久磁鐵410遠(yuǎn)離管200,從而能夠使磁性粒子M在第 二柱塞20內(nèi)擴(kuò)散。磁性粒子M的表面為親水性，因此例如在第二柱塞20中，即使減弱磁力 使其擴(kuò)散，也難以進(jìn)入第一柱塞10、第三柱塞30的油中，因此也可以形成上述的方式。
[0160] 具體而言，利用永久磁鐵410使磁性粒子M從容器120移動(dòng)，在磁性粒子M通過第 一柱塞10到達(dá)第二柱塞20時(shí)，使永久磁鐵410遠(yuǎn)離管200,而使磁性粒子M在第二柱塞20 內(nèi)擴(kuò)散。然后，能夠再次通過永久磁鐵410的磁力使磁性粒子M移動(dòng)，通過第三柱塞30,而 導(dǎo)入第四柱塞40。
[0161] 使上述的被從外部施加的磁力變化，而使磁性粒子M振動(dòng)、反復(fù)擴(kuò)散凝結(jié)的方式 也可以適用于磁性粒子M存在于容器120內(nèi)的吸附液的狀態(tài)、磁性粒子M存在于第四柱塞 40 (溶出液）的狀態(tài)。
[0162] 3.8. 2.使第四柱塞從管排出的工序的變形
[0163] 在采用上述的"3. 7.使第四柱塞從管排出的工序"的情況下，在該工序中，將被吸 附的核酸溶出于溶出液的磁性粒子M可以存在于第四柱塞40內(nèi)，但也可以通過進(jìn)一步施加 磁力使其移動(dòng)至第一柱塞10、第二柱塞20、第三柱塞30中的任一個(gè)柱塞或容器120后來進(jìn) 行。由此，能夠在溶出液不含有磁性粒子M的狀態(tài)下，從管200排出第四柱塞40。另外，對(duì) 于使磁性粒子M移動(dòng)的位置而言，若為第二柱塞20或容器120,則即使除去磁力，磁性粒子 M也難以進(jìn)入第三柱塞30的油內(nèi)，因此能夠更加容易地將第四柱塞40從管200排出。
[0164] 4.實(shí)施例
[0165] 示出超聲波處理與核酸溶出量的關(guān)系。
[0166] 4.1實(shí)施例
[0167] 在圖7所示的核酸提取用套件2000的管200的內(nèi)部使用了具有第一柱塞10~第 七柱塞70的核酸提取用設(shè)備。在第一柱塞、第三柱塞、第五柱塞、第七柱塞使用了二甲基硅 油（KF-96L-2CS、信越硅社制）。在第二柱塞（第一清洗液）使用了產(chǎn)品的清洗液I (5· 9M 胍硫氰酸鹽、I. 9% TritonX-100、54mMTris-HCl、ρΗ7· 2)，在第六柱塞（第二清洗液）使用 了清洗液II (5. 3mMTris-HCl、ρΗ7. 5)，在第四柱塞（溶出液）使用了純水。作為核酸提取 試劑使用了 MagExtractor-Viral RNA-(東洋紡社制）。第二柱塞、第六柱塞、以及第四柱塞 的體積分別為25 μ 1、25 μ 1、以及1 μ 1。
[0168] 首先，在容量為3ml的聚乙烯制造容器收容375 μ 1的溶液?吸附液、以及1 μ 1的 磁性微球。而且，利用移液管將50 μ 1的A型流行性感冒患者的鼻腔擦洗液投入容器內(nèi)。對(duì) 容器加蓋，搖動(dòng)容器30秒鐘而對(duì)其進(jìn)行攪拌。然后，卸下管的第一柱塞側(cè)的栓以及容器的 蓋，從而對(duì)管的第一柱塞側(cè)與容器的口進(jìn)行連接。
[0169] 使永久磁鐵接近容器，而使磁性微球匯集于容器的側(cè)壁。接下來，使永久磁鐵從管 的第一柱塞移動(dòng)至第四柱塞的位置。然后，除去了永久磁鐵。這樣，使磁性微球從容器內(nèi)向 管的第四柱塞內(nèi)移動(dòng)。在管內(nèi)的移動(dòng)過程中，磁性微球位于管內(nèi)的第一柱塞、第三柱塞、第 七柱塞內(nèi)的時(shí)間各為3秒鐘，位于第二柱塞內(nèi)的時(shí)間為20秒鐘，位于第六柱塞內(nèi)的時(shí)間為 20秒鐘。
[0170] 接下來，卸下管的第五柱塞側(cè)的栓，利用手使容器變形，從而使第五柱塞以及第四 柱塞向PCR的反應(yīng)容器排出。接下來，使用超聲波產(chǎn)生裝置US-3KS(SND社制）（振蕩：38kHz BLT自激振蕩），對(duì)PCR的反應(yīng)容器中的磁性微球在室溫內(nèi)以120W進(jìn)行超聲波處理兩分鐘。 然后，使用磁鐵使磁性微球匯集于容器的側(cè)壁，使容器傾斜而對(duì)澄清部分進(jìn)行回收。
[0171] 4. 2比較例
[0172] 除了代替超聲波處理而進(jìn)行加熱處理以外與實(shí)驗(yàn)例相同地進(jìn)行了核酸提取。在溶 出時(shí)的加熱處理溫度在25°C~95°C的范圍內(nèi)每隔10°C進(jìn)行一次設(shè)定。
[0173] 4. 3RNA 的檢測(cè)
[0174] 根據(jù) CDC protocol of realtime RTPCR for swine influenza A (HlNl)實(shí)施了實(shí) 時(shí)町-?0?。即，調(diào)制9以1包含0.84]?正向引物、0.84]\1轉(zhuǎn)向引物、0.24]\1探針、1\5即6『 ScriptIII RT/Platinum Taq Mix、I XPCRMaster Mix的溶液，此處，在實(shí)施例或者比較例中 加入已回收的溶液1 μ 1并攪拌后，以表1所示的方案實(shí)施了 RT-PCR。以下示出引物與探針 的序列。
[0175] 引物：
[0176] Primer F ：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGAC
[0177] Primer R ：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA [0178]探針：
[0179] TaqMan probe :FAM_TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA
[0180] [表 1]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，包括： 吸附工序，在該工序中，向含有核酸的試樣混合吸附液以及微粒，從而使所述核酸吸附 于所述微粒； 清洗工序，在該工序中，利用第一清洗液對(duì)吸附了所述核酸的微粒進(jìn)行清洗； 溶出工序，在該工序中，對(duì)吸附了所述核酸的微粒施加超聲波，使吸附于所述微粒的核 酸溶出于溶出液中；以及 核酸擴(kuò)增工序，在該工序中，對(duì)所述溶出液中的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
2. -種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，包括： 吸附工序，在該工序中，向含有核酸的試樣混合吸附液以及微粒，使所述核酸吸附于所 述微粒； 清洗工序，在該工序中，利用第二清洗液對(duì)吸附了所述核酸的微粒進(jìn)行清洗； 清洗工序，在該工序中，利用第一清洗液對(duì)由所述第二清洗液清洗后的吸附了所述核 酸的微粒進(jìn)行清洗； 溶出工序，在該工序中，對(duì)吸附了所述核酸的微粒施加超聲波，使吸附于所述微粒的核 酸溶出于溶出液中；以及 核酸擴(kuò)增工序，在該工序中，使所述核酸擴(kuò)增。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增方法，其特征在于， 所述核酸為核糖核酸（RNA)， 包括對(duì)溶出于所述溶出液中的所述核糖核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄工 序， 在所述核酸擴(kuò)增工序中進(jìn)行擴(kuò)增的核酸為所合成的所述cDNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸擴(kuò)增方法，其特征在于， 所述核酸為核糖核酸（RNA)， 包括對(duì)溶出于所述溶出液中的所述核糖核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄工 序， 在所述核酸擴(kuò)增工序中進(jìn)行擴(kuò)增的核酸為所合成的所述cDNA。
5. -種核酸提取用設(shè)備，其特征在于，具有： 管，其具有長邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié) 合了核酸的微粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu)成的第二柱塞、由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相 互分離并從結(jié)合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成 的第五柱塞； 超聲波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了所述核酸的微粒施加超聲波；以及 容器，其能夠與所述管的配置有所述第一柱塞的一側(cè)連接以及連通，并含有使所述核 酸吸附于所述微粒的吸附液。
6. -種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒，其特征在于，具備： 權(quán)利要求5所述的核酸提取用設(shè)備、以及 與所述管的配置有所述第五柱塞的一側(cè)連通并含有油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器。
7. -種核酸提取用設(shè)備，具有： 管，其具有長邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié) 合了核酸的微粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu)成的第二柱塞、由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相 互分離并從結(jié)合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成 的第五柱塞； 超聲波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了所述核酸的微粒施加超聲波處理；以及 儲(chǔ)液部，其與所述管的配置有所述第一柱塞的一側(cè)連通，并含有使所述核酸吸附于所 述微粒的吸附液， 所述核酸提取用設(shè)備的特征在于， 所述吸附液含有醇，所述第一清洗液為酸性。
8. -種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒，其特征在于，具備： 權(quán)利要求7所述的核酸提取用設(shè)備、以及 與所述管的配置有所述第五柱塞的一側(cè)連通并含有油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器。
9. 一種核酸提取用設(shè)備，其特征在于，具有： 管，其具有長邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié) 合了核酸的微粒進(jìn)行清洗的第二清洗液構(gòu)成的第六柱塞、由油構(gòu)成的第七柱塞、由與油相 互分離并對(duì)由所述第二清洗液清洗后的結(jié)合了所述核酸的微粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu) 成的第二柱塞、由油構(gòu)成的第三柱塞、由與油相互分離并從結(jié)合了所述核酸的微粒溶出所 述核酸的溶出液構(gòu)成的第四柱塞、以及由油構(gòu)成的第五柱塞；以及 超聲波產(chǎn)生部，其用于對(duì)結(jié)合了所述核酸的微粒施加超聲波。
10. -種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒，其特征在于，具備： 權(quán)利要求9所述的核酸提取用設(shè)備、以及 與所述管的配置有所述第五柱塞的一側(cè)連通并含有油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸提取設(shè)備，其特征在于， 具有能夠與所述管的配置有所述第一柱塞的一側(cè)連接，并含有使所述核酸吸附于所述 微粒的吸附液的容器。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸提取設(shè)備，其特征在于， 具有與所述管的配置有所述第一柱塞的一側(cè)連通，并含有使所述核酸吸附于所述微粒 的吸附液的儲(chǔ)液部。
13. -種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒，其特征在于，具備： 權(quán)利要求11或12所述的核酸提取用設(shè)備、以及 與所述管的配置有所述第五柱塞的一側(cè)連通并含有油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用容器。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒，其特征在于， 具備與所述管的配置有所述第一柱塞的一側(cè)連通，并向所述管導(dǎo)入所述微粒的箱。
15. -種核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件，其特征在于，具備： 權(quán)利要求9所述的核酸提取用設(shè)備、以及 向所述管導(dǎo)入所述微粒的箱。
16. -種核酸提取用設(shè)備，其特征在于，具有： 管，其具有長邊方向，并在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第一柱塞、由與油相互分離并對(duì)結(jié) 合了核酸的微粒進(jìn)行清洗的第二清洗液構(gòu)成的第六柱塞、由油構(gòu)成的第七柱塞、由與油相 互分離并對(duì)由所述第二清洗液清洗后的結(jié)合了所述核酸的微粒進(jìn)行清洗的第一清洗液構(gòu)
【專利摘要】本發(fā)明提供核酸擴(kuò)增方法、核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒、以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件。提供一種包括向含有核酸的試樣混合吸附液以及微粒并使上述核酸吸附于上述微粒的吸附工序、利用第一清洗液對(duì)吸附了上述核酸的微粒進(jìn)行清洗的清洗工序、對(duì)吸附了上述核酸的微粒施加超聲波并使吸附于上述微粒的核酸溶出于溶出液中的溶出工序、以及對(duì)上述溶出液中的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增工序的核酸擴(kuò)增方法、能夠?qū)崿F(xiàn)該方法的核酸提取用設(shè)備、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒、以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用套件。
【IPC分類】C12N15-10, C12M1-00
【公開號(hào)】CN104877989
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510088610
【發(fā)明人】花村雅人
【申請(qǐng)人】精工愛普生株式會(huì)社
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年2月26日
【公告號(hào)】US20150240292