長鏈非編碼rna以及檢測細(xì)胞及組織中該長鏈非編碼rna表達(dá)水平的引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的長鏈非編碼RNA以及用于檢測細(xì)胞及組織中的該長鏈非編 碼RNA表達(dá)水平的引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)2012年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（GL0B0CAN2012)，在2012年大約有100萬 胃癌新發(fā)病例（952000, 6. 8% )，為全球第五位常見惡性腫瘤；胃癌在全球致死癌癥中為第 三位（723000,8. 8% )。多于70%的胃癌病例發(fā)生在發(fā)展中國家，世界范圍總數(shù)的50%胃 癌發(fā)生在東亞地區(qū)，主要在中國。胃癌在中國是發(fā)病率第二致死率第二的惡性腫瘤（Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray, F.
[0003] GL0B0CAN 2012vl. 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11[Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer ；2013.Available from:http://globocan. iarc. fr, accessed on day/month/ year.)胃癌的高發(fā)病率和高致死率嚴(yán)重威脅著人類的健康，很多胃癌患者在確診時(shí)便已 處于進(jìn)展期，目前手術(shù)切除是唯一根治胃癌的手段。早期篩查和診斷成為胃癌預(yù)測的核 心手段，同時(shí)胃鏡檢查合并組織活檢有助于對(duì)早期胃腫瘤類型的診斷，但由于胃鏡檢查的 昂貴使其無法成為胃癌的廣泛篩查手段。當(dāng)前所應(yīng)用的篩查胃癌的腫瘤標(biāo)志物分析方法 簡單快速，但是其靈敏度和特異性低（Ming-Ming Tsai, Chia-Siu Wang, etc, Potential prognostic, diagnostic and therapeutic markers for human gastric cancer, World J Gastroenterol 20140ctober 14 ;20 (38) :13791-13803)。因此發(fā)現(xiàn)胃癌的早期診斷和治療 的有效方法具有十分重要的意義。
[0004] 結(jié)直腸癌在全球范圍男性中為第三位常見癌癥（746, 000例，占總數(shù)的10. 0% )， 在女性中為第二常見癌癥（614, 000例，占總數(shù)的9.2% )，大約55%的病例發(fā)生在發(fā)達(dá) 國家。結(jié)直腸癌的死亡率占總癌癥死亡率的8. 5%，結(jié)直腸癌導(dǎo)致死亡多發(fā)生在欠發(fā)達(dá) 地區(qū)，而且預(yù)后差（Ferlay J，Soerjomataram I，Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C1Rebelo M1Parkin DM1Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012vl. 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide:IARC CancerBase No.11 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer ；2013.Available from:http://globocan. iarc. fr, accessed on day/month/year·)。近些年來由于腫瘤篩查的普及及診斷手段的發(fā)展， 結(jié)直腸癌的新發(fā)病例及死亡病例均有所下降，但是全球每年仍有約783000新的結(jié)直腸癌 病例被診斷，大約一半的結(jié)直腸癌患者會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌主要的治療 手段為化療，而進(jìn)展期結(jié)直腸癌長久以來被認(rèn)為更加耐受化療（MyoungSookKim, JunaLee andDavidSidransky. DNAmethylationmarkersi ncolorectalcancer. CancerMetastasisR ev (2010) 29:181 - 206)。因此結(jié)直腸癌早期診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及有效的治療的發(fā)現(xiàn)具有 重要的意義。
[0005] 人類基因組中只有不到2%的序列可以編碼蛋白質(zhì)，但70%~90%的人類基因組 DNA是被轉(zhuǎn)錄的，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在過去被認(rèn)為是"暗物質(zhì)"或"垃圾"，近年來人們發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物可參與細(xì)胞的分裂、分化等生命活動(dòng)，有著重要的生物學(xué)功能。非編碼RNA包括miRNA、 PiRNA以及長鏈非編碼RNA等許多類型，其中長鏈非編碼RNA逐漸受到人們的關(guān)注。長鏈 非編碼RNA即長度大于200nt且缺乏開放閱讀框的RNA，大多數(shù)長鏈非編碼RNA具有polyA 尾(Kung, J. T. , D. Colognorij and J. T. Lee, Long noncoding RNAs: past，present，and future.Genetics. 193(3):p. 651-69, 2013. Estellerj M. , Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12(12) :p. 861-74, 2011. Mercer, T. R. , Μ. E. Dinger, and J. S.Mattickj Long non-coding RNAs: insights into functions.Nat Rev Genet. 10(3) :p. 155-9, 2009.)。LncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行 調(diào)控（Gutschner，T. and S. Diederichsj The hallmarks of cancer:a long non-coding RNA point of view. RNA Biol. 9(6) :p. 703-19, 2012·)。
[0006] 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和RNA芯片技術(shù)的成熟，越來越多的IncRNA被發(fā)現(xiàn)， 但是大部分IncRNA的功能并不明確。有研究顯示，IncRNA在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、 侵襲迀移等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用（Maruyama，R. and H. Suzuki，Long noncoding RNA involvement in cancer. BMB Rep. 45(11) :ρ· 604-11，2012.) D 與腫瘤相關(guān)的研究比較 成熟的 IncRNA 主要有 MALAT1，PANDA，PCAT-I 等。MLATl (Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1)在多種惡性腫瘤如肝癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤及肺癌中均 表達(dá)上調(diào)，在轉(zhuǎn)移的肺癌中MLATl的表達(dá)量是非轉(zhuǎn)移肺癌的三倍，是評(píng)估早期肺腺癌生 存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（Ji，P.，et al.，MALAT_l，a novel noncoding RNA，and thymosin beta4predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene.22 (39):p. 8031-41, 2003. Yamadaj K. , et al. , Phenotypic characterization of endometrial stromal sarcoma of the uterus. Cancer Sci.97 (2):p. 106-12, 2006. Lin，R.，et al. ,Alarge noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and a spectrum of human carcinomas. Oncogene. 26 (6):p. 851-8, 2007.)〇 PANDA在人類乳腺癌中高表達(dá)，是乳腺癌化療耐藥的標(biāo)志物（Hung，T.，et al.，Extensive and coordinated transcription of noncoding RNAs within cell-cycle promoters. Nat Genet. 43 (7) :p. 621-9, 2011) 〇 PCATl (prostate cancer associated transcript-1)是在 前列腺癌病例中通過高通量轉(zhuǎn)錄本測序技術(shù)獲得的在前列腺癌中特異性高表達(dá)的IncRNA， 另一個(gè) IncRNA PCA3(The prostate cancer antigen_3gene)已被美國食品和藥品管理局 (FDA)于2012年批準(zhǔn)用于前列腺癌的早期檢測和預(yù)后評(píng)估（Prostate cancer:Biomarkers PCA3and TMPRSS2_ERG:better together. Nat Rev Urol，2014. Porpiglia，F(xiàn).，et al·，The roles of multiparametrie MRIj PCA3, and PHI:which is the best predictor of prostate cancer after a negative biopsy ? Results of a prospective study. J Urol, 2014. Schroder, F. H. , et al. , Prostate cancer antigen 3: diagnostic outcomes in men presenting with urinary prostate cancer antigen 3scores>/ = 100. Urology. 83 (3) :p. 613-6, 2014.)。但與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的IncRNA的研究尚少，IncRNA在 胃癌中的作用機(jī)制以及臨床價(jià)值尚有待深入研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所涉及的堿基序列如SEQ ID NO :1所示的長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNA, LncRNA)(以下記作Lnc21q22. 11)是通過對(duì)正常胃黏膜及3株胃癌細(xì)胞 系（AGS，SGC7901，BGC823)所提取的總RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄本測序并通過生物信息學(xué)分 析得到差異表達(dá)的IncRNA中新的首次發(fā)現(xiàn)的在胃癌組織中表達(dá)降低的IncRNA。通過 3' RACE(rapid_amplification of cDNA ends)和 5' RACE 獲得 Lnc21q22. 11 的全長序列 為1202bp，位于人類21號(hào)染色體長臂。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)胞Lnc21q22. 11可能是胃癌中新 的抑癌基因，在胃癌組織中對(duì)Lnc21q22. 11表達(dá)量的檢測可能是一個(gè)嶄新的腫瘤分子標(biāo)記 物。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)大量胃癌組織標(biāo)本以及癌旁組織標(biāo)本 進(jìn)行檢測，以明確Lnc21q22. 11在胃癌中的表達(dá)量的改變。
[0008] 本發(fā)明首次通過5'RACE和3'RACE技術(shù)鑒定Lnc21q22. 11全長1202bp，全長序列 如SEQ ID NO :1所示，即：
[0009] GCTCAACGGGTTGACGGCGCCCGACGGCCAGGTCCAGCAGGGGCGCCCCGCAGGTGGGGCCTGGCGGCC TTCACCTTCCGGATCCCCGACCCGGCGCGACCGGGAGCCGGCAGACTTTTGTCTAGGAGGGAAAACCCGAGCGCGGG GCCGGCCGCGACATCGCAGCATCCCAAAGAGCTTTTGGAATTTGGGTCACTCCCTTCTACCCCGACGTCACACACTT ACTGCTCCCGGCAGCGGAGGCTCCAGCGCCTGGCCGCGCACAAACCACGACTTCTACCGTCCTGCCGGGGAAAACTA CAGGTCCCGAAATGCACCGCTACGTGCTCAGGCGCAGTGGGCCGGTGCCGCCGACGAGAGTGCACTACTCCGTGCGC AGGCGCAGTGGGCCCGGGCAGAAGACCTGGGGCGCGCTGCTCACTGCGCAGGCGCAGTGAGCCCAGGCGGGCAGCCC TGGCCAGCAGCTCTTGTCCCTGTGGCTGGAGGCTGAAGTCCACGTAGGCCCCGGCGGGGAGCCGCTGGGGTGTAGGC CGGGTGCCTTTGTCCAAGCCTGGCGCCACTGCCCAGACACTTTACTTCAAATTTGGCTTTATTTTCATCATTGATAT TGATTAAAATGACATTCACTTGCCCGGAAAGTAAAAGAGGTCTTCAGCACAAAATATTGCTCCAACAAGCAAGCATA AATCACTGAGATTGAAATGTCATCTATCTTTATTGGCCAACCACATAATCTCCATGAAAATTCTCAACAGAGAGCAA GGAACTCACTTTCTTCTAAGCAAAGACAATTTGGATTTGCCTCGTGGCACTGGCATCTCTTCATGTCTGGACGTCAG ATGTTAGCTTGGTGCCTTTCTCCCTTATCAGGGGGACATTTTGAACCCAGCCGCACCAATGTTCTCATGGATGGTGG CCTTCGATTCTTCTAGATTCAAGATTTGGCTCTTGTACTTTTCCTGCCAGTCCTCTACAATGTACTGGTGGTAGGGG TCATTGGAGTGTTCCCGTCTCTTGGATTTCACAGTGCTCACCAGGATGGCCACGATGATGAAAGAGAACATTCCAAT CATCACCATGAGGTACAGGATGACATAGTAGAAGTTCTCAGCATCAACTTTGGCTTGGAGGGCCTCTTGCTCAGCTG TTGTGTTCTGGCGCCAATTGTCCATATAAGTAATAAAAATCCTTCGGAAGACGTC。
[0010] 本發(fā)明還提供一種檢測胃癌細(xì)胞和組織中的長鏈非編碼RNALnc21q22. 11表達(dá)水 平的特異性半定量RT