一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體涉及一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因，采用反向遺傳學的方法，從水稻葉片、葉枕特異基因表達芯片分析中篩選特異在葉枕部位表達的基因，利用PCY⑶4-GUS轉基因系證明CYC U4 ;I的啟動子特異在葉枕處表達；通過轉基因提高CYC U4 ；1的表達量和RNAi技術降低CYC U4 ；1的表達量均證明CYC U4 ;1基因為控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因。本發(fā)明還涉及含有該基因或其同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調控植物葉片直立性在農業(yè)生產中的應用。
【背景技術】
[0002]作物的株型發(fā)育是高產育種的關鍵性狀。葉片直立性(莖葉夾角的大小)是株型發(fā)育的重要性狀之一，合適的莖葉夾角能使我們通過提高作物的田間種植密度，進而促進光能利用率，增加作物產量(Sakamoto et al., 2006 ；Sinclair et al.，1999)。葉枕是影響葉片直立性發(fā)育的關鍵部位，葉枕的發(fā)育程度直接影響莖葉夾角的大小。因此，發(fā)現(xiàn)和利用影響葉片直立性(莖葉夾角大小)的關鍵基因的最終目是改進水稻株型，促進分子設計育種，提高水稻單位面積產量。
[0003]單子葉植物的葉枕部位是連接葉片和葉鞘的中間樞紐，是形成莖葉夾角的基礎結構。葉枕作為機械組織，當葉片和葉鞘伸長完畢后，促使葉片向遠軸方向彎曲，所以葉枕區(qū)域的發(fā)育與葉片直立性密切相關(Hoshikawa，1989)。油菜素留醇的合成和信號通路在調控單子葉植物莖葉夾角發(fā)育中具有重要而獨特的作用，但其下的細胞學和分子機制還不清楚。已報道的BR合成相關的突變體d2、dwarf4、，dll和brd2均表現(xiàn)為莖葉夾角變小，葉片直立(Li et al., 2013 ；Hong et al., 2003, 2005 ；Tanabe et al.，2005)。BR 信號通路中的正調控因子的缺失突變體也表現(xiàn)為莖葉夾角變小，葉片直立。如受體突變體d61，dlt，dl和tudl(Yamamuro et al., 2000 ；Tong et al., 2012 ；0ki et al., 2009 ；Hu et al., 2013) ο利用同源克隆的方法得到的OsBAKl、0sGSK2的轉基因植株的莖葉夾角大小也發(fā)生變化(Liet al., 2009 ；Tong et al.，2012)。利用RNAi技術抑制水稻BR信號通路下游的正調節(jié)因子OsBZRl基因的表達，也會促進葉片直立(Bai et al.，2007)。而BR信號通路的負調節(jié)因子LIC的功能獲得型突變體Iic-1也表現(xiàn)為莖葉夾角變小，葉片直立(Zhang et al.，2012)。而被OsBZRl調節(jié)的ILIl的功能獲得型突變體ilil-D，由于BR信號被放大，則表現(xiàn)為葉夾角增大(Zhang et al.，2009)。另外，水稻OsBZRl的靶基因OsIBHl也直接參與了對水稻葉片直立性的調節(jié)(Zhang et al.，2009);外施BR處理導致野生型和BR合成途徑突變體的葉片傾角變大，而BR信號突變體如受體突變體d61的葉片傾角幾乎不受外源BR的影響。
[0004]除了油菜素甾醇途徑，其他信號途徑也參與了莖葉夾角的調控。雖然BR相關途徑基因在參與調控水稻葉片傾角變化方面具有顯著作用，但是還存在其它獨立途徑參與此生物性狀的調控。負調控赤霉素(GAs)信號的基因SPINDLY (SPY)的表達量下降后莖葉夾角增大(Shimada et al.，2006)。而生長素信號途徑負調節(jié)因子Aux/IAA家族成員OsIAAl過表達植株莖葉片夾角變大(Song et al., 2009) ο調控生長素體內平衡的編碼生長素偶聯(lián)氨基酸的合成酶基因LCl通過調節(jié)葉枕部位細胞伸長決定水稻葉夾角大小(Zhao etal.,2013) ο 水稻 rice leaf inclinat1n2 (LC2)，一個 VIN3-類似蛋白，突變后也能使莖葉夾角變大(Zhao et al.，2010)。MAPKKK家族C組成員的基因ILAl在葉枕的維管束中高表達，其基因T-DNA插入突變引起葉枕部位細胞壁主要成分纖維素和木聚糖含量下降，從而導致葉枕部位機械強度降低，葉夾角增大(Ning et al., 2011) ο水稻中Loose PlantArchitecturel(LPAl)基因的突變體Ipal表現(xiàn)為株型松散，其分蘗角和莖葉夾角均增大(ffu et al., 2013)。
[0005]育種實踐證明，水稻莖葉夾角與產量密切相關。利用BR相關途徑的基因作為改良水稻株型的靶基因，在生產上具有廣闊的應用前景。例如，Morinaka等(2006)利用共抑制的策略，通過導入水稻肌動蛋白啟動子驅動的OsBRIl的胞內區(qū)(OsACTIN::0sBRIl_KD)，部分抑制水稻內源OsBRIl的表達，從而在后代中分離出直葉型的轉基因系；據(jù)估算它們通過密植可分別增產約35%和26%。Sakamoto等(2006)通過田間實驗證實合理密植水稻BR合成途徑0sDWARF4的突變體可增產達32%。通過對劍葉角度與主穗產量進行遺傳剖析，應用244個珍汕97B/密陽46RIL群體，在1、3、5和11染色體上共檢測到5個控制劍葉角度的QTL，其中在第I染色體RM24-RM294A區(qū)間同時檢測到了控制劍葉角度(FLA)和結實率(SF)的QTL，且加性效應方向相反，表明劍葉角度與產量呈負相關，適當減小水稻劍葉夾角有利于結實率的提尚，并最終提尚廣量(zhang et al.，2008)。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因CYC U4山該基因從水稻葉枕處特異表達芯片中鑒定并分離克隆，該基因包含有SEQ.1D.N0.1所示的啟動子區(qū)域、具有SEQ ID N0.2核苷酸所示的⑶S序列，該基因編碼SEQ.1D.N0.3所示的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供CYC U4 ;1基因在控制水稻葉片直立性中的應用，通過CYC U4 ; I基因啟動子(SEQ ID.NO:1所示序列)驅動CYC U4 ；1基因在水稻植株中超量表達可達減小莖葉夾角，從而改善水稻品種的株型和提高單位面積的種植密度。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施:
[0009]發(fā)明人構建水稻葉片和葉枕部位的基因特異表達芯片，通過反向遺傳學的方法，從芯片的差異表達基因中挑選在葉枕處特異表達的基因CYC U4山利用real-timeqRT-PCR驗證了 CYC U4 ；1在葉枕處表達的特異性。
[0010]一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因CYC U4 ;1，利用下述方法得到:
[0011]反應體系的總體積為50 μ 1，模板為日本晴CDNA Iul (約50ng)、10XK0D酶反應緩沖液 5yl、25mM MgCL2 2yl、5mM dNTP 5 μ l、5uM 引物 5 μ I (采用分步 PCR 方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每條引物均為
2.5 μ I)、I μ I KOD酶，加ddH20 (無菌去離子水)至50 μ I。
[0012]反應程序為:94°C變性5min，94°C 30s,55°C lmin、68°C 2min 35cycles，68°C延伸1min0
[0013]所述引物為:
[0014]CYCU4-U:ATATgagctcATGAGGACGGGGGAGGTGGCGGAGGCGGTG ；
[0015]CYCU4-L-1:CGTCTTTGTAGTCGACGGCGAGCTGATGCTGCTGCTG ；
[0016]CYCU4-L-2:ATATtctagactaCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACGGCGAG0
[0017]最終獲得包含有SEQ ID N0.2所述核苷酸的基因序列，該基因編碼的蛋白質為SEQID N0.3 所示。
[0018]本發(fā)明的保護內容還包括SEQ ID N0.3所示氨基酸序列對應的核苷酸序列，還包括SEQ ID N0.3所示序列經(jīng)過改造修飾的具有相同功能的蛋白。
[0019]CYC U4 ;1基因在控制水稻葉片直立性中的應用，包括將CYC U4的啟動子和全長⑶S克隆到PCAMBIA1301上，轉入日本晴中，所獲得的轉基因系均表現(xiàn)為莖葉夾角比野生型(日本晴)變小，因此可通過該方法減小莖葉夾角，以提高種植密度。
[0020]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0021]UCYC U4 ;1是一個在水稻苗期只在葉枕部位特異表達的基因，這使利用該基因只改變作物莖葉夾角大小，而不影響其它性狀成為可能。
[0022]2,CYC U4 ;1是一個改變莖葉夾角大小的有效基因，它可以通過直接影響葉枕處的特異類型細胞分裂，進而改變作物的莖葉夾角大小。
[0023]3、目前，對油菜素留醇調控葉片直立性進而提高作物產量的分子機制并不清楚，該基因揭示了其介導的油菜素留醇調控葉片直立性的分子機制。
【附圖說明】
[0024]圖1為Realtime qRT-PCT驗證CYC U4 ；1在水稻葉枕中特異表達。
[0025]圖2為pCY⑶4::⑶S轉基因水稻⑶S染色結果。
[0026]圖3為pCY⑶4::CYC U4 ；1轉基因水稻幼苗和成熟期表型和轉基因的表達水平。
[0027]圖4為RNA1-CYC U4 ；1轉基因水稻幼苗和成熟期表型和基因表達水平。
[0028]圖5為多個獨立的pCY⑶4::CY⑶4 ；1和RNA1-CYC U4 ；1轉基因株系的表型和表達量分析。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規(guī)方案，所述試劑或生物材料，如未特別說明，均已公開。
[0030]實施例1:
[0031]一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因CYC U4 ；1的獲得:
[0032]發(fā)明人構建水稻葉片和葉枕部位的基因特異表達芯片，通過反向遺傳學的方法，從芯片的差異表達基因中挑選在葉枕處特異表達的基因CYC U4山利用real-timeqRT-PCR驗證了 CYC U4 ；1在葉枕處表達的特異性。具體如下:
[0033]一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因CYC U4 ;1，利用下述方法得到:
[0034]反應體系的總體積為50 μ 1，模板為日本晴CDNA Iul (約50ng)、10XK0D酶反應緩沖液 5yl、25mM MgCL2 2yl、5mM dNTP 5 μ l、5uM 引物 5 μ I (采用分步 PCR 方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每條引物均為
2.5 μ I)、I μ I KOD酶，加ddH20 (無菌去離子水)至50 μ I。
[0035]反應程序為:94°C變性5min，94°C 30s,55°C lmin、68°C 2min 35cycles，68°C延伸1min0
[0036]所用引物如下:
[0037]CY