一種具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)的制備方法，包括下述步驟1)和2)：1)制備表達(dá)所述蛋白質(zhì)的重組生物細(xì)胞；2)表達(dá)所述重組生物細(xì)胞，得到所述蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質(zhì)；b)將SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質(zhì)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)；所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的生產(chǎn)唾液酸水解酶的方法具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
【專利說(shuō)明】一種具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中一種具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)被證明具有顯著的神經(jīng)修護(hù)及再生活性，是神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)損傷的良好的治療藥物，目前已被應(yīng)用于阿爾茨海默癥、帕金森癥等疾病的治療中。由于生產(chǎn)技術(shù)的制約，GMl的價(jià)格非常昂貴，而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，GMl用藥周期較長(zhǎng)，一個(gè)療程最少也要三個(gè)月，如此一來(lái)，治療費(fèi)用大幅增加，導(dǎo)致GMl普遍應(yīng)用受到限制。
[0003]目前，GMl的生產(chǎn)主要是從動(dòng)物腦組織，如豬腦、牛腦中進(jìn)行提取。提取時(shí)用到大量的氯仿、甲醇等有機(jī)試劑，造成了環(huán)境污染。此外，由于豬腦組織的神經(jīng)節(jié)苷脂(gangliosides,GLS)中，GMl的含量較低，僅為10-20%，大部分是多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，如⑶la、⑶lb、⑶3和GTlb等。直接提取時(shí)大部分的多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂被當(dāng)作廢棄物丟棄掉，最后提取得到的GMl還不到神經(jīng)節(jié)苷脂總脂的10%，一方面造成了豬腦原材料的浪費(fèi)，另一方面也增加了成本。
[0004]豬腦中多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂⑶la、⑶Ib和GTlb的含量占總神經(jīng)節(jié)苷脂的50-60%。對(duì)比各種神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)可知，GMl可通過(guò)水解⑶la，⑶Ib和GTlb的唾液酸殘基得到。以往，有研究者通過(guò)部分酸水解豬腦神經(jīng)節(jié)苷脂(gangliosides，GLS)來(lái)制備GMl0但酸水解的穩(wěn)定 性差，不同批次之間質(zhì)量不穩(wěn)定。此外，酸水解的專一性差，容易產(chǎn)生副產(chǎn)物，造成了 GMl產(chǎn)率偏低，且后續(xù)的產(chǎn)品分離純化比較困難。也有研究者利用GLS作為誘導(dǎo)劑，與唾液酸水解酶產(chǎn)生細(xì)菌共同培養(yǎng)，通過(guò)這些細(xì)菌分泌的唾液酸水解酶來(lái)生物轉(zhuǎn)化GLS，制備GM1。生物轉(zhuǎn)化與酸水解相比，具有條件溫和、專一性好等優(yōu)越性。但是由于細(xì)菌分泌的唾液酸水解酶一般是誘導(dǎo)酶，即使用GLS進(jìn)行誘導(dǎo)，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了這一生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的效率很低，這一生產(chǎn)過(guò)程不適合放大，不適用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。此外，細(xì)菌菌種容易出現(xiàn)退化、變異等問(wèn)題，給生產(chǎn)過(guò)程增添了不穩(wěn)定性?，F(xiàn)在急需通過(guò)基因工程的手段，直接克隆和表達(dá)所需要的酶的基因，實(shí)現(xiàn)GMl的穩(wěn)定制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法，由該方法制備的唾液酸水解酶能將GLS轉(zhuǎn)化為GMl。
[0006]本發(fā)明所提供的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法，包括將Cce sia-1的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的步驟；
[0007]所述Cce sia-Ι，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì):
[0008]a)氨基酸序列是SEQ ID N0.2的蛋白質(zhì)；
[0009]b)氨基酸序列是SEQ ID N0.4的蛋白質(zhì)；
[0010]c)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)；
[0011]d)將SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)；
[0012]所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。
[0013]其中，SEQ ID N0.2由703個(gè)氨基酸殘基組成，是天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名稱為N Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4由724個(gè)氨基酸殘基組成，是重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名稱為R Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4是在SEQ ID N0.2的氨基末端添加氨基酸序列:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。
[0014]上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將SEQ IDN0.1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.1所示的信號(hào)肽的編碼序列得到。上述d)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述d)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將SEQ IDN0.3所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.3所示的His-Tag的編碼序列得到。
[0015]上述方法中，所述將Cce sia-Ι的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)包括將所述Ccesia-Ι的編碼基因?qū)胨錾锛?xì)胞的步驟。
[0016]上述方法中，所述Cce sia-Ι的編碼基因可通過(guò)含有所述Cce sia-Ι的編碼基因的重組載體導(dǎo)入所述生物細(xì)胞。
[0017]上述方法中，所述Cce Sia-1的編碼基因可為如下I)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子:
[0018]I)編碼序列是序列表中SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0019]2)核酸序列是序列表中SEQ ID N0.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；
[0020]3)編碼序列是序列表中SEQ ID N0.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0021]4)與I)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼Ccesia-Ι的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0022]5)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼Cce sia-Ι的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0023]其中，SEQ ID N0.1由2217個(gè)核苷酸組成，SEQ ID N0.1的第1-105位核苷酸編碼信號(hào)肽，SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸編碼SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)21中的Cce sia_l基因的基因組基因編碼SEQ ID N0.2的蛋白質(zhì)。SEQ ID N0.3由2175個(gè)核苷酸組成，編碼SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID N0.3的第1-63位核苷酸為pET-28a(+)載體上的序列，SEQ ID N0.3的第13-30位核苷酸編碼His-Tag, SEQ ID N0.3的第64-2175位核苷酸編碼SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0024]上述方法中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。
[0025]上述方法中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。[0026]上述方法中，所述大腸桿菌可為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，所述重組載體可為用SEQ ID N0.1的第106-2217位所示的DNA分子替換pET_28a(+)的Nde I和BamH I識(shí)別位點(diǎn)間的片段得到的重組載體pET-28a/Cce sia-1.[0027]上述方法中，所述將Cce sia-Ι的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)包括將所述重組載體pET-28a/Cce sia-1導(dǎo)入所述大腸桿菌E.coli BL21(DE3)得到重組大腸桿菌，使所述Cce sia-Ι的編碼基因在所述重組大腸桿菌中表達(dá)得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)。
[0028]上述方法中，使所述Cce sia-Ι的編碼基因在所述重組大腸桿菌中表達(dá)得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)包括以下步驟:將所述重組大腸桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在條件I下進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，將該發(fā)酵液命名為發(fā)酵液1，向發(fā)酵液I中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，在條件2下培養(yǎng)4-30小時(shí)誘導(dǎo)所述Cce sia-Ι表達(dá)，得到發(fā)酵液，將該發(fā)酵液命名為發(fā)酵液2，將所述發(fā)酵液2進(jìn)行離心，得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)。
[0029]上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由水和溶質(zhì)組成，pH為6-8，所述溶質(zhì)及其濃度為0.5%-3% (質(zhì)量百分比濃度)胰蛋白胨、0.1%-1% (質(zhì)量百分比濃度)酵母提取物、0.5% -3% (質(zhì)量百分比濃度)NaCl、0.5%-3% (體積百分比濃度)甘油、0.01%-0.5%(質(zhì)量百分比濃度)磷酸二氫鉀、0.1%-0.5% (質(zhì)量百分比濃度)磷酸氫二鉀、0.1%-0.5% (質(zhì)量百分比濃度)硫酸鎂；所述溶質(zhì)及其濃度具體可為I % (質(zhì)量百分比濃度)胰蛋白胨、0.5% (質(zhì)量百分比濃度)酵母提取物、1% (質(zhì)量百分比濃度)NaCl、I %(體積百分比濃度)甘油、0.14% (質(zhì)量百分比濃度)磷酸二氫鉀、0.24% (質(zhì)量百分比濃度)磷酸氫二鉀、0.25% (質(zhì) 量百分比濃度)硫酸鎂。
[0030]上述方法中，所述條件I為:培養(yǎng)溫度28-42 °C，空氣流量為l_6L/min，壓力為0.01-0.1MPa, pH為6-8 ;或培養(yǎng)溫度30-37 °C，空氣流量為2_5L/min，壓力為0.03-0.08MPa, pH為6.5-7.5 ;具體可為:培養(yǎng)溫度37 °C，空氣流量為3L/min，壓力為0.05MPa, pH 為 7.2。
[0031]上述方法中，所述條件2為:培養(yǎng)溫度15-42 °C，空氣流量為l_6L/min，壓力為0.01-0.1MPa, pH為6-8 ;或培養(yǎng)溫度20-37 °C，空氣流量為2_5L/min，壓力為0.03-0.08MPa, pH為6.5-7.5 ;具體可為:培養(yǎng)溫度25 °C，空氣流量為3L/min，壓力為
0.05MPa, pH 為 7.2。
[0032]本發(fā)明還提供了制備唾液酸水解酶的制備方法。
[0033]本發(fā)明所提供的唾液酸水解酶的制備方法，包括從上述具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)中純化得到Cce sia-Ι的步驟，所述Cce sia-Ι為唾液酸水解酶?？衫肗i柱親和層析法從所述具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)中純化得到所述Cce sia-lo
[0034]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備的唾液酸水解酶Cce sia-Ι具有明顯的高比唾液酸水解酶酶活，比野生型菌株提高了 10-100倍，其比活力達(dá)42IU/mg蛋白。本發(fā)明制備的唾液酸水解酶Cce sia-Ι可以神經(jīng)節(jié)苷脂作為底物進(jìn)行催化反應(yīng)得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)。利用本發(fā)明制備的Cce sia-Ι生產(chǎn)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂，反應(yīng)條件溫和，對(duì)設(shè)備要求低，生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效、專一的選擇性，且轉(zhuǎn)化率高，達(dá)到95 %，生物轉(zhuǎn)化速率快，在2h內(nèi)即可完成，此法生產(chǎn)GMl無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生，純化方便。反應(yīng)絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環(huán)保，并實(shí)現(xiàn)了 GMl的穩(wěn)定制備，解決了傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化與酸水解制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的產(chǎn)量低、原料浪費(fèi)、成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的生產(chǎn)唾液酸水解酶的方法在制備單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂中具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
[0035]牛物材料保藏說(shuō)明
[0036]生物材料的分類命名:纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)
[0037]生物材料的菌株編號(hào):21
[0038]生物材料的保藏單 位名稱:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0039]生物材料的保藏單位簡(jiǎn)稱:CGMCC
[0040]生物材料的保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101
[0041]生物材料的保藏日期:2013年05月14日
[0042]生物材料的保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)=CGMCC N0.7587
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1為Cce sia-Ι基因的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為DNA marker,泳道2為Cce sia-Ι基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0044]圖2為重組載體pET_28a/Cce sia-1的Nde I和BamH I雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為pET-28a (+)的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物，泳道2為DNA marker,泳道3為pET-28a/Cce sia-1的Nde I和BamH I雙酶切產(chǎn)物。
[0045]圖3為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的聚丙酰胺凝膠電泳圖。其中，泳道I為蛋白質(zhì)分子量marker，泳道2為重組菌pET_28a/E.co I i BL21 (DE3)誘導(dǎo)前總蛋白溶液；泳道3為重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)后總蛋白溶液;泳道4為重組菌pET_28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)誘導(dǎo)前總蛋白溶液；泳道5為重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coliBL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后總蛋白溶液；泳道6為Ni柱純化后的Cce sia-Ι蛋白。
[0046]圖4為重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι水解豬腦神經(jīng)節(jié)苷脂GLS的反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC-氨基柱分析圖譜。其中，曲線a為神經(jīng)節(jié)苷脂標(biāo)準(zhǔn)品圖譜；曲線b為神經(jīng)節(jié)苷脂GLS圖譜；曲線c為神經(jīng)節(jié)苷脂GLS轉(zhuǎn)化2h后的圖譜。
[0047]圖5為重組表達(dá)載體pET_28a/Cce sia-1的構(gòu)建示意圖。
[0048]圖6為重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物學(xué)特性。其中，a為最適pH曲線；b為PH穩(wěn)定性曲線；c為最適溫度曲線；d為溫度穩(wěn)定性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0050]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0051]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052]纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21由東北師范大學(xué)從土壤中篩選得到，于2013年5月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.7587。
[0053]實(shí)施例1、唾液酸水解酶重組載體的構(gòu)建
[0054]將來(lái)自纖維菌(Cellulosimicrobiumsp.)21 (保藏號(hào)為 CGMCC N0.7587)的唾液酸水解酶的多核苷酸(SEQ ID N0.1)通過(guò)PCR的方式獲得，克隆到表達(dá)載體pET_28a中，得到可以表達(dá)唾液酸水解酶的重組質(zhì)粒。具體步驟包括:
[0055]I)纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21基因組DNA的提取:將纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21在LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 V活化12h?；罨木N接一環(huán)至LB液體培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm振蕩培養(yǎng)12h。6000rpm、4 V離心10min收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，按照說(shuō)明書提取纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 基因組 DNA。
[0056]2) Cce sia-Ι 基因的擴(kuò)增:
[0057]以纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增Ccesia-Ι 基因。擴(kuò)增引物為:Primer-FS' -GGAATTCCATATGCACCACACGACCCTCGCCCCC-3' ；Primer-R5' -CGGGATCCTCATCAGGACCAGTCGGTCGCCA-3'。擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性30s ;98°C 10s，65°C 40s, 72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin0 I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，如圖1所示。對(duì)獲得的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得的片段含有SEQ ID N0.1所示的DNA分子，SEQ ID N0.1所示的DNA分子是天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι的編碼序列，編碼SEQ ID N0.2所示的唾液酸水解酶Cce sia-Ι，將該天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名為N Cce sia-lo
[0058]3)重組載體 pET_ 28a/Cce sia-1 的構(gòu)建
[0059]如圖5所示，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamHI (New England Biolabs)酶切回收的 PCR 產(chǎn)物與 pET~28a (+)載體(Novegan)(圖 2),酶切結(jié)束后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收酶切產(chǎn)物。膠回收試劑盒回收的經(jīng)過(guò)相同酶切處理的pET-28a(+)載體與PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶(TAKARA，2011A)的作用下連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，篩選陽(yáng)性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，驗(yàn)證序列的正確性。將用SEQ ID N0.1的所示Cce sia-Ι基因替換pET_28a(+)的Nde I和BamH I位點(diǎn)間的片段(保持pET_28a (+)的其它序列不變)得到的重組載體命名為pET_28a/Cce sia-lo將含有pET_28a/Cce sia_l重組表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆命名為重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)。重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)表達(dá)SEQ ID N0.4所示的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι，將該重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名為R Cce sia-l0 SEQ ID N0.4的第22-724位氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。pET-28a/Cce sia-1中含有SEQ ID N0.4第1-2175位核苷酸所示的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的編碼基因。
[0060]將空載體一pET_28a(+)載體導(dǎo)入Ε.coli BL21 (DE3)得到含有pET_28a(+)的重組菌pET-28a/E.coli BL21 (DE3)，作為空載體對(duì)照菌。
[0061]實(shí)施例2、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的制備
[0062]1、將實(shí)施例1 的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)接種于含 50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。挑一環(huán)接種到60ml含有50 μ g/ml卡那霉素的LB與I %甘油的液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)至0D600為2.0 (以含有50 μ g/ml卡那霉素的LB與1%甘油的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)，即為種子液。將種子液按照1:50的比例接種到3L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，其溶質(zhì)及濃度為:1% (質(zhì)量百分比濃度)胰蛋白胨、0.5% (質(zhì)量百分比濃度)酵母提取物、1% (質(zhì)量百分比濃度)NaCl、I %(體積百分比濃度)甘油、0.14% (質(zhì)量百分比濃度)磷酸二氫鉀、0.24% (質(zhì)量百分比濃度)磷酸氫二鉀、0.25% (質(zhì)量百分比濃度)硫酸鎂，ρΗ7.0)，在寶興FUS-5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)溫度37°C，空氣流量3L/min，壓力0.05MPa,轉(zhuǎn)速160rpm，氨水調(diào)pH，使發(fā)酵過(guò)程中PH保持在7.2。發(fā)酵過(guò)程中溶氧上升時(shí)開始補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基的溶劑為水，其溶質(zhì)及濃度為:35% (體積百分比濃度)甘油、5% (質(zhì)量百分比濃度)蛋白胨和2% (質(zhì)量百分比濃度)酵母抽提粉。待OD600到達(dá)18-20(以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照)時(shí)降溫至25°C，并加
0.4mM IPTG誘導(dǎo)12h。誘導(dǎo)結(jié)束后，5000rpm離心10min收集菌體，用PBS洗菌體I次后重新懸浮在IL的PBS緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，15000g、4°C離心30min，收集上清液，上清液即為重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液。同時(shí)取誘導(dǎo)前的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21菌體，用PBS洗菌體I次后重新懸浮在IL的PBS緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，15000g、4°C離心30min，收集上清液，得到重組菌pET_28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液。
[0063]2、按照本實(shí)施例中步驟I的方法，將實(shí)施例1的重組菌pET-28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)替換為重組菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)，其它步驟不變，分別得到重組菌 pET-28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液和重組菌 pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液。
[0064]3、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的純化
[0065]在重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液中加入咪唑使其終濃度為10mM，得到總蛋白的咪唑溶液，將總蛋白的咪唑溶液與20ml的Ni Sepharosefastflow凝膠(GE healthcare)在4°C條件下緩慢振蕩30min,得到蛋白-凝膠混合物,將蛋白-凝膠混合物裝入直徑為1.6cm、高IOcm的玻璃層析柱中。然后用2倍層析柱體積的IOmM咪唑/PBS溶液洗脫，再用5倍層析柱體積的250mM的咪唑/PBS溶液洗脫。收集250mM咪唑洗脫的級(jí)分，得到含有重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶液，用截留分子量為IOkDa的超濾膜(Millipore公司產(chǎn)品)除去酶液中的咪唑,得到純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-lo
[0066]4、將重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液、重組菌 pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液、重組菌 pET_28a/E.coliBL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液、重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液和純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，表明只有重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液和純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι和重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液中有75kDa的蛋白(即Cce sia-Ι)條帶，重組菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液和重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)前總蛋白溶液均沒(méi)有該75kDa的蛋白(即 Cce sia-Ι)條帶。
[0067]用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)誘導(dǎo)后總蛋白溶液的蛋白含量為39.9mg/ml。
[0068] 5、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活性的測(cè)定[0069]I)以突光底物 2 ' - (4-Methylumbelliferyl) - a -D-N-acetylneuraminicacid sodium salt hydrate (4_MU_NeuAc)檢測(cè)重組唾液酸水解酶Cce sia-1和野生型菌株唾液酸水解酶的酶活力。唾液酸水解酶酶活力測(cè)定體系為:100 μ I反應(yīng)體系中，依次加入10μ I適當(dāng)稀釋的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液或重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白溶液或野生型菌株纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 的總蛋白溶液，10 μ 14-MU-NeuAc (ImM)和 80 μ I Tris-HCl 緩沖液(50mM, ρΗ7.5)，37°C反應(yīng)10min后，加入100 μ IlM NaOH終止反應(yīng)。參照4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算唾液酸水解酶的酶活。
[0070]唾液酸水解酶的酶活單位(IU)定義為每分鐘催化底物生成I μ mo 14-MU所需要的酶量為1IU。
[0071]根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果計(jì)算得到的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活為17IU/mg總蛋白，重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白并無(wú)唾液酸水解酶酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cce sia-Ι蛋白具有唾液酸水解酶酶活，證明Cce sia-Ι蛋白為唾液酸水解酶。
[0072]重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活為17IU/mg總蛋白，野生型菌株纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21總蛋白中唾液酸水解酶酶活為0.25IU/mg總蛋白，表明重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導(dǎo)后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活是野生型菌株總蛋白中唾液酸水解酶的酶活的68倍，說(shuō)明重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導(dǎo)后的總蛋白具有更高的唾液酸水解酶酶活。其中，總蛋白含量均用用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定。
[0073]2)將純化的重 組唾液酸水解酶Cce sia-Ι按照上本實(shí)施例中步驟5中I)的測(cè)定酶活的方法測(cè)定唾液酸水解酶酶活，結(jié)果表明純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的唾液酸水解酶比活力為42IU/mg蛋白。
[0074]實(shí)施例3、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物學(xué)特性
[0075]1、溫度對(duì)重組唾液酸水解酶活力的影響
[0076]在20_80°C水浴中，以4-MU-NeuAc為底物，按照實(shí)施例2中步驟5中的I)的方法測(cè)定純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組唾液酸水解酶Ccesia-Ι的最適反應(yīng)溫度為45°C (圖6中b)。
[0077]2、pH對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活力的影響
[0078]將適當(dāng)稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι與底物4-MU-NeuAc在不同PH值的緩沖液中，37 °C條件下反應(yīng)lOmin，測(cè)定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι在不同PH條件下的酶活力。采用的緩沖液分別為:50mM NaAc-HAc緩沖液，pH2.0-6.0 ；50mMNa2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 緩沖液，pH7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 緩沖液，pH9.0-11.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的最適pH值為5.0 (圖6中a) ο
[0079]3、溫度對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι穩(wěn)定性的影響
[0080]將純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別在20、30、35、40、45、50、60°C的水浴中保溫Ih測(cè)定酶活力。以未處理的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι作為對(duì)照(酶活為100% )。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別在20、30、35、40、45、50、60°C保溫Ih后，其殘余酶活力分別為73%、82%、66%、6.2%,3.5%,4.0%,6.4% (圖6中d)。
[0081]4、pH對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι穩(wěn)定性的影響
[0082]將10 μ I適當(dāng)稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液與50 μ I濃度為IOOmM的各種不同pH值(4.0-11.0)的緩沖液混合(采用的緩沖液分別為:50mM NaAc-HAc緩沖液，ρΗ4.0-6.0 ；50mM Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 緩沖液，ρΗ7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 緩沖液，pH9.0-11.0)，分別在 4°C冰箱中保溫 Ih 后，取 10 μ I 保溫后的酶液測(cè)定殘余酶活。對(duì)照組為10 μ I適當(dāng)稀釋的酶液與50 μ I去離子水混合(酶活為100% )，結(jié)果表明重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι在ρΗ4.0-11.0范圍內(nèi)保溫Ih后，仍保留60%以上的酶活力(圖6中c)。
[0083]5、金屬 離子或化學(xué)試劑對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活性的影響
[0084]將金屬離子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Ba2+和Mn2+分別與適當(dāng)稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合,每種金屬離子的終濃度均有兩種,分別為5mM和50mM。在4°C保溫Ih后，以4-MU-NeuAc作為底物，測(cè)定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的殘余的酶活力。將常用化學(xué)試劑DTT、EDTA和SDS分別與適當(dāng)稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合，每種化學(xué)試劑的終濃度均有兩種，分別為5mM和50mM，在4°C保溫Ih后，以4-MU-NeuAc作為底物,測(cè)定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的殘余的酶活力。在測(cè)定金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)重組唾液酸水解酶活性的影響中，均將未處理的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液的酶活設(shè)定為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5mM K+、5mMHg2+、5mM Ba2+、5mM Mn2+和 5mM DTT 對(duì)重組唾液酸水解酶 Cce sia-1 有激活作用，50mM K+、50mMCa2\50mM Mg2+、和50mM Ba2+部分抑制了重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活，5mM Fe3\50mMFe3\50mM Cu2\50mM Hg2+、5mM SDS 和 50mM SDS 嚴(yán)重抑制了重組唾液酸水解酶 Cce sia-Ι 的酶活，其余金屬離子Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+和化學(xué)試劑EDTA對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活抑制程度較輕或幾乎無(wú)影響。
[0085]表1、不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶活的影響
【權(quán)利要求】
1.具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法，包括將CceSia-1的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)的步驟； 所述Cce sia-Ι，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì): a)氨基酸序列是SEQID N0.2的蛋白質(zhì)； b)氨基酸序列是SEQID N0.4的蛋白質(zhì)； c)將SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)； d)將SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)； 所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述將Ccesia-Ι的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)包括將所述Cce sia-Ι的編碼基因?qū)胨錾锛?xì)胞的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述Ccesia-Ι的編碼基因通過(guò)含有所述Cce sia-Ι的編碼基因的重組載體導(dǎo)入所述生物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述Ccesia-Ι的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子: 1)編碼序列是序列表中SEQID N0.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 2)核酸序列是序列表中SEQID N0.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子； 3)編碼序列是序列表中SEQID N0.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； 4)與I)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述微生物為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述細(xì)菌為大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述大腸桿菌為大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)，所述重組載體為用SEQ ID N0.1的第106-2217位所示的DNA分子替換pET-28a(+)的Nde I和BamH I識(shí)別位點(diǎn)間的片段得到的重組載體pET_28a/Cce sia-l0
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述將Ccesia-Ι的編碼基因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)包括將所述重組 載體pET-28a/Cce sia-1導(dǎo)入所述大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)得到重組大腸桿菌，使所述Cce sia-Ι的編碼基因在所述重組大腸桿菌中表達(dá)得到具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)。
9.唾液酸水解酶的制備方法，包括從權(quán)利要求1-8中任一所述的方法得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質(zhì)中純化得到Cce sia-Ι的步驟,所述Cce sia-Ι為唾液酸水解酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK104004727SQ201410254870
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】周義發(fā), 高娟, 原野, 及莉, 臺(tái)桂花 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)