核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒、以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒、以及核酸擴(kuò)增反 應(yīng)用套件。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由于基因的利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用了基因的醫(yī)療備 受矚目。另外，即使在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域中，也開發(fā)有較多在品種辨別、品種改良使用了基因 的方法。作為用于利用基因的技術(shù)，廣泛普及有PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶 鏈反應(yīng)）等技術(shù)。如今，PCR在生物體的信息解析中成為必不可缺的技術(shù)。PCR是對(duì)含有成 為擴(kuò)增的對(duì)象的核酸（靶核酸）以及試劑的溶液（反應(yīng)液）實(shí)施熱循環(huán)，從而使靶核酸擴(kuò) 增的方法。作為PCR的熱循環(huán)，通常是以兩個(gè)梯度或者三個(gè)梯度的溫度實(shí)施熱循環(huán)的方法。
[0003] 另一方面，現(xiàn)狀是醫(yī)療領(lǐng)域中以流行性感冒為代表的感染癥的診斷使用免疫層析 試劑盒等簡(jiǎn)易檢查套件成為主流。但是，在上述的簡(jiǎn)易檢查中，存在精度不夠的情況，從而 希望將能夠期待更高的檢查精度的PCR應(yīng)用于感染癥的診斷。另外，醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普通門診 患者等由于診察的時(shí)間受限的關(guān)系，所以將檢查所使用的時(shí)間被限制在短時(shí)間內(nèi)。因此，現(xiàn) 狀是例如流行性感冒的檢查犧牲檢查的精度，通過簡(jiǎn)易的免疫層析試劑盒等的檢查而實(shí)現(xiàn) 短時(shí)間化。
[0004] 根據(jù)上述的情況，在醫(yī)療領(lǐng)域中，為了實(shí)現(xiàn)基于能夠期待更高的精度的PCR進(jìn)行 的檢查，需要縮短反應(yīng)所需的時(shí)間。作為用于短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行PCR的反應(yīng)的裝置，例如在專利 文獻(xiàn)1中公開了一種生物體試樣反應(yīng)裝置，其使填充有反應(yīng)液與不和反應(yīng)液混和且比重比 反應(yīng)液小的液體的生物體試樣反應(yīng)用芯片在水平方向的旋轉(zhuǎn)軸的周圍旋轉(zhuǎn)，從而使反應(yīng)液 移動(dòng)而實(shí)施熱循環(huán)（專利文獻(xiàn)1)。另外，作為PCR的一個(gè)方法，公開有利用了磁性微球的方 法（專利文獻(xiàn)2)、使用磁性微球作為液滴的移動(dòng)機(jī)構(gòu)，使基板上的溫度變化區(qū)域中的液滴 移動(dòng)從而進(jìn)行PCR的熱循環(huán)的方法（專利文獻(xiàn)3)等。
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2009-136250號(hào)公報(bào)
[0006] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2009-207459號(hào)公報(bào)
[0007] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2008-012490號(hào)公報(bào)
[0008] 在專利文獻(xiàn)2、3所記載的以使核酸吸附于微粒的方式快速地進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng) 的方法中，后續(xù)有用于從微粒溶出核酸的工序。存在欲在短時(shí)間內(nèi)高效地進(jìn)行本工序的迫 切期望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于提供溶出效率更高的核酸擴(kuò)增方 法、能夠?qū)崿F(xiàn)該方法的核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒、以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件。 [0010] 本發(fā)明的一實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增方法的特征在于，包括：吸附工序，在該工 序中，向含有核酸的試樣混合吸附液以及微粒，使上述核酸吸附于上述微粒；清洗工序，在 該工序中，利用第一清洗液對(duì)吸附了上述核酸的微粒進(jìn)行清洗；溶出工序，在該工序中，對(duì) 吸附了上述核酸的微粒施加超聲波，使吸附于上述微粒的核酸溶出于溶出液中；以及核酸 擴(kuò)增工序，在該工序中，對(duì)上述溶出液中的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0011] 本發(fā)明的其他的實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增方法的特征在于，包括：吸附工序，在 該工序中，向含有核酸的試樣混合吸附液以及微粒，使上述核酸吸附于上述微粒；清洗工 序，在該工序中，利用第二清洗液對(duì)吸附了上述核酸的微粒進(jìn)行清洗；清洗工序，在該工序 中，利用第一清洗液對(duì)由上述第二清洗液清洗后的吸附了上述核酸的微粒進(jìn)行清洗；溶出 工序，在該工序中，對(duì)吸附了上述核酸的微粒施加超聲波，使吸附于上述微粒的核酸溶出于 溶出液中；以及核酸擴(kuò)增工序，在該工序中，使上述核酸擴(kuò)增。
[0012] 在上述任意的核酸擴(kuò)增方法中，上述核酸可以為核糖核酸（RNA)，包括對(duì)溶出于上 述溶出液中的上述核糖核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄從而合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄工序，在上述核酸擴(kuò)增工 序中進(jìn)行擴(kuò)增的核酸為所合成的上述cDNA。
[0013] 本發(fā)明的一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的特征在于，具有：管，其具有長(zhǎng)邊 方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié)合了核酸的微粒進(jìn) 行清洗的第一清洗液構(gòu)成的第二柱塞、由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相互分離并從結(jié)合了 上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成的第五柱塞；超聲 波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了上述核酸的微粒施加超聲波；以及容器，其能夠與上述管的配置 有上述第一柱塞的一側(cè)連接以及連通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液。
[0014] 本發(fā)明的其他的實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的特征在于，具有：管，其具有 長(zhǎng)邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié)合了核酸的微 粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu)成的第二柱塞、由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相互分離并從結(jié) 合了上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成的第五柱塞； 超聲波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了上述核酸的微粒施加超聲波處理；以及儲(chǔ)液部，其與上述管 的配置有上述第一柱塞的一側(cè)連通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液，上述吸 附液含有醇，上述第一清洗液為酸性。
[0015] 本發(fā)明的其他的實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的特征在于，具有：管，其具有 長(zhǎng)邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié)合了核酸的微 粒進(jìn)行清洗的第二清洗液構(gòu)成的第六柱塞、由油構(gòu)成的第七柱塞、由與油相互分離并對(duì)由 上述第二清洗液清洗后的結(jié)合了上述核酸的微粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu)成的第二柱塞、 由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相互分離并從結(jié)合了上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液 構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成的第五柱塞；以及超聲波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了上述核酸 的微粒施加超聲波。
[0016] 在上述任意的核酸提取用設(shè)備中，也可以具有能夠與上述管的配置有上述第一柱 塞的一側(cè)連接，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的容器。也可以具有與上述管 的配置有上述第一柱塞的一側(cè)連通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的儲(chǔ)液 部。
[0017] 本發(fā)明的一實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的特征在于，具備：上述的核酸 提取用設(shè)備、以及與上述管的配置有上述第五柱塞的一側(cè)連通并含有油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用 容器。也可以具備與上述管的配置有上述第一柱塞的一側(cè)連通，并向上述管導(dǎo)入上述微粒 的箱。
[0018] 本發(fā)明的一實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件的特征在于，具備：上述的核 酸提取用設(shè)備、以及向上述管導(dǎo)入上述微粒的箱。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部分的圖。
[0020] 圖2是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部分的圖。
[0021] 圖3是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部分的圖。
[0022] 圖4A是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的圖。
[0023] 圖4B是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的圖。
[0024] 圖5是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用設(shè)備的主要部分的圖。
[0025] 圖6是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用 容器的圖。
[0026] 圖7A是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用套件的一個(gè)例子的圖。
[0027] 圖7B是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸提取用套件的一個(gè)例子的圖。
[0028] 圖8是示意性地示出一實(shí)施方式所涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的一個(gè)例子的圖。
[0029] 圖9是用于對(duì)一實(shí)施方式的核酸提取方法的變形例進(jìn)行說(shuō)明的示意圖。
[0030] 圖10是示出使用在實(shí)施例中提取的核酸進(jìn)行的PCR的結(jié)果的圖表。
[0031] 附圖標(biāo)記
[0032] 10...第一柱塞；20...第二柱塞；30...第三柱塞；40...第四柱塞；50...第五 柱塞；60...第六柱塞；70...第七柱塞；100...管部；110...栓；120...容器；121...開 口；122··.蓋；130…儲(chǔ)液部；131··.開口；132··.蓋；200··.管；230··.核酸擴(kuò)增反 應(yīng)用容器；231...密封形成部；232...油收納部；232A...油收納空間；233...階梯部； 234A. . ·上密封部；234B...下密封部；235. . ·流路形成部；249. . ·溶出液；410. . ·永久磁 鐵；1000、1020、1030、1040、1100...核酸提取用設(shè)備；2000...核酸提取用套件眞..磁性 粒子。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下對(duì)本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。以下進(jìn)行說(shuō)明的實(shí)施方式說(shuō)明本發(fā)明的 例子。本發(fā)明完全不限定于以下的實(shí)施方式，也包括在不變更本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)被實(shí) 施的各種變形方式。此外不限制以下所說(shuō)明的結(jié)構(gòu)的全部是本發(fā)明的必須構(gòu)成要素。
[0034] 1.核酸提取用設(shè)備
[0035] 本實(shí)施方式的核酸提取用設(shè)備1000具有：管部100、第一柱塞10、第二柱塞20、第 三柱塞30、第四柱塞40、第五柱塞50、以及作為用于對(duì)核酸結(jié)合的微粒進(jìn)行超聲波處理的 超聲波產(chǎn)生部的超聲波產(chǎn)生裝置。
[0036] 圖1是示意性地示出本實(shí)施方式的核酸提取用設(shè)備1000的主要部分的圖。
[0037] L L 管部
[0038] 管部100構(gòu)成核酸提取用設(shè)備1000的主要部分。核酸提取用設(shè)備1000除包括管 部100之外，還包括各種結(jié)構(gòu)。雖未圖示，但核酸提取用設(shè)備1000例如也可以包括與管部 100連接的配管、容器、栓、接頭、泵、控制裝置等。
[0039] 管部100是在內(nèi)部具有空腔且能夠使液體在該空腔內(nèi)沿長(zhǎng)邊方向流通的筒狀的 部分。管部100具有長(zhǎng)邊方向，但也可以彎曲。管部100的內(nèi)部的空腔只要能夠維持收容于 內(nèi)部的液體在管部100內(nèi)呈柱塞形狀，則大小、形狀均不被特別地限定。另外，管部100的 內(nèi)部的空腔的大小、與長(zhǎng)邊方向垂直的剖面的形狀也可以沿著管部100的長(zhǎng)邊方向變化。 對(duì)于是否能夠維持液體在管部100內(nèi)呈柱塞形狀，取決于管部100的材質(zhì)、液體的種類等條 件，因此管部100的與長(zhǎng)邊方向垂直的剖面的形狀在能夠維持液體在管部100內(nèi)呈柱塞形 狀的范圍內(nèi)被適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)。
[0040] 管部100的外形的與長(zhǎng)邊方向垂直的剖面的形狀也不被限定。并且管部100的壁 厚（從內(nèi)部的空腔的側(cè)面至外部的表面的長(zhǎng)度）也不被特別地限定。在管部100的內(nèi)部的 空腔的與長(zhǎng)邊方向垂直的剖面為圓形的情況下，管部100的內(nèi)徑（內(nèi)部的空腔的與長(zhǎng)邊方 向垂直的剖面中的圓的直徑）例如能夠形成0. 5mm以上3mm以下。若管部100的內(nèi)徑在該 范圍內(nèi)，則在管部100的材質(zhì)、液體的種類廣泛的范圍內(nèi)容易形成液體的柱塞，因此優(yōu)選。
[0041] 管部100的材質(zhì)不被特別地限定，例如能夠?yàn)椴Ａ?、高分子、金屬等。此外，作為?部100的材質(zhì)，若選擇玻璃、高分子等對(duì)可見光具有透明性的材質(zhì)，則能夠從管部100的外 部觀察內(nèi)