到萬.co/i JM109獲得萬.co/i JM109-pMD-ldhL，提取重組 質(zhì)粒進行雙酶切驗證，將驗證后的陽性克隆子凡co/i JM109-pMD-ldhL進行核苷酸序列測 序。測序正確后，將克隆載體PMD-IdhL雙酶切的產(chǎn)物進行核酸電泳膠回收，獲得目的基因 ，連接表達質(zhì)粒pET-28a，轉(zhuǎn)化至萬.co/i BL21 (DE3)中，經(jīng)質(zhì)粒酶切驗證和菌落PCR 驗證，獲得萬.co/i BL21 (DE3) /pET-28a-ldhL，并經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析L-LDH 的表達量（圖2)。
[0029] 實施例2 本實施例說明重組大腸桿菌全細胞的制備。
[0030] (1)菌種活化：挑取凡co/i BL21 (DE3)/pET-28a_ldhL單菌落接種至10 mL LB液 體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）中，37 °C，200 r/min培養(yǎng)過夜。
[0031] (2)種子培養(yǎng)：將上述步驟1)所得培養(yǎng)液按照1%接種量（體積分數(shù)）接入100 mL LB培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）中，37 °C，200 r/min培養(yǎng)細胞OD6tltl為0· 4~1· 0。
[0032] (3)誘導(dǎo)表達：向上述4)所得到的菌液中添加 IPTG，于25 °C，200 r/min培養(yǎng)4~6 h至細胞生長對數(shù)中期，將所得培養(yǎng)液于4 °C，6000 r/min離心5 min，用滅菌磷酸鈉緩沖 液（0· I mol/L，ρΗ=7· 0)洗滌2次獲得靜息細胞菌體。
[0033] 實施例3 本實施例說明全細胞分批催化合成L-PLA。
[0034] (1)全細胞轉(zhuǎn)化：用5 ml轉(zhuǎn)化液懸浮上述實施例2所得菌體，并倒入100 ml三角 瓶中。轉(zhuǎn)化液中含有0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液和100 mmol/L葡萄糖。待菌泥充分均勻懸 浮于轉(zhuǎn)化液中后，加入5 ml 70 mmol/L PPA溶液即終濃度為35 mmol/L，混勻后在搖床上進 行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37 °C，200 r/min振蕩反應(yīng)60 min。
[0035] (2)將上述步驟1)所得反應(yīng)轉(zhuǎn)化液經(jīng)4 °C，10000 r/min離心2 min后取上清液， 采用高效液相色譜儀測定L-PLA的含量，檢測條件為：手性柱0J-RH，流動相（體積比）：乙 腈：甲醇：三氟乙酸：去離子水=50 :50:1. 5:900,流速0.4 mL/min，柱溫25 °C，檢測波長 210 nm，進樣量5 μ L。具體結(jié)果如圖3所示，L-PLA出現(xiàn)明顯波峰。
[0036] 實施例4 本實施例說明全細胞分批補料催化合成L-PLA。
[0037] 用50 ml磷酸鈉緩沖液（0· I mol/L，pH=7. 0,含100 mmol/L葡萄糖）懸浮上述實 施例2所得菌體，置于250 ml三角瓶中。待菌泥充分均勻懸浮后，加入0. 36 g PPA，即50 ml轉(zhuǎn)化液中PPA終濃度為35 mmol/L，混勻后在搖床上進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37 °C， 200 r/min振蕩反應(yīng)，每小時取0. 5 ml轉(zhuǎn)化液，10000 r/min離心2 min，上清液采用HPLC 檢測。每次取樣后立即補充PPA和葡萄糖。具體試驗結(jié)果如圖4所示。經(jīng)4 h的流加轉(zhuǎn)化 反應(yīng)，獲得L-PLA最終濃度為128 mmol/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達63. 96 %。
[0038] 實施例5 本實施例說明細胞重復(fù)利用多次轉(zhuǎn)化制備L-PLA。
[0039] (1)全細胞轉(zhuǎn)化：用5 ml轉(zhuǎn)化液懸浮上述實施例2所得菌體，并倒入100 ml三角 瓶中。轉(zhuǎn)化液為0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（含100 mmol/L葡萄糖）。待菌泥充分均勻懸 浮于轉(zhuǎn)化液中后，加入5 ml 70 mmol/L PPA溶液即終濃度為35 mmol/L，混勻后在搖床上進 行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為37 °C，200 r/min振蕩反應(yīng)60 min后，6000 r/min離心5 min分 離菌體與反應(yīng)液，得到的菌體經(jīng)磷酸鈉緩沖液清洗兩遍后離心用于下一批重復(fù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 反應(yīng)上清液用于HPLC測定PPA和L-PLA的濃度并計算L-PLA產(chǎn)率。
[0040] (2)用5 ml轉(zhuǎn)化液懸浮上述（1)所得菌體，并倒入100 ml三角瓶中。重復(fù)（1)中 的步驟進行菌體重復(fù)利用轉(zhuǎn)化PPA，菌體對PPA反復(fù)轉(zhuǎn)化7次，每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)果如下表 所示。經(jīng)7次轉(zhuǎn)化，獲得143. 04 mmol/L L-PLA，平均摩爾轉(zhuǎn)化率64. 54 %。隨著重復(fù)次數(shù) 增加，細胞活力和酶活下降，以及細胞自溶等原因?qū)е罗D(zhuǎn)化率明顯下降。
[0041] 表1細胞重復(fù)性試驗結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 一種L-乳酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 攜帶權(quán)利要求1所述的L-乳酸脫氫酶基因的重組表達質(zhì)粒pET-28a-ldhL。
3. 含有權(quán)利要求2所述的載體的重組大腸桿菌。
4. 權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟： (1) 根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對巨大芽孢桿菌Z2013513) CCTCC NO :M2013244 L-乳酸脫氫酶基因進行密碼子優(yōu)化； (2) 將密碼子優(yōu)化的L-乳酸脫氫酶基因?qū)雙ET-28a(+)載體得到重組表達載體 pET-28a_ldhL ; (3) 將得到的重組表達載體pET-28a-ldhL轉(zhuǎn)化萬.co/i BL21(DE3)后得到重組大腸桿 菌。
5. 權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌在轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成（S) -2-羥基-3-苯基丙酸中 的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成（S) -2-羥基-3-苯基丙酸的方 法，該方法包括以下步驟： (1) 全細胞菌懸液制備，將重組大腸桿菌單菌落接種至種子培養(yǎng)基中活化，再將此種子 液接種至擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期，添加產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑IPTG，低溫誘導(dǎo)并收集菌體以獲 得全細胞菌懸液； (2) 流加底物苯丙酮酸和葡萄糖，全細胞生物轉(zhuǎn)化合成（S)-2-羥基-3-苯基丙酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種L-乳酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了還有該基因的表達載體以及重組大腸桿菌，以及重組大腸桿菌的構(gòu)建方法和其在轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成(S)-2-羥基-3-苯基丙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明對巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriumZ2013513）CCTCC NO:M2013244 L-乳酸脫氫酶基因進行密碼子優(yōu)化后，構(gòu)建入表達載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，得到一種培養(yǎng)條件簡單、使用方便、應(yīng)用廣泛的L-PLA生產(chǎn)菌株；所述重組大腸桿菌全細胞單批次轉(zhuǎn)化L-PLA產(chǎn)量為27.13mmol/L，轉(zhuǎn)化率達到77.5%，這為后續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)補料提高L-PLA產(chǎn)量和產(chǎn)率奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1-21, C12R1-19, C12N15-53, C12P7-42, C12N15-70
【公開號】CN104878024
【申請?zhí)枴緾N201510279435
【發(fā)明人】朱益波, 王立梅, 齊斌, 王穎, 梁劍光
【申請人】常熟理工學(xué)院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月27日