專利名稱：一種腈水解酶活性的熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腈水解酶活性的熒光檢測方法，尤其是一種以水楊腈類化合物為熒光探針的腈水解酶活性的熒光檢測方法。
背景技術(shù)：
腈水解酶是一類非常重要的水解酶，它可將腈基直接水解為羧酸和銨。研究表明，在生物體內(nèi)它參與多種重要物質(zhì)的生物合成，如植物荷爾蒙以及3-羧基吲哚。此外，腈水解酶作為一種生物催化劑，在羧酸及衍生物的不對稱合成中占有極其重要的地位。
目前對于腈水解酶活性的檢測，基本上采用高效液相色譜。但是這種方法費時費力，并不適合高通量檢測。最近，一些新的檢測方法，例如Berthelot法和Fourier-transform IR的腈水解酶催化活性實時探測法得到了一定的應(yīng)用。但是這兩種方法本身都存在著較大的缺陷前者是將腈水解后釋放的NH3與苯酚/次氯酸試劑作用，在640nm處測定其分光度，這個方法的最大缺點是它的靈敏度低，并且需要腐蝕性的試劑，這限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。后者是利用了硅探針，盡管這個方法和腈水解反應(yīng)的動力學契合得比較好，但是卻受到了設(shè)備方面的限制，而且硅探針還不能做到十分有效，這些都降低了這些方法的有用性。
因此，設(shè)計出一種更為快速、靈敏、有效的腈水解酶的檢測方法是相當必要和迫切的，比較好的選擇是應(yīng)用熒光探針技術(shù)。但是，不論是在國內(nèi)還是國際上，通過熒光探針檢測和分析腈水解酶的理論和方法都是極為缺少的，到目前為止還未有一種熒光探針可直接用來探測腈水解酶活性。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一種快速、靈敏、高效的腈水解酶活性的熒光檢測方法。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種腈水解酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以腈水解酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得腈水解酶活性數(shù)據(jù)；所述熒光探針為水楊腈類化合物；所述水楊腈類化合物結(jié)構(gòu)如式(1)所示 式中，R為H、或Cl、或Br、或F、或OCH3、或CH3、或Ph、或COOH、或COOCH3、或COOC2H3。
所述的方法為將可能含有腈水解酶的待測樣品溶于EP管中，取部分放入Tris緩沖液(pH8.0)中，置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱后，加入水楊腈類化合物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入梯度濃度的反應(yīng)液、Tb3+溶液、EDTA，用全功能熒光分光光度計檢測。
所述的水楊腈類化合物優(yōu)選為水楊腈、或5-氯水楊腈、5-氟水楊腈。
所述的方法為將可能含有腈水解酶的待測樣品溶于1ml EP管中，取100uL放入1ml 50mM Tris緩沖液(pH8.0)中，置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱5min，加入10μl鄰羥基苯腈(濃度為0.1mM)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入上述轉(zhuǎn)化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μl EDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液將pH調(diào)至12-13，用全功能熒光分光光度計檢測，測知腈水解酶的存在與否或者活性大小。
所述水楊腈類化合物由如下方法制備得到將所述水楊腈類化合物的原料水楊醛肟類化合物與乙酸酐混合，于反應(yīng)器中加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，蒸餾除去多余乙酸酐，加入NaOH溶液至液體為澄明，再加入無水乙醇至液體呈均一色，于70～85℃水浴反應(yīng)2～3小時，反應(yīng)液經(jīng)分離純化的到所述的水楊腈類化合物。
所述分離純化方法如下往反應(yīng)液中加入HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5～6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體脫水、過濾、蒸干，即得所述水楊腈類化合物。
所述水楊醛肟類化合物制備方法如下將所述水楊醛肟類化合物前體水楊醛類化合物與鹽酸羥胺混合，加入到NaOH溶液中，于50～60℃水浴中反應(yīng)2～3小時，加入乙酸調(diào)節(jié)至中性，于冰浴中析出白色晶體，即為所述水楊醛肟類化合物。
具體的，所述水楊腈類化合物由如下方法制備得到將物質(zhì)的量之比為1.2∶1的水楊醛類化合物與鹽酸羥胺混合，加入到含有NaOH物質(zhì)的量為所述水楊醛類化合物物質(zhì)的量2倍的NaOH溶液中，于50℃水浴中反應(yīng)2小時，加入質(zhì)量濃度36％的乙酸調(diào)節(jié)至中性，于冰浴中析出白色晶體，即為所述水楊醛肟類化合物；將質(zhì)量比2∶1的水楊醛肟類化合物與乙酸酐混合，于反應(yīng)器中加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，蒸餾除去多余乙酸酐，加入質(zhì)量濃度10％的NaOH溶液至液體為澄明，再加入無水乙醇至液體呈均一色，于80℃水浴反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后往反應(yīng)液中加入質(zhì)量濃度10％的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體加入無水硫酸鎂脫水、過濾、蒸干，即得所述水楊腈類化合物。
所述檢測方法如下取腈水解酶發(fā)酵液，離心，取沉淀用生理鹽水溶解，離心，取沉淀加入pH8.0的Tris緩沖液溶解，加入熒光探針進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清液與Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能熒光分光光度計的96孔篩板中，調(diào)pH值至12～13，檢測熒光強度。
或者，所述檢測方法如下取腈水解酶固體酶溶于pH8.0的Tris緩沖液中加入熒光探針進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清液與Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能熒光分光光度計的96孔篩板中，調(diào)pH值至12～13，檢測熒光強度。
本發(fā)明所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法的有益效果主要體現(xiàn)在(1)所用熒光探針制備所需要的設(shè)備簡單，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，并且所制備的這種新型的腈水解酶熒光探針性質(zhì)很穩(wěn)定，純度也很高(99％以上)；(2)與目前所用的檢測腈水解酶活性的基本方法-HPLC法相比較，其精確度、靈敏度和檢測速率(可以同時檢測96種腈水解酶的活性，耗時僅需幾分鐘)都有很大的提高。


圖1為實施例1多種酶熒光檢測結(jié)果圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1取3.90g的水楊醛和1.86g鹽酸羥胺加入0.066mol的氫氧化鈉溶液中。然后反應(yīng)混合液在50℃水浴中攪拌反應(yīng)2小時，得一顏色(黃色)均一的溶液，用36％的乙酸進行pH的調(diào)節(jié)，直至中性，在將其置于冰浴中，將會有晶體析出，之后進行過濾，水洗，風干，得到產(chǎn)物2.50g(水楊醛肟)，此產(chǎn)物的產(chǎn)率為67.8％。然后取1.00g水楊醛肟和0.50g乙酐加入反應(yīng)器中，用油浴(160℃)進行加熱攪拌回流，反應(yīng)10小時。加熱回流后，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸餾，蒸餾掉未反應(yīng)的乙酸酐，并向蒸餾后剩下的液體中加入10％的NaOH溶液，直到液體為一澄明液為止，再加入適量的無水乙醇，使液體呈均一色(顏色為黃色)，之后，將液體置于80℃水浴中反應(yīng)2小時。2小時后，停止反應(yīng)，并使液體冷卻到室溫，再向液體中加入10％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯進行萃取。向萃取后的液體加入無水硫酸鎂進行脫水，2分鐘后進行過濾，最后將過濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，便可以得到白色晶體產(chǎn)物—水楊腈(其純度可以達到99％以上)。
用制備所得的水楊腈對腈水解酶的活性進行檢測(以腈水解酶Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114為例)取腈水解酶發(fā)酵液1ml分裝于1ml EP管中，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀用1ml0.9％生理鹽水溶解，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀加1ml 50mM Tris緩沖液(pH8.0)溶解。置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱5min，此時加入10μl底物水楊腈(濃度為0.1mol/ml)，反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液12000rpm離心4min，取上清。與全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入上述轉(zhuǎn)化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液將pH調(diào)至12-13，用全功能熒光分光光度計檢測。
實驗證明，只要存在微量的腈水解酶(10-5mol/ml)，就能高效的水解熒光探針，通過全功能微孔板檢測系統(tǒng)測定出熒光強度(變化的幅度較大)的變化，直觀地得出腈水解酶的活性。
同時，采用其他的酶制劑按照上述方法對底物進行作用。他們分別是脂肪酶(EC 3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkaline bovine)，多種蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Protease from Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一種復合酶(BS-031江門市蓮江區(qū)拜奧生物化學廠)。在Tb3+及EDTA的存在下，只有腈水解酶顯示強烈的熒光，結(jié)果如圖1所示，只有腈水解酶能使底物轉(zhuǎn)化，也說明了起到水解作用的是我們發(fā)酵所得的腈水解酶，而其他的酶對底物沒有作用。
結(jié)論，水楊腈不被上述幾種水解酶所水解，從而證明了水楊腈專一的為腈水解酶水解。
實施例2在30ml的NaOH溶液(2mol/ml)中先后加入2.00g的5-氯水楊醛和1.00g的鹽酸羥胺，(此時所得溶液并不是均一的，其中含有少量顆粒的固體，于是，在反應(yīng)液中滴加微量無水乙醇使反應(yīng)液中少量固體顆粒溶解在反應(yīng)液中)并將反應(yīng)混合液在50℃水浴中攪拌反應(yīng)2小時，再加入36％的乙酸調(diào)節(jié)pH至中性，有白色粉末狀固體析出，然后將反應(yīng)器置于冰水浴中靜置一會兒，接著進行過濾，所得白色粉末狀固體即為5-氯水楊醛肟，此產(chǎn)物的產(chǎn)率為90％以上。然后取1.00g5-氯水楊醛肟和0.50g乙酐加入反應(yīng)器中，用油浴(160℃)進行加熱攪拌回流，反應(yīng)7小時。加熱回流后，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸餾，蒸餾掉未反應(yīng)的乙酸酐，并向蒸餾后剩下的液體中加入10％的NaOH溶液，直到液體為一澄明液為止，再加入適量的無水乙醇，使液體呈均一色(顏色為黃色)，之后，將液體置于80℃水浴中反應(yīng)2小時。2小時后，停止反應(yīng)，并使液體冷卻到室溫，再向液體中加入10％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯進行萃取。向萃取后的液體加入無水硫酸鎂進行脫水，2分鐘后進行過濾，最后將過濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，便可以得到白色晶體產(chǎn)物-5-氯水楊腈(其純度可以達到99％以上)。
用制備所得的水楊腈對腈水解酶的活性進行檢測(以腈水解酶Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114為例)取腈水解酶發(fā)酵液1ml分裝于1ml EP管中，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀用1ml0.9％生理鹽水溶解，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀加1ml 50mM Tris緩沖液(pH8.0)溶解。置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱5min，此時加入10μl底物水楊腈(濃度為0.1mol/ml)，反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液12000rpm離心4min，取上清。與全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入上述轉(zhuǎn)化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液將pH調(diào)至12-13，用全功能熒光分光光度計檢測。
實驗證明，只要存在微量的腈水解酶(10-5mol/ml)，就能高效的水解5-氯水楊腈，通過全功能微孔板檢測系統(tǒng)測定出熒光強度(變化的幅度較大)的變化，直觀地得出腈水解酶的活性。
同時，采用其他的酶制劑按照上述方法對底物進行作用。他們分別是脂肪酶(EC 3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkaline bovine)，多種蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Protease from Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一種復合酶(BS-031江門市蓮江區(qū)拜奧生物化學廠)。結(jié)果只有腈水解酶能使5-氯水楊腈轉(zhuǎn)化，同時在Tb3+及EDTA的存在下，顯示強烈的熒光，證明(1)5-氯水楊腈也專一的為腈水解酶水解。(2)5-氯水楊酸也能很好的與Tb3+及EDTA結(jié)合，發(fā)出強烈的熒光。
實施例3取1.00g5-氟水楊醛和0.50g鹽酸羥胺，先后加入到30ml的NaOH(2mol/ml)溶液中，并將反應(yīng)混合液在50℃水浴中攪拌反應(yīng)2小時，再加入36％的乙酸調(diào)節(jié)pH至中性，有白色粉末狀固體析出，然后將反應(yīng)器置于冰水浴中靜置一會兒，接著進行過濾，所得白色粉末狀固體即為5-氟水楊醛肟，此產(chǎn)物的產(chǎn)率為95％。然后取1.00g5-氟水楊醛肟和0.50g乙酐加入反應(yīng)器中，用油浴(160℃)進行加熱攪拌回流，反應(yīng)8小時。加熱回流后，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸餾，蒸餾掉未反應(yīng)的乙酸酐，并向蒸餾后剩下的液體中加入10％的NaOH溶液，直到液體為一澄明液為止，再加入適量的無水乙醇，使液體呈均一色(顏色為黃色)，之后，將液體置于80℃水浴中反應(yīng)2小時。2小時后，停止反應(yīng)，并使液體冷卻到室溫，再向液體中加入10％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯進行萃取。向萃取后的液體加入無水硫酸鎂進行脫水，2分鐘后進行過濾，最后將過濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，便可以得到白色晶體產(chǎn)物-5-氟水楊腈(其純度可以達到99％以上)。
用制備所得的5-氟水楊腈對腈水解酶的活性進行檢測(以腈水解酶Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114為例)取腈水解酶發(fā)酵液1ml分裝于1ml EP管中，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀用1ml0.9％生理鹽水溶解，9000rpm離心8min，棄上清液，沉淀加1ml 50mM Tris緩沖液(pH8.0)溶解。置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱5min，此時加入10μl底物5-氟水楊腈(濃度為0.1mol/ml)，反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液12000rpm離心4min，取上清。與全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入上述轉(zhuǎn)化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液將pH調(diào)至12-13，用全功能熒光分光光度計檢測。
同時，采用其他的酶制劑按照上述方法對底物5-氟水楊腈進行作用。他們分別是脂肪酶，磷酸酶，多種蛋白酶和一種復合酶，以及腈水合酶。結(jié)果只有腈水解酶能使底物轉(zhuǎn)化，并且在Tb3+及EDTA的存在下，顯示強烈的熒光，證明5-氟水楊腈也專一的為腈水解酶水解。
權(quán)利要求
1.一種腈水解酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以腈水解酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得腈水解酶活性數(shù)據(jù)；其特征在于所述熒光探針為水楊腈類化合物；所述水楊腈類化合物結(jié)構(gòu)如式(1)所示 式中，R為H、或Cl、或Br、或F、或OCH3、或CH3、或Ph、或COOH、或COOCH3、或COOC2H3。
2.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的方法為將可能含有腈水解酶的待測樣品溶于EP管中，取部分放入pH8.0的Tris緩沖液中，置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱后，加入水楊腈類化合物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入梯度濃度的反應(yīng)液、Tb3+溶液、EDTA，用全功能熒光分光光度計檢測。
3.如權(quán)利要求1或2所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的水楊腈類化合物為水楊腈、或5-氯水楊腈、或5-氟水楊腈。
4.如權(quán)利要求3所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述的水楊腈類化合物為水楊腈，所述的方法為將可能含有腈水解酶的待測樣品溶于1ml EP管中，取100uL放入1ml 50mM pH8.0的Tris緩沖液中，置于恒溫水浴搖床中，30℃預熱5min，加入10μl濃度為0.1mM水楊腈反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在全功能熒光分光光度計中的96孔篩板中依次加入上述反應(yīng)液200μl，2μl濃度0.1mol/l的Tb3+溶液，2μl濃度0.1mol/l的EDTA，并用Na0H溶液將pH調(diào)至12-13，用全功能熒光分光光度計檢測。
5.如權(quán)利要求3所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述水楊腈類化合物由如下方法制備得到將所述水楊腈類化合物的原料水楊醛肟類化合物與乙酸酐混合，于反應(yīng)器中加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，蒸餾除去多余乙酸酐，加入NaOH溶液至液體為澄明，再加入無水乙醇至液體呈均一色，于70～85℃水浴反應(yīng)2～3小時，反應(yīng)液經(jīng)分離純化的到所述的水楊腈類化合物。
6.如權(quán)利要求5所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述分離純化方法如下往反應(yīng)液中加入HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5～6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體脫水、過濾、蒸干，即得所述水楊腈類化合物。
7.如權(quán)利要求5所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述水楊醛肟類化合物制備方法如下將所述水楊醛肟類化合物前體水楊醛類化合物與鹽酸羥胺混合，加入到NaOH溶液中，于50～60℃水浴中反應(yīng)2～3小時，加入乙酸調(diào)節(jié)至中性，于冰浴中析出白色晶體，即為所述水楊醛肟類化合物。
8.如權(quán)利要求5所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述水楊腈類化合物由如下方法制備得到將物質(zhì)的量之比為1.2∶1的水楊醛類化合物與鹽酸羥胺混合，加入到含有NaOH物質(zhì)的量為所述水楊醛類化合物物質(zhì)的量2倍的NaOH溶液中，于50℃水浴中反應(yīng)2小時，加入質(zhì)量濃度36％的乙酸調(diào)節(jié)至中性，于冰浴中析出白色晶體，即為所述水楊醛肟類化合物；將質(zhì)量比2∶1的水楊醛肟類化合物與乙酸酐混合，于反應(yīng)器中加熱至回流溫度下反應(yīng)8～10小時，蒸餾除去多余乙酸酐，加入質(zhì)量濃度10％的NaOH溶液至液體為澄明，再加入無水乙醇至液體呈均一色，于80℃水浴反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后往反應(yīng)液中加入質(zhì)量濃度10％的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液體加入無水硫酸鎂脫水、過濾、蒸干，即得所述水楊腈類化合物。
9.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述檢測方法如下取腈水解酶發(fā)酵液，離心，取沉淀用生理鹽水溶解，離心，取沉淀加入pH8.0的Tris緩沖液溶解，加入熒光探針進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清液與Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能熒光分光光度計的96孔篩板中，調(diào)pH值至12～13，檢測熒光強度。
10.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶活性的熒光檢測方法，其特征在于所述檢測方法如下取腈水解酶固體酶溶于pH8.0的Tris緩沖液中加入熒光探針進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清液與Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能熒光分光光度計的96孔篩板中，調(diào)pH值至12～13，檢測熒光強度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腈水解酶活性的熒光檢測方法，所述方法是以腈水解酶水解熒光探針形成熒光物質(zhì)，測定熒光強度，獲得腈水解酶活性數(shù)據(jù)；所述熒光探針為水楊腈類化合物；所述水楊腈類化合物結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)所用熒光探針制備所需要的設(shè)備簡單，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，并且所制備的這種新型的腈水解酶熒光探針性質(zhì)很穩(wěn)定，純度也很高(99％以上)；(2)與目前所用的檢測腈水解酶活性的基本方法——HPLC法相比較，其精確度、靈敏度和檢測速率(可以同時檢測96種腈水解酶的活性，耗時僅需幾分鐘)都有很大的提高。
文檔編號C07C255/00GK1945288SQ20061005363
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日
發(fā)明者朱勍 申請人:浙江工業(yè)大學