y的CDS序列使之成功過表達(dá)后再應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出被Brachyury 調(diào)控后發(fā)生顯著上調(diào)和下調(diào)的若干microRNAs。并對這一系列microRNAs進(jìn)行了實時定量 PCR(quantitative RT-PCR)驗證。隨后在對臨床上肺癌患者、慢性阻塞性肺炎患者、同樣 為Brachyury陽性的脊索瘤患者以及正常人群的血衆(zhòng)采集和檢測中發(fā)現(xiàn)，microRNAs組中 hsa-miR-3200-5p在肺癌患者中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而在脊索瘤患者、其它肺部實質(zhì)性病變患 者和正常人群中則未見表達(dá)水平異常。
[0010] 在前期的 microRNA 芯片實驗結(jié)果顯不：hsa_miR-34a 和 has-miR-22 在 Brachyury 陽性的肺癌患者中也發(fā)生了顯著上調(diào)，這些microRNAs都被報道在肺癌患者外周血 中發(fā)生上調(diào)，作者認(rèn)為具有做為肺癌特異性診斷標(biāo)記物的價值（Franchina T, Amodeo V,Circulating miR-22, miR-24 and miR_34a as novel predictive biomarkers to pemetrexed-based chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer. J Cell Physiol. 2014 Jan ;229 (I) :97-9.)。以上文獻(xiàn)結(jié)果一方面說明了本發(fā)明人所采取的研宄方 法的可靠性，另一方面也顯示出被Brachyury所調(diào)控的microRNAs能夠作為潛在的肺癌診 斷標(biāo)記物。本發(fā)明中的一系列microRNAs經(jīng)過分子水平的實驗與臨床患者標(biāo)本的驗證，在 肺癌的診斷中具有很強的特異性，并且以反轉(zhuǎn)錄聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)作為檢測 基礎(chǔ)，通過對高危人群以及臨床影像學(xué)診斷困難的少量外周血的檢測來篩查預(yù)測和診斷腫 瘤的發(fā)生，是完全可行的。
[0011] 本發(fā)明的第一個方面，是提供了與Brachyury高表達(dá)相關(guān)的腫瘤的分子標(biāo)記物， 所述的分子標(biāo)記物為microRNA-3200_5p。
[0012] 所述的miR-3200-5p的具體序列如下：
[0013] hsa-miR-3200-5p AAUCUGAGAAGGCGCACAAGGU MIMAT0017392
[0014] (SEQ ID N0:1)
[0015] 所述的"與Brachyury高表達(dá)相關(guān)的腫瘤"即"Brachyury陽性腫瘤"，是指該腫瘤 中Brachyury呈現(xiàn)出高水平表達(dá)的惡性程度較高（增殖能力相對強）的腫瘤，包括但不限 于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、小腸癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、腦癌、淋巴 癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，提供了所述的miR-3200-5p在制備肺癌早期篩查 或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明可用于對肺癌高危人群和疑似肺癌患者進(jìn)行早期篩查和診斷，本發(fā)明通過 檢測相應(yīng)人群外周血中miR-3200-5p的含量，早期篩查或診斷Brachyury陽性肺癌患者，以 期及早進(jìn)行干預(yù)或治療，預(yù)防轉(zhuǎn)移，最大限度地延長患者生存期降低死亡率。
[0018] 本發(fā)明通過體外基因表達(dá)水平調(diào)控技術(shù)在肺癌細(xì)胞模型中篩選出一系列 microRNAs并進(jìn)行了臨床標(biāo)本的采集和驗證，并發(fā)現(xiàn)miR-3200-5p在肺癌患者外周血中的 含量相對其它肺實質(zhì)病變和正常人群是發(fā)生顯著升高的，且具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。說明 這一 microRNA在外周血中含量的改變，可以作為肺癌診斷的分子標(biāo)記。
[0019] 本發(fā)明的第二方面，是提供了 miR-3200_5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽 性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，所述的試劑具體是指檢測miR-3200-5p表達(dá)量的寡聚核苷 酸；所述的試劑盒具體是指包含檢測miR-3200-5p表達(dá)量的寡聚核苷酸。
[0020] 本發(fā)明提供了用于檢測miR-3200_5p的寡聚核苷酸，所述的寡聚核苷酸包括：反 轉(zhuǎn)錄引物、PCR上游引物、PCR下游引物。
[0021] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，檢測上述microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸的具體 序列如下：
【主權(quán)項】
1. miR-3200_5p作為Brachyury陽性腫瘤的分子標(biāo)記物的應(yīng)用。 2. miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤 試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的Brachyury陽性腫瘤是指該腫瘤中Brachyury 呈現(xiàn)出高水平的表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的Brachyury陽性腫瘤是指肺癌、脊索瘤、黑色素 瘤、乳腺癌、小腸癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、腦癌、淋巴癌、結(jié)腸癌，或 前列腺癌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4任一所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽 性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑是指檢測所述的microRNAs表達(dá) 量的寡聚核苷酸；所述的試劑盒是指包含檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸包括反轉(zhuǎn) 錄引物、PCR特異性引物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試 劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，檢測所述的microRNAs表達(dá)量的寡聚核苷酸序列包含 如SEQ ID NO:2的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫 瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，本發(fā)明的試劑盒包括以下組分： A. Real-Time PCR擴增特異性上游引物，如SEQ ID NO: 2所示，1管，IOuM濃度，IOOuL/ 管； B. Real-Time PCR擴增通用反向下游引物，如SEQ ID N0:3所示，1管，IOuM濃度， IOOuL/ 管； C. 正常標(biāo)準(zhǔn)品，1管，IOuM濃度，IOOuL/管。
9. 檢測miR-3200-5p表達(dá)量的寡聚核苷酸序列在制備診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或 試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述的寡聚核苷酸序列包含如SEQID NO:2的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測miR-3200-5p表達(dá)量的寡聚核苷酸序列在制備診 斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，利用所述的寡聚核苷酸檢測 miR-3200-5p表達(dá)量的方法包括如下步驟： 取樣本中的總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄引物、5XPrimeScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RNase Free dH20反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用EASY Dilution稀釋試劑盒中的正常標(biāo)準(zhǔn)品， 以所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板向反應(yīng)體系中加入PCR特異性引物，通過反轉(zhuǎn)錄聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)檢測miR-3200-5p的表達(dá)量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出被Brachyury調(diào)控后發(fā)生顯著上調(diào)的若干microRNAs，并對這一系列microRNAs進(jìn)行了Real-Time PCR驗證。本發(fā)明提供了Brachyury陽性腫瘤的分子標(biāo)記物，該分子標(biāo)記物miR-3200-5p在肺癌患者中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而在其它肺部實質(zhì)性病變患者和正常人群中則未見表達(dá)水平異常。本發(fā)明還提供了Hsa-miR-3200-5p在制備早期篩查或診斷Brachyury陽性腫瘤試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的miR-3200-5p可以在腫瘤發(fā)生的早期進(jìn)行篩查或診斷，對于腫瘤的早期治療和醫(yī)療成本的節(jié)約都具有重要意義。
【IPC分類】C12N15-113, C12Q1-68
【公開號】CN104878012
【申請?zhí)枴緾N201510266985
【發(fā)明人】肖建如, 陳素, 矯健, 周振華, 姜東杰
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月22日