與epicocconone和SYPRO橙類似(圖23)。M地，通itiM宗焚光隨時間的下降可以提^U夷蛋白酶消化的^C一^i4率常數(shù)。^^l該染料獲得了一個相似的值(k=0.1302^4中—"。Epicocconone與尼羅紅t間明顯的不同是，用印icocconone時，見察到的熒光的累積在用尼羅紅時不明顯，并且用尼羅紅時熒光的光漂白/衰減比用印icocconone時和用SYPRO橙時都快。在實(shí)施例1-3和5中應(yīng)注意到所示所有樣品的BSA胰蛋白酶消化的表觀一級動力學(xué)常lbl相同的(在誤差范圍內(nèi))。實(shí)施例實(shí)施例l:使用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測糖基化酶的活性1.1材料N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(IOOmM,pH8，Sigma-AldrichB3876)*胎球蛋白(R0水中，20mg/mL，Sigma-AldrichF3004)*肽-yHt苷酶F(PNaseF)(Sigma-AldrichP7367)Epicocconone(DMS0中，24mM,FLUOROtechnics)SDS(BDH442444H)2-tt乙醇(Sigma-AldrichM7154)*黑色96孑Ul(Greinerbio-one，655209)De印Purple總蛋白質(zhì)^M染色劑(GEHealthcare)NuPAGENovex12%Bis-Tris^R(Invitrogen，NP0341)NuPAGELDS樣品緩沖液(4x,Invitrogen,NP0007)L匿才示i己物(AmershamBiosciences,17-0446—01)1.2設(shè)備參Typhoon9200(AmershamBiosciences)FluoStar(BMG)電泳系統(tǒng)(XCellSureLock，Invitrogen)1.3方法1.3.1存在洗滌劑時使J^鄰icocconone實(shí)施監(jiān)測去糖基化1.將胎球蛋白用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液以1:20稀釋。2.將所述蛋白(90pg/90nL)用10pL的洗滌劑(含100mM2-統(tǒng)4乙醇的0.2。/。SDS)在100C變性10分鐘。3.將100jaL的所述樣品(步驟2)加到微量滴定板的孔中。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化緩沖液、僅PNGaseF樣品和，基化的胎球蛋白樣品(無PNGaseF)。4.將Epicocconone儲M100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個孑L中加入100pL稀釋的epicocconone溶液。5.使所述樣品在37匸下平衡(預(yù)孵育)20分鐘。FluoStar需要約1分鐘以iiJi^^適的增益i5:置(gainsetting)。6.將用反滲透(RO)水重新配制的1個牟(i的PNGaseF加A^每個胎i^蛋白樣品和對照(如N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液+PNGaseF)中。7.^JIFluoStar(Ex/Em=540±10/630±IO)每3^4中實(shí)時監(jiān)測焚紋生直至69分4中。FluoStari殳置如下溫度，37*C;10次閃光/循環(huán)。8.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅包含胎球蛋白/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并且從胎球蛋白/PNGase/染料樣品中減去PNGase+緩沖液/染料。9.用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖并擬合一見圖1。對所述胎球蛋白樣品進(jìn)行二相締合/解離指數(shù)式(Y-Y最大*(l-exp(-ki*X))+跨距*(exp(_k2*X))-底值)擬合，其中Y是熒3tlt據(jù)，X是時間(以分鐘表示)。kl和k2的值被應(yīng)用于三相締合/解離指數(shù)式(Y-跨距l(xiāng)"l-exp(-k，X))+跨距2"exp(-k,X))+跨距3*(l-exp(-k3*X))-底值)擬合，其中k3^J臺球蛋白被PNGase去糖基化的準(zhǔn)一奴率常數(shù)。1.3.2通過SDS-PAGE顯示去糖基化的樣品1.在測定的終點(diǎn)收集亞樣品。取兩種消化液中的亞樣品(6.5jLiL)，與3.5laL加樣緩沖液(2.5jiL的NuPAGE樣品緩沖液和1jiL的500mMDTT)混合并且在80匸孵育10分鐘。2.然后將每個樣品上樣至12W的聚丙烯酰胺凝膠(NuPAGEBis-Tris，Invitrogen)上，并且電泳(恒壓200V)50分鐘，直至藍(lán)色的上樣緩沖液染料剛剛跑出皿。3.對De印Purple染色的凝膠通過Typhoon掃描儀(Ex:En^532:560LP;440PMT)成像。1.4數(shù)據(jù)分析和結(jié)果因?yàn)樘鞘窍鄬O性的，所以蛋白質(zhì)的去糖基化會導(dǎo)致疏水性的增加。存在低濃度的洗滌劑(如SDS)的時候，當(dāng)糖凈皮去除時應(yīng)該有更多的洗滌劑與所述蛋白質(zhì)結(jié)合。因此，對環(huán)境敏感的熒光分子將對疏水性變化作出>^應(yīng)，以利于酶活性(在該非限制性實(shí)例中胎球蛋白的去糖基化)的無痕、實(shí)時測定。胎球蛋白(48.4kDa)由74%多肽、8.3%己糖、5.5!t^d4t^8.7%唾液酸構(gòu)成，并且是常見的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)物。領(lǐng)')^臺球蛋白4#在熒光團(tuán)印icocconone時與PNGaseF反應(yīng)而獲得的標(biāo)準(zhǔn)化的(上文步驟8)實(shí)時熒itjt據(jù)，并JUMPrism4.0.3，GraphPadSoftware,SanDiego,USA)i^f亍三元(three-component)指數(shù)式締^"解離動力學(xué)模型擬合。天然胎球蛋白樣品的熒光輕孩挑增加，然后由于光漂白/分解而減少，這可以^^單相指數(shù)式締合和f^的慢指數(shù)式離解進(jìn)^^^以。相反，含有酶的樣品的熒光增加，并且用^目指數(shù)式擬合以得到去糖基化的準(zhǔn)一^il率常數(shù)。分析結(jié)果顯示于圖1中。圖1A證明，所述樣品(胎球蛋白+PNGaseF)的熒光的增加是由于在37。C下1小時的去糖基化過程中疏水性的增加。對所述實(shí)時數(shù)據(jù)的擬^f吏得可以分析針對真實(shí)底物的酶活性，并測定水解的動力學(xué)常數(shù)和半衰期。可以使用10倍于半衰期的時間作為完全水解的度量(該示例中為59分鐘)。圖1B是對所述實(shí)時測試的獨(dú)立的SDS-PAGE^，顯示出糖基化后天然的(2道)和PNGaseF處理的(3it)胎球蛋白之間的襯位移(molecularshift)。實(shí)施例2:使用三種不同熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測寡核苷酸的水解2.1材料和i殳備*按照上一個實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。*N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(500mM,pH7.5，Sigma-AldrichB3876)*MgCl2(1M，Sigma-AldrichM-8266)*CaCl2(1M，BDH010070—0500)*DNA酶l緩沖液(x20)，其中含有O.1MN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸，0.4MMgCl2和0.02MCaCl2。*鮭魚精DM(lRO水中，1.25mg/mL，Sigma-AldrichF3004)*DM酶1(0.15MNaCl中，5mg/mL，Sigma-AldrichDN25)*Hoechst33342(DMSO中，10mM，InvitrogenH1399)*^^H匕丙咬(R0水中，1.5mM，Sigma-AldrichP4170)*SYTOX-綠(DMSO中，5mM，InvitrogenS7020)*SPPl/EcoRIDNA^^量標(biāo)ii物(BreastecLtd.DMW-S1)*DNA^U京脂糖(1.5%w/v，Progen200-0011)*核酸樣品加樣緩沖液(5x，Bio-rad161-0767)*Tris-硼^Jt-EDTADNA電^嫂沖液(10xFermentasB52)溴化乙錠(RO水，10mg/mL，Sigma-AldrichE7637)*Mini-SubCellGT(Bio-rad)參ChemiImager4400(AlphaInnotech)2.2方法2.2.1使用Hoechst33342、SYTOX綠和碘化丙咬實(shí)時監(jiān)測DNA酶水解雙鏈■1.將DNA樣品用lxDNA酶l緩沖液稀釋5倍至250ng/mL。2.將100pL的所述樣品(步驟l)加到微量滴定板上。對照包括lxDM酶l緩沖液、僅DNA酶l樣品和未消化的DNA樣品(無DNA酶1)。3.將每種焚光團(tuán)儲液用1xDNA酶1緩沖液稀釋100倍。在每個孔中加入100ML稀釋的熒光團(tuán)溶液。所述樣品在37匸平衡50分鐘。FluoStar需要約1分鐘獲#^適的增益設(shè)置。4.將用0.15MNaCl重新配制的1個#的DNA酶1加A3!J每個待消化的DNA樣品和-H^對照(如1xDM酶1緩沖液+DNA酶1)中。5.^J1FluoStar(Hoechst33342為Ex/Em=355/460nm，^5^f匕丙咬為Ex/Em=540±10/630±10;SYTOX-綠為Ex/Em=485/520nm)每3^4中實(shí)時監(jiān)測熒光發(fā)生直至120分鐘。FluoStar設(shè)置如下溫度，10次閃光/循環(huán)。6.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅含DM的樣品中減去DM酶緩沖液，并且從DNA/DNA酶樣品中減去DNASl+緩沖液。7.使用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖一見圖2。首先將含有熒光團(tuán)的DNA的進(jìn)程曲線進(jìn)行單相指數(shù)式衰減(Y-跨距,exp(-kX)+平臺)擬合，并JJI得的k值作為固定kl值被應(yīng)用于DNA加酶即DNA酶的二相指數(shù)式衰減中(Y-i^距hexp(-klX)+跨距2,exp(-k2X)+平臺)以導(dǎo)出k2。2.2.2通過瓊脂糖電泳顯示外切核酸酶活性1.在測試的終點(diǎn)收集亞樣品。將從兩種消化液取的亞樣品(8pL)都與L的核^樣緩沖液^^。2.然后將每個樣品加樣至含有5ng溴化乙錠的2%的瓊脂^|^_11，電泳(150V恒壓)1小時直至藍(lán)色的加樣緩沖液染料剛剛跑出所述皿。3.用Chemil腿ge,4400對所述溴化乙錠染色的凝l^/像。2.3數(shù)據(jù)分析和結(jié)果進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以證明對環(huán)境敏感的熒光團(tuán)可以被應(yīng)用于寡核苷酸樣品水解的無痕跟蹤，在本非限制性的實(shí)施例中用酶DNA酶1水解雙鏈的鮭魚精腿。圖2顯示了使用三種不同的熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測DNA酶驅(qū)動的水解。加入DNA酶l后，在所有情況中均觀察到了指數(shù)式衰減，并且通過非線性回歸分析得到水解的準(zhǔn)一級速率常數(shù)(K2)。在無酶的緩沖液中的寡核苷酸的進(jìn)程曲線一般用單相指數(shù)式衰減擬合，從而與觀察到的由于所述熒光團(tuán)的光漂白和/或分解而出現(xiàn)的熒光隨時間的緩慢減少相符。所述,化的水解用二相指數(shù)式衰減擬合，并將從所述僅有DNA的樣品獲取的一^J4率常數(shù)作為其中一個速率常數(shù)。那么二級速率常數(shù)(圖2中的K2)就是所述DNA水解的準(zhǔn)一級速率常數(shù)的合理近似。使用三種不同染料所得的速率能很好地吻合，在0.11-0.15分鐘_1內(nèi)變化。對于每種情況，可以測定DM水解的半衰期，并且10倍的該值時可能所述DNA完全水解(在該示例中為46-64分鐘)。圖2D是該實(shí)時測試的基于DNA皿電泳的獨(dú)立驗(yàn)汪，顯示出DNA樣品被DNA酶1完全水解(道3、5和7)，而沒有加入DNA酶的DNA樣品由于存在復(fù)雜的DM混合物而顯示很強(qiáng)的染色(道2、4和6)。該實(shí)施例證明了用多種染料5M宗酶對復(fù)雜的寡核苷酸混合物漆因組)的水解活性的可行性。實(shí)施例3:在存在非變性量的洗滌劑和熒光團(tuán)時實(shí)時監(jiān)測多糖水解3.1材料和設(shè)備*按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。*N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(50mM，pH7，Sigma-AldrichB3876)*淀粉(N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液中1%,Sigma-AldrichS2630)*a-淀粉酶(l.8單位/mg固體，Sigma-AldrichA2771)*曲4iitX-100(BDH30632)3.2方法3.2.1用印icocconone實(shí)時監(jiān)測oc-淀粉酶驅(qū)動的淀粉水解1.用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH7)制備l。/。濃度的淀粉溶液，煮沸15^。2.將曲拉通X-100加入到所述淀粉溶液中，終濃度為O.02%。3.將100juL的所述樣品(步驟l)加到微量滴定板上。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消^m沖液、僅a-淀粉酶樣品和天然淀粉樣品(無淀粉酶)。4.將印icocconone儲細(xì)50mMN，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個孔中加入100|iL稀釋的印icocconone溶液。所述樣品在37n下孵育50分鐘。FluoStar需要約1分鐘以獲#^適的增益設(shè)置。5.將用N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液重新配制的2juL(O.036oc-淀粉酶加入到一份淀^^樣品和一^^對照(如N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液+ot-淀粉酶)中。6.^JIFluoStar(Ex/Em=540±10/630±10nm)每3辨實(shí)時監(jiān)測熒光發(fā)生直至約200分鐘。FluoStari殳置如下溫度，10次閃光/循環(huán)。7.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅含淀粉的樣品中減去緩沖液，并J^J定粉/淀^SI樣品中減去淀粉酶+緩沖液。8.用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖一見圖3。3.3^L據(jù)^^斤和結(jié)果進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以證明對環(huán)境敏感的熒光團(tuán)(例如印icocconone)可以被應(yīng)用于監(jiān)測碳水化合物樣品的水解，例如在該非限制性的實(shí)施例中，通過測定底物周圍局部的水解性監(jiān)測淀粉酶水解馬鈴薯淀粉。圖3顯示出使用印icocconone實(shí)時監(jiān)測淀粉酶驅(qū)動的水解。存在洗滌劑曲拉通X-100時，水解開始的時候熒光信號比沒有洗滌劑時高約20%,表明洗滌劑結(jié)合淀粉形成淀粉周圍更加疏水的環(huán)境，水解對淀粉的破壞導(dǎo)致焚光呈指數(shù)減少。這種意料之外的現(xiàn)象可以被應(yīng)用于無痛J也跟蹤酶反應(yīng)的過程。淀粉酶水解淀粉的準(zhǔn)一級速率常M通過以下方式獲得，即對淀粉/緩沖液/印icocconone對照進(jìn)行單相指數(shù)式衰減擬合，然后使用該值(kl)對所述淀粉/緩沖液/印icocconone樣品進(jìn)行二相指數(shù)式衰減擬合，其中第一指數(shù)被固定為從所述對照確定的kl值。這樣k2值就是oc-淀粉酶水解淀粉的準(zhǔn)一級速率常數(shù)。在該示例中，存在曲拉通X-100時該值是0.55分鐘—'和0.65^4f1。完全消化可以被確定在10倍的半衰期，在該示例中分別為127和107分鐘。實(shí)施例4:使用疏水性活性的熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測蛋白質(zhì)去磷酸化4.1材料和設(shè)備*按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。*P-錄白(Sigma-AldrichC6905)*堿性磷酸酶(10-30DEA單位/mg固體，Sigma-AldrichP7640)，以2mg/mL的濃度溶解于N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液中。*BODIPYFLC廠神經(jīng)纖(在DMSO中10mM,InvitrogenD3521)4.2方法4.2.1^吏用BODIPYFLC廠神經(jīng)SfeJ疾實(shí)時監(jiān)測磷酸酶活性1.用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH7.5)制備濃度為1mg/mL的P-絲白(P-CN)。2.將100jiL的所述樣品(步驟1)加到孩i:量滴定板上。對照包括基于N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化緩沖液、M性磷酸酶的樣品和天然P-CN樣品(無磷酸酶)。3.將BODIPYFLC5-神經(jīng)St^滴月50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個孔中加入100pL稀釋的熒光團(tuán)溶液。所述樣品在3(TC下孵育50分鐘。FluoStar需要約1分鐘以iiJ!j合適的增益設(shè)置。4.將用N，N-雙(2-輕乙基)甘氨酸緩沖液中重新配制的2pL磷酸酶加入到一份0-CN樣品和一份對照(如N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液+磷酸酶)中。5.使用FluoStar(Ex/Em=485/520nm)每3分鐘實(shí)時監(jiān)測熒狄生直至約30分鐘。FluoStari史置如下溫度，301C;10次閃光/循環(huán)。6.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從^5L含p-CN/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并MP-CN/磷酸酶/染料樣品中減去磷酸酶+緩沖液/染料。7.用Prism(GraphPadv.4)對^L據(jù)作圖一見圖4。4.3^L據(jù)分析和結(jié)果在該非限制性實(shí)施例中，我們給出了如何使用BODIPYFLCs-神經(jīng),監(jiān)測堿性磷酸酶驅(qū)動的P-酪蛋白(&-CN)水解。圖4顯示出通過疏水性的增加實(shí)時地監(jiān)測磷蛋白的去磷酸化，所述疏水性與去除極性的磷^有關(guān)。測定從BODIPYFLC5-神經(jīng),與i^白結(jié)合而獲取的標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)被，并且使用Prism(4.0.3版，GraphPadSoftware,SanDiego,USA)用簡單一級指數(shù)式關(guān)聯(lián)模型(simplefirstorderexponentialassociationmodel)擬合。得到的速率常數(shù)(kl)被用作堿性磷酸酶水解酪蛋白的二相指數(shù)式增加中的常數(shù)以獲得所述去磷酸化反應(yīng)的準(zhǔn)一^il率常數(shù)。熒光的增加是由于隨磷^^被去除疏水性增加的結(jié)果(圖4)。在該示例中，可以計(jì)算完全水解的時間為42分鐘(10xt1/2)。實(shí)施例5:用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測酯酶活性5.1材料和設(shè)備*按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充或替換。*#^莧油(無品牌名，Woolworths，Australia)*脂肪酶(50KLU/g，NovozymesGreasex⑧脂肪酶)5-十八Sti^^熒光素(DMS0中，10慮，Sigma-Aldrich74735)5.2方法5.2.1脂肪,化m^莧油水解的實(shí)時監(jiān)測1.用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備濃度為5%的橄欖油。用Branson電子超聲波儀(BransondigitalSonifier)孝l/f匕所ii7K/油懸浮液(以60%的功率2x15秒)。2.將100jaL的所述樣品(步驟l)加到微量滴定板上。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化緩沖液、^f5l脂肪酶樣品和天然歉脫油樣品(無脂肪酶)。3.將5-十八^^氨基熒光素儲液用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個孔中加入100pL稀釋的熒光團(tuán)溶液。4.所述樣品在室溫下孵育50分鐘。FluoStar需要約30秒鐘以iiJl]合適的增益i殳置。5.將0.01、0.1、l和10jiL的多種測試量的Greasex⑧(l旨肪酶)加入所述油樣品中。6.使用FluoStar(Ex/Em=485/520nm)每3分鐘實(shí)時監(jiān)測熒狄生直至約200分鐘。FluoStari殳置如下溫度，10次閃光/循環(huán)。7.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅包含橄欖油/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并JU^橄欖油/Greasex/染料樣品中減去Greasex+緩沖液/染料8.用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖一見圖5。5.3^L據(jù)分析和結(jié)果在該非P艮制性實(shí)施例中，我們給出如何使用環(huán)境敏感的熒光團(tuán)(例如5-十八^氨基熒光素)無痕地跟蹤例如脂質(zhì)等酯的實(shí)時水解。在該示例中，雖然我們給出的是一種市售的脂肪酶對歉跪油的水解，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，相同的或相似的測試可以被應(yīng)用于跟蹤其他酯酶對其他酯的水解。圖5顯示，使用5-十八St^氨基熒光素作為報(bào)告物，實(shí)時監(jiān)測每孔O.01jiL的脂肪酶Greasex⑧對橄欖油的水解。程序Prism能夠?qū)M(jìn)程曲線進(jìn)行單相(梯bT莧油+緩沖液+染料)或^f目(*^覽油+緩沖液+脂肪8|+染料)指數(shù)式衰減的擬合，并確定水解的準(zhǔn)一絲率常數(shù)(圖5，插即。觀察到的熒光的指數(shù)式減少可以通過以下原因進(jìn)行解釋，即槺4覽油樣品水解成的脂肪酸和乙醇的極性比原來酯的極性大，因而水解后疏水性減小。在該實(shí)施例中，完全水解可以被估計(jì)在IOx半衰期(32分鐘)，這證明了本發(fā)明在食品工業(yè)的可用性。實(shí)施例6.存在非變性量的洗滌劑時用印icocconone實(shí)時監(jiān)測蛋白酶解該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行是為了研究佳月印icocconone實(shí)時監(jiān)測非特異性蛋白酶的蛋白質(zhì)消化。6.1材料和設(shè)備按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。蛋白質(zhì)樣品BSA(IOOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL,Sigma-AldrichA3059)，脫鐵運(yùn)鐵蛋白(100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichT2036)、a-i^白(100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichC6780)和碳酸酐酶(100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichC7025)。SDS,442444H)木;^蛋白酶(RO水中，2mg/mL，Sigma-AldrichP4762)碘乙酰胺(IOOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，1M，Sigma-Aldrich16125)DTT(IOOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，200mM,BioRad161-0611)6.2方法6.2.1使用印icocconone監(jiān)測木瓜蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的水解6.2.l.l制備用于消化的BSA1.木瓜蛋白酶消4化N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行。2.用1OOmMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備1Omg/mL的蛋白質(zhì)樣品。3.將100jLiL所述蛋白質(zhì)樣品應(yīng)用于木瓜蛋白酶的消化。6.2.1.2還原和絲化1.在100jaL的蛋白質(zhì)樣品中加入lpL的10%SDS和5iiL的DTT儲液，在80C下維持10^4中^/斤述樣品被ii^。2.在所述樣品中加入4jLiL碘乙ih^ft液，在室溫下維持45分鐘至1小時使所述樣品絲化。3.在所述樣品中加入20jiL的DTT,在室溫下維持45分紳至1小時以中和所述樣品中殘余的碘乙酰胺。6.2.2存在洗滌劑時使用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測木瓜蛋白酶的消化1.將所述還原且變性的蛋白質(zhì)樣品用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25mL+225mLN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖'^)。2.將100pL的BSA樣品(步驟l)加入96孔微量滴定板的孔中。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化猨沖液、但J^瓜蛋白酶樣品和未消化的樣品(無木瓜蛋白酶)。所述測試由4孑L^品纟Jia^,用于寸t^！印icocconone的BSA蛋白酶解。對于其余的蛋白質(zhì)樣品(如脫鐵運(yùn)鐵蛋白、(x-膝蛋白和碳酸酐酶)以相同的方式制備三組樣品。3.將印icocconone用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(pH7.O)稀釋100倍。4.在每個相應(yīng)孔中加入100nL的工作熒光團(tuán)溶液。需要約90秒獲#^適的FluoStar增益設(shè)置。5.所述樣品然后在37。C下預(yù)孵育50分鐘。6.在所述測試中用4jaL木;^蛋白酶(-0.248單位/yL)消化蛋白質(zhì)樣品。7.FluoStar(Ex/Em=540±10/630±IO)每2^4中實(shí)時監(jiān)測熒狄生直至400^4中。8.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅含蛋白質(zhì)/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并JU^蛋白質(zhì)/木瓜蛋白酶/染料樣品中減去木瓜蛋白酶+緩沖液/染料。9.用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖并擬合一見圖6。6.3^t據(jù)分析和結(jié)果在該非限制性實(shí)施例中，我們證明了印icocconone可以被應(yīng)用測定非特異性蛋白酶一木瓜蛋白酶一的蛋白酶解。雖然木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，但是該方法也適用于絲氨酸蛋白酶、g蛋白酶(carboxyprotease)和金屬蛋白酶(metaloprotease)。木瓜蛋白酶具有廣泛的特異性(不同于胰蛋白酶和糜蛋白酶)，它完全消化大部分的蛋白質(zhì)樣品。本文示出BSA、酪蛋白、脫鐵運(yùn)鐵蛋白和碳酸酐酶的水解，它們作為具有不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的實(shí)例，可以通it^發(fā)明跟蹤它們的水解。圖6E顯示出用木瓜蛋白酶處理的蛋白質(zhì)樣品在120分鐘后被完全消化，而沒有用木瓜蛋白酶處理的蛋白質(zhì)顯示出對應(yīng)于M白質(zhì)分子量的帶。在某些情況下，在消化后還剩下某些不能被進(jìn)一步水解的較大的肽片段。圖6A-D顯示了根據(jù)本發(fā)明通過以下方式形成的進(jìn)程曲線，即使用熒光團(tuán)印icocconone無^J4和實(shí)時地JEP宗蛋白質(zhì)的水解。在每種情況下，對帶焚光團(tuán)的蛋白質(zhì)(方刻i^f亍單相指數(shù)式衰減(Y-i^^^exp(-kX)十平臺)擬合，并且k值作為固定kl值被應(yīng)用于蛋白質(zhì)加木瓜蛋白酶(三角)的^4目指數(shù)式衰減(Y-跨距hexp(-klX)+i^E￡2*exp(-k2X)+平臺)中。根據(jù)這些動力學(xué)數(shù)據(jù)，可以預(yù)測各種蛋白質(zhì)完全消化需要的時間，如10x半衰期(j^插圖中每種蛋白質(zhì)的半衰期)。觀察到的焚光的指數(shù)式減少可以通過以下原因進(jìn)行解釋，即蛋白質(zhì)樣品水解成的肽段的疏水性比原蛋白質(zhì)小很多，因而水解后失去疏水性。實(shí)施例7.存在非變性量的洗滌劑時用不同的熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測蛋白酶解7.1材料和設(shè)備按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。*BSA(100mMN,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，10mg/mL,Sigma-AldrichA3059)胰蛋白酶(lmMHC1中，20pg/20|iL，Sigma-AldrichT6567)*木;^蛋白酶(R0水中，2mg/mL，Sigma—AldrichP4762)參SDS,442444H)*碘乙酰胺(100mMN，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸中，1M，Sigma-Aldrich16125)*DTT(100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸中，200mM，BioRad161-0611)*透明底96孑Ul(Greinerbio-one，655096)SYPR0橙(x5000絲，InvitrogenS-6650)*尼羅紅(乙醇中，1mg/mL，Sigma-AldrichN-3013)ANS(DMSO中，10mM，Sigma-AldrichAl028)7.2方法7.2.1使用epicocconone、SYPRO橙、尼羅紅和^^J^t酸(ANS)監(jiān)測胰蛋白Sl和^J^蛋白H對蛋白質(zhì)的7lc解。7.2.l.l制備用于消化的BSA1.在pH8.4和pH7.0的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液中分別進(jìn)行胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的消化。2.用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備10mg/mL的BSA。3.將100jaL的所述BSA樣品應(yīng)用于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的消化。7.2.1.2絲和絲化BSA樣品被i^f、并凈ib^^化，如前述(6.2.1.2節(jié))。7.2.2存在洗滌劑時使用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測胰蛋白酶消化1.將所a原且變性的BSA樣品用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25pL+225jiLN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖:^)。2.將100pL的所述樣品(步驟l)加入96孑L微量滴定板的孔中。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化鍰沖液、^5U夷蛋白酶樣品或木瓜蛋白酶以及未消化的BSA樣品(無胰蛋白酶或者無木瓜蛋白酶)。對于一種熒光團(tuán)(如SYPRO橙)，測試由4孑L^品組組成。對于其余的熒光團(tuán)(如尼羅紅、印icocconone和SYPRO橙)以相同的方式制名^三組樣品。3.將SYPRO橙儲液用所述N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.4)稀釋5000倍。將尼羅紅和印icocconone儲液用100mMN,N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸(PH8.5)稀釋100倍。將ANS用所述N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH7.O)稀釋IOO倍。4.在每個相應(yīng)孔中加入100yL的工作熒光團(tuán)溶液(如SYPRO橙、尼羅紅、印icocconone和ANS)。尼羅M^印icocconone需要約30秒獲#^^適的FluoStar設(shè)置條件，SYPRO橙和ANS需要90秒。5.所述樣品接著在37X:下預(yù)孵育50^t。a)將用1mMHC1重新配制的胰蛋白酶(Sigma-AldrichT6567)以1:40的比例加入到所述待消化的樣品中。將相同量的酶加入僅包含緩沖^i且分的對照中。b)將4|iL的木瓜蛋白酶(2mg/mL)加入到所述待消化的樣品中。將相同量的酶加入僅包含緩沖液組分的對照中。6.<捐FluoStar(SYPR0橙的Ex/Em=485/600±10;印icocconone和尼羅紅的￡叉/￡111=540±10/630±10;ANS的Ex/Em=355/460)每2^4f實(shí)時監(jiān)測熒it^L生直至400分鐘。FluoStar設(shè)置如下溫度，37°C;10次閃光/循環(huán)。7.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅包含蛋白質(zhì)/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并J^蛋白質(zhì)/酶/染料樣品中減去酶+緩沖液/染料。用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖并擬合一見圖77.3數(shù)據(jù)分析和結(jié)果圖7顯示了使用4種不同的熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測蛋白酶解，如BSA/胰蛋白酶和BSA/木瓜蛋白酶。該實(shí)施例中的熒光團(tuán)的如下能力被測試，即測定一水解時)的k力。'。'、.；U、、標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)被應(yīng)用于Prism分析獲得速率常數(shù)。對于每種情況，對帶焚光團(tuán)的蛋白質(zhì)(空心方塊)進(jìn)行單相指數(shù)式衰減(Y-跨距,exp(-kX)+平臺)擬合，并且k值作為固定kl值^^用于蛋白質(zhì)加木瓜蛋白酶(空心圓)的二相指數(shù)式衰減(Y-i^距hexp(-klX)+躊3巨2豐exp(-k2X)+平臺)中。通過該方法，可以測定7jc解的速率常數(shù)并預(yù)測完全消化的時間點(diǎn)。圖7E是使用實(shí)際的實(shí)時樣品的SDS-PAGE對消化的獨(dú)立驗(yàn)證，顯示出存在不同的熒光團(tuán)時胰蛋白酶或木瓜蛋白酶對BSA的完全消化。從該圖可以看出，在120^4中后所述蛋白質(zhì)相關(guān)的條帶消失，僅可以看到殘余的木瓜蛋白酶或胰蛋白酶的微弱的條帶。在某些情況下，在消化后還剩下某些不能被進(jìn)一步水解的較大的肽片段。雖然本發(fā)明是通過參考M的實(shí)施例進(jìn)行描述的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可以以許多務(wù)他的形式實(shí)施^^發(fā)明。實(shí)施例8.^JU環(huán)境敏感的熒光團(tuán)并通itiL取樣監(jiān)測水解活性的替代方法8.1材料和設(shè)備*按照前文的實(shí)施例并有以下補(bǔ)充和/或替換。*Epicocconone(20%ACN/80%DMSO中，1mg/mL;Fluorotechnics)*蛋白質(zhì)樣品，牛血清白蛋白(A-3059,Lot083K1291)和碳酸酐酶(C-7025，Lot093K9310)*SDS,442444H)胰蛋白酶(lmMHC1中20yg/20"L;T6567,Sigma-Aldrich)*亮肽素(L2884，Lot064K86283，Sigma-Aldrich)*胰蛋白酶抑制劑(II-S型，T9128,Lot025K7014)8.2方法1.將胰蛋白酶抑制劑、亮Jli素和月夷蛋白酶抑制劑(大豆)分別制名-成^l度為1mM的R0水溶液和0.48mM的R0水溶液。2.蛋白樣品的制備如上述的實(shí)施例6。所i^原ili^化的蛋白樣品以1:10稀釋于100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.4-5)中。3.胰蛋白酶(4.62pg)以1:50的比例加入每個蛋白質(zhì)樣品(231pg/300jiL)中，所述樣品在37X:下孵育。4.收集亞樣品，以用于亮肽素或胰蛋白酶抑制劑(大豆)對胰蛋白酶活性的抑制研究。a.在0、10、20、30、60、60、90和120分鐘亞取樣45jliL的胰蛋白酶消化液并立即加到含5pL的1mM亮肽素的1.5mL管中。所述亮肽素抑制劑處理的亞樣品放置在室溫下直至讀取熒光。b.在0、10、20、30、60、60、90和120分鐘亞取樣45juL的胰蛋白酶消化液并立即加到含5pLU胰蛋白酶抑制劑的1.5mL管中。所述大豆胰蛋白酶抑制劑處理的亞樣品放置在室溫下直至讀取熒光。5.亮肽素抑制劑的對照包括僅N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液和含有胰蛋白酶或含有胰蛋白酶+亮肽素的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液。胰蛋白酶抑制劑(大豆)的對照也包括僅N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液和含有胰蛋白酶或含有胰蛋白酶+大豆胰蛋白酶抑制劑的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液。6.通過用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(pH8.4-8.5)以1:100稀釋制備印icocconone溶液。7.將上文制備的亞樣品(40pL)加到96孔板上，并且加入等體積的印icocconone溶液。將所ii^L插入FluoStar中，在37'C孵育50^4中。8.亞樣品的熒^^Ex/Em=540-10/630-10nm下(10次閃光)讀取。9.所述熒光值通it^所述亞樣品的原始熒光中減去相應(yīng)對照的基礎(chǔ)熒光進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。10.對所述標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，并顯示于圖8中。8.3數(shù)據(jù)分析和結(jié)果圖8顯示了在多個時間點(diǎn)亞取^樣的胰蛋白酶消化的BSA和CA的熒光衰減。在每個亞樣品中，所述胰蛋白酶活性或者被亮肽素(A)或者被大豆胰蛋白酶抑制劑(B)抑制。該替代方法的以下的可用性被測試，即用于監(jiān)測牛血清白蛋白(BSA)或碳酸酐酶(CA)胰蛋白酶的消化，并且該方法產(chǎn)生的熒光衰減的結(jié)果與實(shí)時測試(如實(shí)施例6)得到的結(jié)果類似。本方法中BSA和CA的消化速率似乎都比實(shí)時測試中的速率略高。這可能是由于所述抑制劑需要時間以完全抑制胰蛋白酶，或者是由于不存在熒光團(tuán)時所述胰蛋白酶的消化進(jìn)行得略快。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案包括在不存在染料的務(wù)fr下進(jìn)行水解消化。在本實(shí)施例中，兩種蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化可以通過以下方式進(jìn)行跟蹤進(jìn)行亞取樣并用蛋白酶抑制劑猝滅所述消化，然后加入所述染料并測定熒光?？紤]到對胰蛋白酶的抑制是時間依賴性的并且可能不完全，對BSA消化測定的準(zhǔn)一^Jl率常數(shù)(0.3分鐘_1)與實(shí)施例7的方法得到的(0.1-0.2^t—1)近似。實(shí)施例9:使用熒光報(bào)告染料實(shí)時監(jiān)測對復(fù)雜蛋白質(zhì)組的水解活性9.1材料和設(shè)備*按照上文的實(shí)施例7。參壓榨面包酵母(Compressedbaker，syeast)WicrobiogenPtyLtd,Australia)*NaOH(1M，Sigma-Aldrich480878)*FluoroProfile(Sig咖-AldrichFP0010)9.2方法9.2.1酵母制備1.將一小片壓榨面包酵母(IOOmg)用胰蛋白酶消化。2.將所述酵母片被懸浮于2mL的lMNaOH中。然后，以2100xg離心所述樣品IO分鐘。3.將一份所述上清液用RO水稀釋5倍以使NaOH的濃度減小至200mM。4.使用FluorProfile試劑^r測定蛋白質(zhì)含量為1.3mg/mL。5.將小份的所述蛋白質(zhì)提取物(15jaL)與85pL的N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(50mM,pH8.5)^給。6.將100jiL的終酵母樣品應(yīng)用于胰蛋白酶消化。9.2.2用印icocconone實(shí)時監(jiān)測酵母蛋白質(zhì)組的胰蛋白酶消化1.將100nL所述終酵母樣品加入微量滴定板孔中。對照包括基于N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸的消化援沖液、僅胰蛋白酶樣品和未消化的酵母樣品(無胰蛋白酶)。3.將epicocconone儲液用50mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸稀釋100倍。在每個孑L中加入100jiL稀釋的印icocconone溶液，進(jìn)行4-孑l/測試。FluoStar需要約30秒獲4f^適的設(shè)置IHt。4.以1:20的比例加入用1慮HC1重新配制的胰蛋白酶(Sigma-AldrichT6567)。5.>^JUFluoStar(Ex/Em=540±10/630±IO)每2^^中實(shí)時監(jiān)測熒狄生直至400分鐘。FluoStar設(shè)置如下溫度，37匸；10次閃光/循環(huán)。6.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅含蛋白質(zhì)的樣品中減去N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液，并JU^蛋白質(zhì)/胰蛋白酶樣品中減去胰蛋白酶+緩沖液。7.用Prism(GraphPadv.4)對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖一見圖13。對用印icocconone消化所述酵母蛋白質(zhì)組的進(jìn)程曲線進(jìn)行二相指數(shù)締合/解離(Y-Y最大"l-exp(-khX))+跨距"exp(-k2豐X))-底值)擬合，以得出kl(締合常奶和k2淋離常奶的值。這兩個值^用于對所述酵母蛋白組的胰蛋白酶消化進(jìn)行的三相指數(shù)式(等式Y(jié)-跨距l(xiāng)*(l-exp(—kl*X))+J^i^2*(exp(-k2*X))+跨距3*(l-exp(-k3*X))-底值)擬合，其中,上文得到的kl和k2不變，以導(dǎo)出k3的值。9.3^:據(jù)分析和結(jié)果酵母蛋^質(zhì)組)的水解活性的方法的可用性。圖f9顯示了利用疏水活'^染料印icocconone和洗滌劑SDS通過隨所述蛋白質(zhì)水解的熒光減少跟蹤胰蛋白酶對酵母蛋白質(zhì)組的消化，從而實(shí)時監(jiān)測所述消化。相反，在使用印icocconone并且無胰蛋白酶時酵母蛋白質(zhì)組樣品形成初始的熒光增加，這是由于印icocconone和所述蛋白質(zhì)的依賴于時間的締合；然后;U曼的指數(shù)式的減少，這是由于所述熒光團(tuán)和/或熒光團(tuán)-蛋白質(zhì)加合物(adduct)的光漂白和/或分解。這可以用二相指數(shù)式締合/解離模擬以得到這些過程的準(zhǔn)一級速率常數(shù)。然后可將這些值應(yīng)用于通過非線性回歸確定所述復(fù)雜混合物水解的準(zhǔn)一級速率常數(shù)。來自所述二相指數(shù)式締合/解離(實(shí)心方塊)非線性擬合的留數(shù)(residue)表明，報(bào)告染料和蛋白組之間締合的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論吻合得很好。與之類似，三相指數(shù)式的殘差(residual)顯示出同樣好的吻合度(實(shí)心圓)，it^明測得的復(fù)雜蛋白質(zhì)組水解準(zhǔn)一級速率常數(shù)(k3)是被精確測定的。實(shí)施例10.存在和不存在洗滌劑時用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測蛋白酶解該實(shí)施例涉及在水解的實(shí)時監(jiān)測中洗滌劑對疏水活性染料的熒光輸出的影響。10.1材料和設(shè)備參如實(shí)施例610.2方法10.2.1存在和不存在SDS時用印icocconone監(jiān)測碳酸酐酶(CA)的水解10.2.1.1制備用于消化的BSA1.在N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.4)中進(jìn)行胰蛋白酶消化2.用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液制備10mg/mL的蛋白質(zhì)樣品。3.將100jaL的所述蛋白質(zhì)樣品應(yīng)用于胰蛋白酶消化。10.2.1.2還原和^i^f匕1.在100iuL蛋白質(zhì)樣品中加入ljiL的10。/。SDS和5jiL的DTT儲液，并在80"C下維持10^4中使所述樣品還原。2.另一份樣品僅用5pL的DTT儲液(無SDS)在801C下維持10^4中i^f3.在所述樣品中加入4yL碘乙^tJ^液，在室溫下維持45^4中至1小時使所述樣品絲化。4.在所述祥品中加入20mL的DTT,在室溫下維持45分紳至1小時以中和所述樣品中殘余的碘乙,。10.2.2存在或不存在洗滌劑時使用熒光團(tuán)實(shí)時監(jiān)測胰蛋白酶的消化10.將所述還原且變性的蛋白質(zhì)樣品用100mMN，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖液稀釋10倍(25pL+225pLN，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸緩沖紀(jì)。11.將100iiL的CA樣品(步驟l)加入96孑L微量滴定板的孔中。對照包括基于N，N-雙(2-鞋乙基)甘氨酸的消化猨沖液、仫木瓜蛋白酶樣品和未消化的樣品(無木瓜蛋白酶)。所述測試由4-:L^品組組成，用于使用epicocconone的CA蛋白酶JC解。12.將印icocconone用IOO慮N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(pH8.4)稀釋100倍。13.在每個相應(yīng)孔中加入100jiL的工作熒光團(tuán)溶液。需要約90秒獲*適的FluoStar增益i殳置。14.在測試中，所述蛋白質(zhì)樣品用4pL的胰蛋白酶溶液消化。15.4^FluoStar(Ex/Em=540±10/630±IO)每2^4中實(shí)時監(jiān)測熒狄生直至400^K16.進(jìn)程曲線在MicrosoftExcel中進(jìn)行減去對照的處理。從僅包含蛋白質(zhì)/染料的樣品中減去緩沖液/染料，并JU^蛋白質(zhì)/木瓜蛋白酶/染料樣品中減去木;^蛋白酶+緩沖液/染料。17.用Prism(GraphPadv.4)對所述標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)作圖并擬合一見圖6。10.3數(shù)據(jù)分析和結(jié)果進(jìn)程曲線如實(shí)施例6進(jìn)行擬合(圖10)。當(dāng)存在非變性量的洗滌劑(空心方塊)時，碳酸酐酶(CA)變得更加疏水，并且在接觸例如epicocconone等環(huán)境敏感的熒光團(tuán)的時候熒光增加。在加入胰蛋白酶后，所述熒iti^it減少，如上文實(shí)施例6;而對于不含SDS的樣品(倒三角)，熒光變化比存在SDS時(空心圓)減小超過50%。在兩種情況中觀察到的速率常數(shù)相近似(0.025分鐘一1),而無sds的祥品的95%置信區(qū)間則大得多，這是因?yàn)樗男盘枏?qiáng)jyn氐得多。該實(shí)施例證明了少量的洗滌劑在使用疏水活性的熒光團(tuán)對水解活性的實(shí)時監(jiān)測中的重要性。權(quán)利要求1.一種測定水解試劑的活性的方法，包括步驟1在存在一種熒光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下；以及步驟2隨時間監(jiān)測所述染料的熒光，其中熒光隨時間的變化指示所述水解試劑對所述生物分子的消化。2.—種確定水解試劑對生物分子的消化的終點(diǎn)的方法，包括步驟1:在存在一種熒光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下；以及步驟2:隨時間監(jiān)測所述染料的熒光變化，其中熒光不再出現(xiàn)進(jìn)一步的變化時即表示對所述生物分子消化的終點(diǎn)。3.—種監(jiān)測水解試劑對生物分子的消化的方法，包括步驟l:使一種生物分子與一種水解試劑接觸形成反應(yīng)混合物，步驟2:使所述反應(yīng)混合物的第一樣品與一種熒光染料接觸并測定第一樣品的熒光，步驟3:使步驟1的所述反應(yīng)混合物處于使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下，并步驟4:在所述生物分子的消化過程中的所需時間點(diǎn)，使所述反應(yīng)混合物的第4品與一種熒光染料接觸；以及步驟5:測定所述第二樣品的熒光，其中所述第4品的熒^目對于所述第一樣品的熒光的變化，指示所述水解試劑對所述生物分子消化的程度。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，根據(jù)需要還包括下述步驟在消化過程中還定期對所述反應(yīng)混合物取樣，并J^E每個附加的樣品中加入一種熒光染料后測定所述附加的樣品的熒光。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，包括對所述混合物重復(fù)取樣，加入所述染料并測定所述熒光，直至觀察到的熒光不再變化。6.根據(jù)權(quán)利要求3-5的任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品被猝滅。7.—種測定和/或檢測水解消化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括步驟l:對一種生物分子進(jìn)行水解消化以獲得蛋白或肽片段，步驟2:使所述蛋白或肽片段與一種熒光染料接觸，以及步驟3:檢測所述染料的熒光變化。其中所述的染料的熒光變化與所述蛋白或肽片段的量成比例。8.根據(jù)前i^K利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子是生物大分子。9.根據(jù)前a利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子是可水解的。10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子選自于碳水化合物、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)，以及它們的混合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述生物分子存在于基因組、蛋白質(zhì)組或細(xì)胞"^取物中。12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述水解試劑改變了所述生物分子的疏水性。13.根據(jù)前i^5l利要求任一項(xiàng)的方法，其中加入非變性量的洗滌劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述洗滌劑選自于SDS、LDS、曲MX-100、CHAPS、ALS、CTAB、DDA0和D0C。15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中所述洗滌劑的加入改變了所述生物分子的疏水性，從而影響所述熒光染料與所述生物分子的結(jié)合。16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述水解試劑是酶。17.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中所述水解試劑是能夠在至少一個位置切割所述生物分子的蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶或核酸酶。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述蛋白酶選自于^JiW、二自、二J!iiJ!iJl和三tt自、Jli^自、絲氨酸型m^、金屬^SI、半J3^^^mW、co自、絲氨酸內(nèi)自、半a酸內(nèi)自、天冬氨酸內(nèi)自、^r屬內(nèi)ltSl、蘇氨酸內(nèi)自。19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述酯酶選自于羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸單酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸單酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸單酯水解酶、磷酸三酯水解酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸外切酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的核糖核酸外切酶、產(chǎn)生3，-磷酸單酯的核糖核酸外切酶、對核糖核酸或脫IUt糖核酸有活性的外切核酸酶、對核糖核酸或脫，糖核酸有活性的外切核酸酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、產(chǎn)生非5，-磷酸單酯的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、對改變的g具有特異性的位點(diǎn)特異性脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、產(chǎn)生5，-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶、產(chǎn)生非5，-磷酸單酯的核糖核酸內(nèi)切酶、對核糖核酸或脫，糖核酸有活性的核糖核酸內(nèi)切酶、對核糖核酸或脫,糖核酸有活性的核糖核酸內(nèi)切酶。20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所聰基化酶選自于糖苷酶(水解N老基、(HtJ^S^t基基團(tuán)的酶)。21.根據(jù)權(quán)利要求7-20任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光染料與所述生物分子疏水地結(jié)合或相互作用。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述熒光染料對其環(huán)境的親脂性的反應(yīng)是其熒光行為的顯著改變。23.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光染料選自于epicocconone、花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物、ANS及其類似物、苯乙烯染料、兩親熒光素、羅丹明和香豆素。24.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光染料選自于印icocconone、SYT0X綠、Hoechst33342、>5^(匕丙咬、BODIPYFLC5神經(jīng)i^、5-十八i^iJL4熒光素、SYPRO,尼羅紅。25.根據(jù)前#利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述水解在存在一種緩沖劑的條件下進(jìn)行。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述緩沖劑是一種Good緩沖劑。27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述緩沖劑是一種N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖劑。28.根據(jù)前a利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子的水解基本上不受所述熒光染料的影響。29.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中隨時間測定熒光以提供表示反應(yīng)速率系數(shù)的數(shù)據(jù)。30.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在達(dá)到終點(diǎn)時終止消化。31，根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中在終止消化以后進(jìn)一步分析所述反應(yīng)混合物。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中進(jìn)一步分析選自于順量指紋傳法(PMF)、肽譜法和HPLC。33.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，還包括在所述熒光染料中加入堿。34.根據(jù)前i^5L利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述生物分子來自生物樣品或食口拔口口p旰口口o35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的混合物。36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是碳水化合物或碳水化合物的混合物。37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是糖蛋白或淀粉。38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子;O旨質(zhì)。39.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是植物油。40.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是寡核苷酸。41.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物分子是DNA。42.—種用于根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法中的試劑盒，包括熒光染料，一種或多種水解試劑，任選地包括所述水解試劑的標(biāo)準(zhǔn)底物，和如何使用所述試劑盒監(jiān)測所述生物分子的消化的"i兌明書。43.根據(jù)權(quán)利要求42的試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或肽底物。44.根據(jù)權(quán)利要求43的試劑盒，其中所述底物選自于BSA、脫鐵運(yùn)鐵蛋白、oc-i^白、p-妙白、碳酸酐酶、胎球蛋白、鮭魚精DNA、可溶淀#艦油。45.根據(jù)權(quán)利要求42-44任一項(xiàng)的試劑盒，還包括緩沖劑。46.根據(jù)權(quán)利要求45的試劑盒，其中所述緩沖劑是一種Good緩沖劑。47.根據(jù)權(quán)利要求45的試劑盒，其中所述緩沖劑是一種N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸緩沖劑。全文摘要本發(fā)明涉及測定水解試劑的活性的方法，包括在存在一種熒光染料的條件下使一種生物分子與一種水解試劑接觸，并處于可使所述水解試劑能夠消化所述生物分子的條件下。隨時間監(jiān)測所述染料的熒光，熒光的變化指示所述水解試劑對所述生物分子的消化。所述生物分子優(yōu)選是蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)組，但也可以是碳水化合物、寡核苷酸或脂質(zhì)。還涉及確定水解試劑消化生物分子的終點(diǎn)的方法，以及監(jiān)測水解試劑消化生物分子的方法?？梢詫?shí)時地或通過取樣進(jìn)行對所述反應(yīng)混合物的監(jiān)測。本發(fā)明還涉及實(shí)現(xiàn)所述方法的試劑盒。文檔編號G01N33/68GK101351706SQ200680049712公開日2009年1月21日申請日期2006年11月3日優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日發(fā)明者P·H·卡羅森,崔弘侖申請人:福羅若技術(shù)有限公司