99位點(diǎn)單倍型為TT峰值圖。
[0026] 圖8 :本發(fā)明中有α -淀粉酶基因第299位點(diǎn)單倍型為TC峰值圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助 實(shí)施例更好的理解和掌握本發(fā)明。
[0028] 實(shí)施例：九孔鮑α -淀粉酶基因中生長性狀相關(guān)SNP位點(diǎn)18C>G，299C>T與生長性 狀的相關(guān)性分析，及其在高產(chǎn)九孔鮑選育中的應(yīng)用，按照下列步驟進(jìn)行： (A) 九孔鮑基因組DNA提取； (B) 九孔鮑α -淀粉酶基因 SNP位點(diǎn)篩查； (C) 位點(diǎn) 18C>G，299C>T 分型； (D) 18C>G，299C>T基因型與生長性狀的相關(guān)性分析； (E) 位點(diǎn)18C>G，位點(diǎn)299C>T輔助高產(chǎn)九孔鮑選育的方法。
[0029] 具體操作如下： (A)九孔鮑DNA提取。
[0030] 取九孔鮑閉殼肌約0.2g，加入500 μ L IXTE裂解液剪碎，依次加入50 μ L 10%的 SDS、7yL蛋白酶K (20mg/mL)，37°C裂解30min，再調(diào)至55°C裂解l_2h，直至裂解液澄清； 裂解液中加入500 μ L體積比為（25:24:1)酚/氯仿/異戊醇溶液，顛倒混勻，12000rpm/ min離心10min，將上清液小心移至新的離心管中，再加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)抽 提2-3次，取上清避免吸入中間項(xiàng)雜質(zhì)，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20°C冰箱內(nèi)靜置 30min ; 12000rpm/min離心10min，棄上清，取沉淀，加入70%乙醇洗絳2-3次，室溫瞭干，加 入150 μ LI X TE Buffer保存，并用1%瓊脂糖凝膠檢測樣品，紫外分光光度計(jì)檢測濃度及純 度，有部分九孔鮑基因組DNA瓊脂糖電泳圖如圖1所示。
[0031] (B)九孔鮑α -淀粉酶基因 SNP位點(diǎn)篩選。
[0032] 利用 NCBI 中盤鮑 α -淀粉酶基因 mRNA (GenBank Accession NO. EF103353. 1)序 列，設(shè)計(jì)特異性引物AMY-FP和AMY-RP。以不同家系大個(gè)體群體和小個(gè)體群體九孔鮑（58個(gè)） 基因組DNA為模板，利用上述引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 yL :DNA模板 40ng，10XPCR Burrer(Mg2+Plus) 2.5 μ L，dNTP Mix 2 μ L，上游引物 2 μ L，下游引物 2 μ L， rTaq酶（5U/yL) 0.2yL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，60°C退 火30s，72°C延伸lmin30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。PCR產(chǎn) 物純化試劑盒購自上海生工，操作時(shí)，將PCR反應(yīng)液移至一干凈的I. 5mL離心管中，加入5 倍體積的Buffer B3,充分混勻；將混合液全部移入吸附柱中，8000g離心30s，倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放入同一收集管中；向吸附柱中加入500 μ L Wash Solution，9000g離 心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中；重復(fù)上述步驟一次；將空吸附 柱和收集管放入離心機(jī)，9000g離心Imin;在吸附膜中央加入15-40yL Elution Buffer， 室溫靜置l_2min，9000g離心lmin，將所得到的DNA溶液送于上海生工進(jìn)行測序。如圖2所 示，引物AMY-FP和AMY-RP獲得長度為333bp的α -淀粉酶基因部分片段的瓊脂糖電泳圖。
[0033] (C)位點(diǎn) 18C>G，299C>T 分型。
[0034] 采用直接測序法對(duì)九孔鮑中SNP進(jìn)行檢測，在某一堿基處出現(xiàn)雙峰則說明是雜合 型，單峰則是純合子，將測序后的序列與野生型比對(duì)，得出突變純合型。圖3 :本實(shí)施例中有 α -淀粉酶基因第18位點(diǎn)單倍型為CC峰值圖。圖4 :本實(shí)施例中有α -淀粉酶基因第18 位點(diǎn)單倍型為GG峰值圖。圖5 :本實(shí)施例中有α -淀粉酶基因第18位點(diǎn)單倍型為CG峰值 圖。圖6:本實(shí)施例中有α-淀粉酶基因第299位點(diǎn)單倍型為CC峰值圖。圖7:本實(shí)施例中 有α -淀粉酶基因第299位點(diǎn)單倍型為TT峰值圖。圖8 :本實(shí)施例中有α -淀粉酶基因第 299位點(diǎn)單倍型為TC峰值圖。
[0035] (D) 18C>G，2990T基因型與生長性狀的相關(guān)性分析。
[0036] 用游標(biāo)卡尺測量不同家系中的大個(gè)體群體（28個(gè)）和小個(gè)體群體（31個(gè)）的殼長、 殼寬，用電子天平測量每個(gè)個(gè)體的體重。利用One way ANOVA和Duncan檢驗(yàn)，分析位點(diǎn) 18C>G，位點(diǎn)299CXT不同基因型九孔鮑殼長、殼寬、體重均值的差異，檢驗(yàn)SNP18C>G，299C>T 與九孔鮑各生長性狀的相關(guān)性(如表1、表2所示)，最終確定位點(diǎn)18C>G為GG型的九孔鮑， 其殼長、殼寬和體重均顯著高于CC、CG基因型個(gè)體；299C>T為CC型的九孔鮑其殼長、殼寬 和體重均顯著高于TT基因型個(gè)體。
[0037] 表1 18C>G位點(diǎn)不同基因型九孔鮑的生長性狀
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于：該分子標(biāo)記的核苷酸序列為 SEQ ID NO. 1所示基因序列，該基因的第18位，其堿基為A或T，第299位，其堿基為T或C。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于：該分子標(biāo)記應(yīng)用于九孔鮑生長性狀的 標(biāo)記輔助遺傳育種。
3. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于：所述引物對(duì)為引物 AMY-FP和引物AMY-RP，所述引物AMY-FP為SEQ ID NO. 2所示序列，引物AMY-RP為SEQ ID NO. 3所示序列： (1) SEQ ID NO. 2 ：GTTTGTCCGAGTGATGAGTAGTTATTT ； (2) SEQ ID NO. 3 :ACTATTGGTTCCTCGTTGTTGCT。
4. 一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：為如下步驟： (1) 以不同九孔鮑的基因組DNA為模板，利用引物AMY-FP和引物AMY-RP分別進(jìn)行擴(kuò) 增，獲得擴(kuò)增片段； (2) 將步驟（1)獲得的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，得到峰圖，篩選出堿基突變位點(diǎn)； (3) 利用chromas軟件對(duì)測序的峰圖進(jìn)行基因分型分析，并用SPSS13. 0軟件ANOVA對(duì) 九孔鮑生長性狀值與基因型間的關(guān)系進(jìn)行分析； (4) 采用多重比較分析按照不同基因型間殼長、殼寬和體重性狀的差異，最終確定與九 孔鮑殼長、殼寬和體重存在顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于：所述引物AMY-FP和引物AMY-RP為 權(quán)利要求3所述的引物AMY-FP和引物AMY-RP。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于：所述引物AMY-FP和AMY-RP是用盤 鮑a -淀粉酶基因mRNA序列設(shè)計(jì)得到。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于：步驟（1)所述擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于：步驟（2)所述測序采用直接測序法， 測序時(shí)對(duì)九孔鮑中SNP進(jìn)行檢測，在某一堿基處在某一堿基處出現(xiàn)雙峰則說明是雜合型， 單峰則是純合子，將測序后的序列與野生型比對(duì)，得出突變純合型。
9. 利用權(quán)利要求4所述的SNP位點(diǎn)輔助高產(chǎn)九孔鮑選育的方法，其特征在于：在高產(chǎn) 九孔鮑的選擇育種過程中，對(duì)九孔鮑育種候選群體進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型，結(jié)合其他與生長性 狀相關(guān)位點(diǎn)的分型信息，優(yōu)先選擇SNP位點(diǎn)均為GG型的個(gè)體和SNP位點(diǎn)為CC型的個(gè)體作 為高產(chǎn)九孔鮑選育的親本或者進(jìn)行規(guī)模養(yǎng)殖，避免選擇SNP位點(diǎn)為CC、SNP位點(diǎn)為TT作為 親本或者進(jìn)行規(guī)模養(yǎng)殖。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與九孔鮑生長性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用，該分子標(biāo)記為SEQ ID NO.1所示基因序列。本發(fā)明還公開了用于檢測上述分子標(biāo)記的引物AMY-FP和引物AMY-RP，所述引物AMY-FP為SEQ ID NO.2所示序列，引物AMY-RP為SEQ ID NO.3所示序列。本發(fā)明的分子標(biāo)記、引物、篩選方法獲得的SNP位點(diǎn)應(yīng)用于九孔鮑的選擇育種。利用本發(fā)明所述引物和方法篩選親本，其繁育的后代生長速率顯著高于未篩選的對(duì)照組，該分子標(biāo)記和引物可以高效、快速、簡便地應(yīng)用于九孔鮑的選擇育種。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104878004
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510339361
【發(fā)明人】劉東超, 劉建勇, 錢佳慧
【申請(qǐng)人】廣東海洋大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月18日