一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)聯(lián)的snp標(biāo)記檢測及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記檢測及其應(yīng)用，屬于水產(chǎn) 動物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 九孔鮑soperieZia)又稱雜色鮑，隸屬于軟體動物門、 腹足綱、鮑魚科。因鮑腹足發(fā)達(dá)，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，被譽(yù)為"海產(chǎn)八珍"。我國九孔鮑人 工繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)研宄始于20世紀(jì)70年代，90年代中期由于工廠化養(yǎng)鮑技術(shù)的引進(jìn)，九孔 鮑人工養(yǎng)殖形成產(chǎn)業(yè)化，并逐漸成為我國南方水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中不可或缺的養(yǎng)殖品種。但是 伴隨九孔鮑養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，育苗和養(yǎng)成期病害發(fā)生愈來愈頻繁。此外，鮑魚養(yǎng)殖過程中不 注重親鮑選擇與育苗工藝改進(jìn)，造成鮑魚近親繁殖、品種種質(zhì)不斷下降，給九孔鮑養(yǎng)殖業(yè)造 成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重抑制了我國鮑魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，采用遺傳育種技術(shù)培育優(yōu)良 品種的九孔鮑作為親鮑已迫在眉睫。
[0003] 遺傳標(biāo)記主要分為細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記以及DNA分子標(biāo)記，其中， DNA標(biāo)記作為一種新的育種方法已倍受矚目。與常規(guī)育種相比，DNA分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確、穩(wěn) 定、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)。目前常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要有：限制性內(nèi)切酶酶切片段的 長度多態(tài)性（RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP)、錨定簡單重 復(fù)序列（ISSR)、簡單重復(fù)序列（SSR)、單核苷酸多態(tài)性（SNPs)等，其中，SNPs作為第三代分 子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種中得到廣泛應(yīng)用。常將SNPs與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)，分析尋找出影 響性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的候選基因，將其應(yīng)用與后續(xù)育種中。現(xiàn)有技術(shù) 已利用SNPs標(biāo)記研宄暗紋東方飩肌肉生長抑制素基因（MSTN)的多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián) 分析，發(fā)現(xiàn)在MSTN基因中有2個SNP位點(diǎn)（A748G、Cl 197T)，分別位于第二個外顯子和第二 個內(nèi)含子，特別是標(biāo)記C1197T與暗紋東方飩生長性狀顯著相關(guān)。也有學(xué)者對南陽牛肝細(xì)胞 生長因子（HGF)的單核苷酸多態(tài)性與生長性狀相關(guān)聯(lián)，研宄表明在HGF編碼區(qū)中存在4個 SNP位點(diǎn)（288T>C、72801G>A、77172G>T、77408T>G)，且4個位點(diǎn)均與南陽牛生長性狀顯著相 關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與九孔鮑生長相關(guān)的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記可應(yīng)用于九 孔鮑生長性狀的標(biāo)記輔助遺傳育種，進(jìn)行九孔鮑生長性狀的標(biāo)記輔助選擇及應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的 核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示基因序列，該基因的第18位，其堿基為A或T，第299位，其 堿基為T或C。
[0006] 本發(fā)明的分子標(biāo)記用于九孔鮑生長性狀的標(biāo)記輔助遺傳育種。
[0007] 本發(fā)明另一個目的在于提供用于檢測本發(fā)明上述分子標(biāo)記的引物對。
[0008] 所述用于檢測本發(fā)明上述分子標(biāo)記的引物對為引物AMY-FP和引物AMY-RP，所述 引物AMY-FP為SEQ ID NO. 2所示序列，引物AMY-RP為SEQ ID NO. 3所示序列： (1) SEQ ID NO. 2 ：GTTTGTCCGAGTGATGAGTAGTTATTT ； (2) SEQ ID NO. 3 :ACTATTGGTTCCTCGTTGTTGCT。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于提供一種九孔鮑生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的篩選方法，所述 方法包括如下步驟： (1) 以不同九孔鮑的基因組DNA為模板，利用引物AMY-FP和引物AMY-RP分別進(jìn)行擴(kuò) 增，獲得擴(kuò)增片段； (2) 將步驟（1)獲得的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，得到峰圖，篩選出堿基突變位點(diǎn)； (3) 利用chromas軟件對測序的峰圖進(jìn)行基因分型分析，并用SPSS13. 0軟件ANOVA對 九孔鮑生長性狀值與基因型間的關(guān)系進(jìn)行分析； (4) 采用多重比較分析按照不同基因型間殼長、殼寬和體重性狀的差異，最終確定與九 孔鮑殼長、殼寬和體重存在顯著相關(guān)（K0. 05)的SNP (單核苷酸多態(tài)性）位點(diǎn)。
[0010] 所述擴(kuò)增片段的長度為333bp。
[0011] 所述的生長性狀值可以是殼長、殼寬、體重等本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的，常用來表示 九孔鮑生長性狀的參數(shù)或指標(biāo)。
[0012] 所述引物AMY-FP和引物AMY-RP為本發(fā)明SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3分別所示的 引物。
[0013] 所述引物AMY-FP和AMY-RP是用盤鮑α -淀粉酶基因 mRNA (GenBank Accession NO. EF103353. 1)序列設(shè)計(jì)得到。SEQ :atcacccac aaaacaccca gggattacaa gatggctcaa gcgtttactc tggcctacaa ttatgggttt gtccgagtga tgagtagtta tttcttcgga gacgactctg atgctggacc gcctgacaaa gatgttagta tcaatggaga tggctcctgt ggtaatggct gggtttgtga gcacaggtgg gcccccattg ccaacatggt ggcgttcagg aacgctgtgg ctggcactgg catcgaacac tggtttgata gtggggacgt cgtcgccttt gccagaggta acaagggctt ctttgcgatg gcgaagcaag gaaatctgga tcaaaccttc cgaacagggc tgccagccgg agaatactgt gacatcatcc atgattgcca acaaaaggtc acagtggatg gctcaggaaa cgcccacgtt cacatcagca acaacgagga accaatagtc gccattattg ttggtggtcc aactggcagt acaggaggcg gaaacactgg aggaggaact caagcccccg ttacctcagg ccctgttgtc acacccgact atggaagtgg tagttggaaa cacacagtgat attggtacag〇
[0014] 步驟（1)所述擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行優(yōu)化選 擇。
[0015] 步驟（2)所述測序采用直接測序法，測序時對九孔鮑中SNP進(jìn)行檢測，在某一堿基 處在某一堿基處出現(xiàn)雙峰則說明是雜合型，單峰則是純合子，將測序后的序列與野生型比 對，得出突變純合型。
[0016] 利用獲得的SNP位點(diǎn)輔助高產(chǎn)九孔鮑選育的方法，具體是在高產(chǎn)九孔鮑的選擇育 種過程中，對九孔鮑育種候選群體進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型，結(jié)合其他與生長性狀相關(guān)位點(diǎn)的分 型信息，優(yōu)先選擇SNP位點(diǎn)均為GG型的個體和SNP位點(diǎn)為CC型的個體作為高產(chǎn)九孔鮑選 育的親本或者進(jìn)行規(guī)模養(yǎng)殖，避免選擇SNP位點(diǎn)為CC、SNP位點(diǎn)為TT作為親本或者進(jìn)行規(guī) 模養(yǎng)殖。
[0017] 利用本發(fā)明的分子標(biāo)記、引物、篩選方法獲得的SNP位點(diǎn)應(yīng)用于九孔鮑的選擇育 種時，通過所述引物和方法篩選親本，其繁育的后代生長速率顯著高于未篩選的對照組，該 分子標(biāo)記和引物可以高效、快速、簡便地應(yīng)用于九孔鮑的選擇育種。
[0018] 本發(fā)明實(shí)施例通過對九孔鮑α -淀粉酶基因的部分序列進(jìn)行測序和Clustal比 對，篩查到了 2個SNP位點(diǎn)，篩選的第18位SNP位點(diǎn)為GG型的九孔鮑，其殼長、殼寬和體重 均顯著高于CG基因型個體；第299位SNP位點(diǎn)為CC型的九孔鮑，其殼長、殼寬和體重均顯 著高于TT基因型個體。位點(diǎn)18C>G，位點(diǎn)299C>T與九孔鮑殼長、殼寬、體重等重要生長性狀 顯著相關(guān)，該SNP位點(diǎn)用于直接測序法在九孔鮑群體中檢測位點(diǎn)多態(tài)性，并分析位點(diǎn)基因 頻率與九孔鮑生長性狀間的相關(guān)性，在九孔鮑的生長選育過程中，可針對該兩處位點(diǎn)，優(yōu)先 選擇GG型和CC型的個體作為育種親本，以提高選種的效率。
【附圖說明】
[0019] 圖1 :本發(fā)明中有部分九孔鮑基因組DNA瓊脂糖電泳圖，M為Maker。
[0020] 圖2 :本發(fā)明中由引物AMY-FP和AMY-RP獲得長度為333bp的α -淀粉酶基因部 分片段的瓊脂糖電泳圖，M為Maker。
[0021] 圖3 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第18位點(diǎn)單倍型為CC峰值圖。
[0022] 圖4 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第18位點(diǎn)單倍型為GG峰值圖。
[0023] 圖5 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第18位點(diǎn)單倍型為CG峰值圖。
[0024] 圖6 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第299位點(diǎn)單倍型為CC峰值圖。
[0025] 圖7 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第2