Hsa-miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，是microRNAs在制備早期篩查或診斷 Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是目前全球死亡率最高的惡性腫瘤。美國每年大約有17萬人死于肺癌，占整 體癌癥死亡人數(shù)的30%。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和空氣污染的日益加重，我國的肺癌發(fā)病率 也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為我國城市人口癌癥死亡的首要原因。據(jù)統(tǒng)計，肺癌患者的 五年生存率僅為5-15%，其主要原因在于難于早期發(fā)現(xiàn)，大部分患者就診時已經(jīng)發(fā)生了不 同程度的轉(zhuǎn)移。如死于肺癌的患者的尸檢中，有90 %左右都會出現(xiàn)脊柱轉(zhuǎn)移病灶，肺癌的轉(zhuǎn) 移成為患者生存期短預(yù)后差的重要原因，且轉(zhuǎn)移病灶的巨大疼痛也使得患者的生存質(zhì)量嚴(yán) 重下降，加速了患者的死亡進(jìn)程。雖然國際上對于肺癌轉(zhuǎn)移的治療已由原先的消極對癥轉(zhuǎn) 為以外科手術(shù)為主輔以化療、放療、靶向治療等多學(xué)科協(xié)作的綜合性模式，患者的生存期和 生存質(zhì)量在一定程度上得到了提高，但由于缺乏簡便有效的早期篩查方法以及對肺癌發(fā)生 和轉(zhuǎn)移機(jī)制認(rèn)知不足、治療方式的局限，肺癌仍然是造成患者死亡率居高不下的重要原因。 目前國際上對于肺癌高危人群的篩查主要應(yīng)用低劑量CT掃描，但由于相對較高的成本和 輻射制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用?；谝陨显颍缙诎l(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移進(jìn)程相關(guān) 的分子診斷標(biāo)記物便可以為腫瘤治療贏取一定的時間，成為控制腫瘤發(fā)展的重要途徑。為 了達(dá)到這一目的，首先要找出相較于正常體細(xì)胞，在肺癌中發(fā)生特異性表達(dá)改變并與轉(zhuǎn)移 等多種腫瘤發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)的腫瘤"靶點(diǎn)"，即找到與肝細(xì)胞中著名的甲胎蛋白（AFP)有 相似點(diǎn)的腫瘤標(biāo)記物。
[0003] "腫瘤靶標(biāo)"這一概念早已被廣泛認(rèn)可并進(jìn)行了大量的研宄，這一概念的核心是找 到僅在腫瘤中特異性表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或局限性表達(dá)的分子，通過"生物導(dǎo)彈"直 擊腫瘤，對正常組織造成最小化的破壞。這一概念的出現(xiàn)和隨之進(jìn)行的大量研宄正逐漸使 腫瘤獨(dú)有的特征具現(xiàn)化，并有可能最終"無所遁形"，也使得人類在與腫瘤的斗爭中掌握了 一定的主動權(quán)。對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和有效治療都有重大意義。
[0004] TATA-box轉(zhuǎn)錄因子Brachyury是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，其同源體 在諸多多細(xì)胞生物體內(nèi)表達(dá)，如秀麗線蟲、非洲爪蛙、老鼠、人類等胚胎中表達(dá)（參見 文獻(xiàn) Papaioannou VE, Silver LM, et al. The T-box gene family. Bioessays 1998 ； 20:9-19. Kispert A，Herrmann BGj et al. Homologs of the mouse Brachyury gene are involved in the specification of posterior terminal structures in Drosophila，Tribolium，and Locusta. Genes Dev 1994 ；8:2137-50. Herrmann BG，Labeit S，et al. Cloning of theTgene required in mesoderm formation in the mouse. Nature 1990 ;343:617-22)。T-box蛋白主要在中胚層的形成和分化中具有重要作用，在胚胎發(fā)育 晚期則在大部分組織中關(guān)閉表達(dá)僅集中于脊索區(qū)表達(dá)，并在脊柱形成后隨著脊索的退化消 失而在大多數(shù)正常成人組織中不表達(dá)，僅在睪丸中有表達(dá)、脾和小腸中有低水平表達(dá)的限 制性表達(dá)方式（參見文獻(xiàn) Duane H. Hamilton, Ph. D·，Postdoctoral Fellow, et al. Cancer vaccines targeting the epithelial-mesenchymal transition:tissue distribution of Brachyury and other drivers of the mesenchymal-like phenotype of carcinomas. Semin Oncol. 2012Jun ;39(3) :358-66.)。然而，在已知的人類多種腫瘤組織和細(xì)胞系 中，Brachyury卻呈現(xiàn)出高水平的表達(dá)，這些腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系是：小腸、胃、腎、膀 胱、子宮、卵巢、睪丸、腦和淋巴組織，肺組織、結(jié)腸組織和前列腺組織來源的細(xì)胞系（參見 文獻(xiàn) Palena C, Polev DE, et al. The human T-box mesodermal transcription factor Brachyury is a candidate target for T-cell-mediated cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2007 Apr 15 ； 13 (8):2471-8. Park JC1Chae YK, et al. Epigenetic silencing of human T(brachyury homologue)gene in non-small-cell lung cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jan 11 ;365 (2) : 221-6.)。以上研宄結(jié)果都提不了 Brachyury 可以應(yīng)用于多種來源的腫瘤診斷和治療中。然而，如何應(yīng)用腫瘤組織中高表達(dá)的Brachyury 對人群進(jìn)行早期無創(chuàng)性的腫瘤篩查或進(jìn)行臨床診斷卻沒有具體有效的方法和研宄。作為轉(zhuǎn) 錄因子，Brachyury具有強(qiáng)大的啟動或抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的作用，因此，通過檢測其下游被 調(diào)控的某些易檢測分子如外分泌蛋白質(zhì)或miRNA的表達(dá)量便可以作為Brachyury表達(dá)水平 的指標(biāo)。
[0005] microRNA是僅有20-24bp的非編碼短鏈核苷酸片段，在外周血中具有穩(wěn)定的表達(dá) 譜，且無性別差異，而腫瘤患者的microRNAs表達(dá)譜則發(fā)生顯著變化（參見文獻(xiàn)Chen X，Ba Y, et al. Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 20080ct;18(10):997-1006.)由 于microRNAs出細(xì)胞時被脂質(zhì)微泡（Micro vesicle)保護(hù)，因此能夠保持穩(wěn)定，易于檢測， 在冰凍組織、福爾馬林固定組織、石蠟組織，體液如外周血、痰液、唾液、胸膜積液中都能夠 進(jìn)行檢測，且由于microRNA片段較短，大大降低了檢測成本，因此，其作為無創(chuàng)性腫瘤早 期診斷標(biāo)記物的研宄日益增多（參見文獻(xiàn)Du M, Liu S et al. Clinical potential role of circulating microRNAs in early diagnosis of colorectal cancer patients. Carcinogenesis. 2014 Sep 19.Jeong HC. Clinical Aspect of MicroRNA in Lung Cancer. Tuberc Respir Dis(Seoul). 2014Aug ；77 (2):60-4.)
[0006] 根據(jù)文獻(xiàn)檢索，國際上對于miR-3200-5p的功能及表達(dá)未見報道，僅在一篇針對 核因子Kappa B(NF- κ B)下游micorRNAs表達(dá)譜的研宄中發(fā)現(xiàn)miR-3200-3p可能為NF- κ B 的靶基因。在肺癌發(fā)生發(fā)展和診斷中的作用亦未見報道。
[0007] 目前的研宄尚未見與腫瘤特異性靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)的microRNAs作為腫瘤（包括肺癌 等）早期診斷的標(biāo)記物，也尚未有用于檢測這一系列microRNAs在血清中含量的試劑盒來 針對部分存在Brachyury過表達(dá)的腫瘤（包括肺癌等）患者進(jìn)行篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于尋找到與Brachyury高表達(dá)肺癌相關(guān)的腫瘤分子標(biāo)記物，本發(fā) 明的另一目的在于提供某一 microRNA在制備早期篩查或臨床診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案：為了尋找被Brachyury調(diào)控的microRNAs，本發(fā)明人 在肺癌細(xì)胞H1299和作為正常人體對照細(xì)胞293T中利用慢病毒感染技術(shù)轉(zhuǎn)入外源性 Brachyur