專利名稱：一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法
一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于海水貝類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于九孔鮑 (Haliotisdiversicolor aquatilis)養(yǎng)成的節(jié)能、綠色、環(huán)保的養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
鮑為我國(guó)的八大海珍之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。我國(guó)的鮑養(yǎng)殖于20世 紀(jì)70年代開始起步，到80年代中期已形成規(guī)模化生產(chǎn)，此后更是發(fā)展迅猛，沿海各地的 養(yǎng)鮑業(yè)都形成了較大的規(guī)模。然而隨著環(huán)境污染的加劇、養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度 的提高，鮑的病害也相繼發(fā)生，并且有逐年加重的趨勢(shì)，已經(jīng)對(duì)我國(guó)養(yǎng)鮑業(yè)的發(fā)展構(gòu)成 嚴(yán)重威脅。尤其是九孔鮑，近幾年來(lái)鮑養(yǎng)殖中出現(xiàn)病害問(wèn)題頻繁，嚴(yán)重影響了鮑養(yǎng)殖生 產(chǎn)，致使許多養(yǎng)殖戶放棄養(yǎng)殖九孔鮑。因此，探尋九孔鮑的新的養(yǎng)殖方法，提高其存活 率和生長(zhǎng)率，在九孔鮑的生產(chǎn)技術(shù)乃至鮑養(yǎng)殖業(yè)中都具有十分重要的意義。
在鮑的養(yǎng)殖過(guò)程中，使用抗生素對(duì)抑制病原微生物的繁殖，減少其代謝毒素對(duì) 鮑的毒害作用等方面起到了積極的作用，但是長(zhǎng)期使用抗生素，特別是濫用抗生素，其 種種弊端也逐漸顯露出來(lái)。如導(dǎo)致鮑的腸道正常菌群失調(diào)，對(duì)鮑的機(jī)體免疫力產(chǎn)生不良 影響，產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等副作用，給養(yǎng)殖業(yè)的良性發(fā)展和人類的健康都帶來(lái)了潛 在的危害。另外，目前我國(guó)工廠化陸基鮑魚養(yǎng)殖中，主要采用抽取外海水經(jīng)過(guò)沙濾沉淀 后進(jìn)入養(yǎng)殖池，或抽取砂井水進(jìn)行流水養(yǎng)殖，廢水經(jīng)管道直接排入海區(qū)，這種直抽直排 方式存在能耗高，對(duì)海區(qū)污染大的缺點(diǎn)，不僅加重養(yǎng)殖成本，還成為鮑日后發(fā)生病害的 一大隱患。
因此，探尋九孔鮑的新型、節(jié)能、綠色環(huán)保的養(yǎng)殖技術(shù)，開發(fā)安全、優(yōu)質(zhì)、營(yíng) 養(yǎng)的無(wú)公害綠色九孔鮑產(chǎn)品，這些都已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)的共識(shí)。
將微生物制劑運(yùn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖是近年發(fā)展起來(lái)的一種新方法，微生物制劑正廣 泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對(duì)凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，提高成活率、防治病害等越來(lái)越發(fā)揮重要 作用，是當(dāng)今世界研究和應(yīng)用的熱潮。蛭弧菌是寄生于其他細(xì)菌，并能導(dǎo)致宿主細(xì)菌裂 解的一類細(xì)菌；比一般細(xì)菌小，能通過(guò)細(xì)菌濾器，有類似噬菌體的作用；革蘭氏染色呈 陰性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻弧菌等引發(fā)鮑病害的潛在致病菌。用蛭弧菌游泳 體和蛭質(zhì)體的混合制劑作為九孔鮑養(yǎng)成的微生物制劑，兼具游泳體起效快，活力強(qiáng)和蛭 質(zhì)體制備、保存容易，殺菌作用時(shí)間更久和環(huán)境耐受力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。這些特性使得蛭弧 菌混合制劑適合作為一種微生物制劑，以應(yīng)用于九孔鮑的養(yǎng)殖過(guò)程中。另外，本發(fā)明中 新養(yǎng)成方法采用的是周期換水，如此不僅減少養(yǎng)殖用水量和廢水排放，更是減少能耗， 降低了養(yǎng)殖成本；和全封閉循環(huán)養(yǎng)殖法相比，投入少，更易推廣。因此，該方法是一種 便利可行、綠色、低碳、節(jié)能環(huán)保的養(yǎng)殖方式。
已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無(wú)論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國(guó)外，Lenz and Hespell(1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對(duì)動(dòng)物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R.W.，Hespell R.B.Attempts to4grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology, 1978, 119(3) 245-248]。在國(guó)內(nèi)，林茂等O006)研究了蛭弧菌對(duì)魚類細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對(duì) 魚類細(xì)菌沒(méi)有侵染作用[林茂，楊先樂(lè)，薛暉，曹海鵬，邱軍強(qiáng)。蛭弧菌BDH2102對(duì)魚 類細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1) 7-11]。發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有養(yǎng)殖技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型、綠 色、環(huán)保和節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，包 括以下操作步驟
(1)取海域無(wú)污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀和消毒后， 注入養(yǎng)殖池；在養(yǎng)殖池上方蓋遮光布以控制光照強(qiáng)度在500 20001UX之間；在養(yǎng)殖池的 池底騎疊式擺放四腳磚；
(2)選取健康且狀態(tài)良好的九孔鮑稚鮑投入養(yǎng)殖池中，稚鮑的殼長(zhǎng)為1 4cm， 投放密度為300 1000只/m2 ；
(3)向養(yǎng)殖池中噴灑蛭弧菌混合制劑，使池水中的蛭弧菌混合制劑的濃度達(dá) 10 l(fpfu/mL ；
(4)日投餌量控制在九孔鮑體重的5% 15% ；餌料在投入前用濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡15 45min ；每隔5 30天換掉池水一次，每次換水 后噴灑蛭弧菌混合制劑，使池水中的蛭弧菌混合制劑的濃度達(dá)到10 107pfu/mL ；
(5)養(yǎng)殖期間按照曝氣量70 110L/h/m3進(jìn)行曝氣，每天吸污1 2次，并及 時(shí)清理出死鮑。
步驟(1)所述養(yǎng)殖用水的水源水質(zhì)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) (GBl 1607-89)要求，符合農(nóng)業(yè)部《無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要 求。
步驟(1)所述養(yǎng)殖池在注入養(yǎng)殖用水之前用淡水浸泡，消毒后沖洗干凈；所述 養(yǎng)殖用水注入養(yǎng)殖池前，在養(yǎng)殖池進(jìn)水管口包扎一個(gè)200目的網(wǎng)袋，防止養(yǎng)殖用水中的 細(xì)沙入池。
步驟(1)所述遮光布的遮光率為80 95%。
步驟( 所述九孔鮑稚鮑遵循有機(jī)水產(chǎn)養(yǎng)殖原則培養(yǎng)出來(lái)。
步驟(4)所述餌料為新鮮切碎的江蘺、海帶和裙帶菜中的至少一種，或鮑魚人 工配合飼料；每天投餌一次，投餌的時(shí)間在16:00 18:00pm之間。
步驟(3)和⑷所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于 2009年8月7日保藏于湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號(hào)為 CCTCC NO: M 209172。
步驟( 和(4)所述蛭弧菌混合制劑為蛭弧菌游泳體菌液和蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按 細(xì)菌個(gè)數(shù)1 1混合而成。
所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按照以下方法制備得到接種宿主于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng) 基中，在:35°C和200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng)4°C，5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧菌BDFM05，在溫度25 35°C下，以 150 300rpm搖床培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng) 液在4°C溫度下以6000 8000rpm離心15 20η ι后，去除含蛭弧菌游泳體的上清， 得到的沉淀即為蛭弧菌蛭質(zhì)體；將蛭弧菌蛭質(zhì)體用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或 0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO6 109pfo/mL的蛭弧菌 蛭質(zhì)體菌液；
所述蛭弧菌游泳體菌液按照以下方法制備得到將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的 含蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養(yǎng) 基、水、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO6 109pfU/mL的蛭弧菌游泳體菌液。
所述宿主為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。
所述DNB液體培養(yǎng)基是將營(yíng)養(yǎng)肉湯0.相、酪蛋白酸水解物0. 和酵母精提物 o.lg溶于IOOOmL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2 7.6。
單獨(dú)采用向初始養(yǎng)殖池水和換水之后的養(yǎng)殖池中噴灑蛭弧菌混合制劑，或者單 獨(dú)采用將餌料在投入前用濃度為10 IO7PfuAnL的蛭弧菌混合制劑浸泡的方式，或者采 用兩者結(jié)合的方式，來(lái)達(dá)到添加蛭弧菌的目的，均可以達(dá)到本發(fā)明技術(shù)效果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果
(1)本發(fā)明的蛭弧菌混合制劑對(duì)大多數(shù)的水產(chǎn)致病菌有較強(qiáng)的裂解力，而且蛭弧 菌混合制劑本身能改善養(yǎng)殖生物腸道環(huán)境，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高鮑魚免疫力。因此，與其他 的微生物制劑相比，本發(fā)明中的蛭弧菌混合制劑具有提高鮑自身的免疫力，加快鮑的生 長(zhǎng)的特點(diǎn)。
( 現(xiàn)有的鮑養(yǎng)殖技術(shù)采用的都是是流水式養(yǎng)殖，不僅耗費(fèi)了大量的人力、物 力、財(cái)力，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。而利用蛭弧菌混合制劑的鮑養(yǎng)成方法可以減少供水量 的需求，很大程度上節(jié)約了生產(chǎn)成本，而且不會(huì)污染環(huán)境，對(duì)鮑業(yè)及其他水產(chǎn)品養(yǎng)殖的 可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。
(3)蛭弧菌混合制劑包括蛭弧菌蛭質(zhì)體，而蛭弧菌蛭質(zhì)體還具有潛在的滅活疫苗 功能。在蛭質(zhì)體發(fā)育期間，蛭弧菌并不改變宿主細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，使原宿主仍具有免疫 原性，可刺激生物體，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，可有效預(yù)防九孔鮑的細(xì)菌性疾病的發(fā) 生，提高成活率。
(4)另外，筆者實(shí)驗(yàn)證明，采用該蛭弧菌混合制劑可以顯著地提高九孔鮑的生長(zhǎng) 速度。因此，此方法也可以推廣到其他的鮑魚或水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖，增加經(jīng)濟(jì)效益，是新 時(shí)期漁業(yè)增效農(nóng)民增收的可靠技術(shù)支撐。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于 此。對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
實(shí)施例1
(1)用于九孔鮑(Haliotisdiversicoloraquatilis)養(yǎng)成的蛭弧菌混合制劑的制備
蛭弧菌蛭質(zhì)體的制備在一個(gè)裝有IOOmL營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，6牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7.4士0.2)的錐形瓶中接種0.5mL 107cfu/mL嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila,菌種編號(hào)GIM 1.172，來(lái)源于廣東省微生物菌種保藏中心)， 200rpm、！35°C搖床培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)液于4°C、5000rpm離心15η ι，棄上清。用5mL 生理鹽水懸浮沉淀菌體，之后加入到一個(gè)裝有IOOmL DNB液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0. , 酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH值為7.2 7.6)的 錐形瓶中，再接入ImL含103pfu/mL的的蛭弧菌BDFM05 (CCTCC M209172)。恒溫?fù)u 床250rpm、培養(yǎng)36h。培養(yǎng)液于4°C 6000rpm離心20η ι，去除含蛭弧菌游泳體的上 清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭質(zhì)體)，向沉淀中加入IOmL DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌 蛭質(zhì)體，得到濃度為109pfU/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液；；
蛭弧菌游泳體的制備將上述蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭弧菌游泳體的上 清經(jīng)16000rpm離心20η ι后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳體，加入IOmLDNB液體培養(yǎng) 基(營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶于IOOOmL蒸餾水中，pH 值為7.2 7.6)懸浮蛭弧菌游泳體，得到濃度為109pfU/mL蛭弧菌游泳體菌液。。
蛭弧菌混合制劑由蛭弧菌BDFM05游泳體菌液和蛭弧菌BDFM05蛭質(zhì)體菌液按 細(xì)菌數(shù)11混合組成；
(2)應(yīng)用蛭弧菌混合制劑進(jìn)行九孔鮑的養(yǎng)成
實(shí)施地為福建某鮑魚養(yǎng)殖場(chǎng)。實(shí)施地海域的水源水質(zhì)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-^)要求，符合農(nóng)業(yè)部《無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》 (NY5052-2001)要求。海水經(jīng)過(guò)砂濾、沉淀處理，并在進(jìn)入養(yǎng)殖池前，在池進(jìn)水管口包 扎一個(gè)200目的網(wǎng)袋，防止細(xì)砂入池。
鮑魚養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚內(nèi)，每個(gè)水池底面積為20m2，高1.0m，池底共放200 塊四腳磚，分兩側(cè)放置。四腳磚橫向騎疊式放置，每排10塊(兩側(cè)各5塊)，共20列。 稚鮑放置前，各池均用淡水浸泡半個(gè)月，反復(fù)沖洗干凈待用。水池上方蓋上遮光度為 80%的遮光布，避免光照過(guò)強(qiáng)。每個(gè)水池水深45cm，每個(gè)水池投放殼長(zhǎng)約3.2cm(均重 4.59g)的九孔鮑，每池8000只。本發(fā)明設(shè)置一個(gè)生產(chǎn)對(duì)照組，將其編為A組，兩個(gè)平 行，采用正常流水，日換水量為池水量的3倍，每天早上7:00用高壓水沖洗池子，正常 投餌，期間不加蛭弧菌混合制劑，完全的工廠養(yǎng)成方式。其他組具體編排方案如下
1)在養(yǎng)殖水體中添加蛭弧菌混合制劑，但餌料中不添加
共需要48 口水池，分別為 B-l、B-2、B_3、B-4 ； C_l、C_2、C_3、C-4 ； D-U D-2、D-3、D-4 ； E_l、E_2、E_3、E-4 ； F_l、F_2、F_3、F-4 ； G_l、G-2、 G-3、G-4，每組2個(gè)平行。
Bi (B-UB-2、B-3、B-4)5天換(全池)水一-次；
Ci (C-UC-2、C-3、C-4)10天換(全池)水-一次
Dla (D-uD-2、D-3、D-4)15天換(全池)7jC一次
Eg1 (E-UE-2、E-3、E-4)20天換(全池)水--次;
Fi1 (F-UF-2、F-3、F-4)25天換(全池)水一-次；
G 組(G-1、G-2、G-3、G-4)30換(全池)水一次；
B-U C-U D-U E-U F-U G_1組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混 合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到IO1PfuAnL ；
B-2、C-2、D-2、E_2、F_2、G_2組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混 合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到103pfU/mL ；
B-3、C-3、D-3、E_3、F_3、G_3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混 合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到105pfU/mL ；
B-4、C-4、D-4，E_4、F_4、G_4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭弧菌混 合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到107pfU/mL ；
2)在餌料中添加蛭弧菌混合制劑，但在養(yǎng)殖水體中不添加
每次投餌前用蛭弧菌混合制劑浸泡餌料半小時(shí)，而每次換水后養(yǎng)殖水體都不加 蛭弧菌混合制劑。所需48 口水池分為b_l、b_2、b_3、b-4 ； c-U c_2、c_3、c-4 ； d_l、d_2、d_3、d-4 ； e_l、e_2、e_3、e_4 ; f-1、f-2、f-3、f-4 ； g-1、g-2、g-3、 g-4，每組2個(gè)平行。
b 組(b_l、b_2、b_3、b-4) 5 天換(全池)水一次；
c 組(c-1、c-2、c-3、c-4) 10 天換(全池)水一次；
d 組(d_l、d-2, d-3, d-4) I5 天換(全池)水一次；
e 組(e_l、e_2、e_3、e_4) 20 天換(全池)水一次；
f 組(f-1、f-2、f-3、f-4) 25 天換(全池)水一次；
g 組(g-1、g-2、g-3、g-4) 30 天換(全池)水一次；
b_l、c-1、d_l、e_l、f-1、g-1組為投的餌料為經(jīng)過(guò)濃度為IO1PfoAnL的蛭弧菌混合制劑浸泡過(guò)的餌料；
b_2、c-2、d_2、e_2、f-2、g_2組為投的餌料為經(jīng)過(guò)濃度為l(fpfo/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡過(guò)的餌料；
b_3、c-3、d_3、e_3、f_3、g-3組為投的餌料為經(jīng)過(guò)濃度為l(fpfo/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡過(guò)的餌料；
b-4、c-4、d-4、e_4、f_4、g-4組為投的餌料為經(jīng)過(guò)濃度為l(fpfo/mL的蛭弧 菌混合制劑浸泡過(guò)的餌料；
3)在養(yǎng)殖水體和餌料中均添加蛭弧菌混合制劑
每次投餌前餌料用不同濃度的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)，每次換水后養(yǎng)殖水 體也添加蛭弧菌混合制劑。共需48 口水池，分為Bb-1、Bb-2、Bb-3、Bb_4 ； Cc_l、 Cc-2, Cc-3、Cc-4 ； Dd-1> Dd_2、Dd_3、Dd-4 ； Ee-1> Ee-2, Ee-3, Ee-4 ； Ff-1> Ff-2、Ff-3、Ff-4 ； Gg-I、Gg_2、Gg_3、Gg_4 每組 2 個(gè)平行。
Bb 組(Bb-1、Bb-2、Bb-3, Bb_4) 5 天換(全池)水一次；
Cc 組(Cc-1、Cc-2、Cc-3、Cc-4) 10 天換(全池)水一次；
Dd 組(Dd-1、Dd-2、Dd_3、Dd-4) 15 天換(全池)水一次；
Ee 組(Ee-1、Ee_2、Ee_3、Ee-4) 20 天換(全池)水一次；
Ff 組(Ff-1、Ff-2、Ff-3, Ff-4) 25 天換(全池)水一次；
Gg 組(Gg-1、Gg-2、Gg-3、Gg-4) 30 天換(全池)水一次；
Bb-1、Cc-1、Dd-1、Ee-1、Ff-U Gg-I組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭 弧菌混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到IO1PfuAnL,同時(shí)，每次投餌的餌 料用濃度為IO1PfuAnL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)；8
Bb-2、Cc-2、Dd-2、Ee_2、Ff_2、Gg_2組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭 弧菌混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到103pfu/mL，同時(shí)，每次投餌的餌 料用濃度為103pfU/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)；
Bb-3、Cc-3、Dd-3、Ee_3、Ff_3、Gg_3組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭 弧菌混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到105pfu/mL，同時(shí)，每次投餌的餌 料用濃度為105pfU/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)；
Bb-4、Cc-4、Dd-4、Ee_4、Ff_4、Gg_4組為每次換水后立即往水池中潑灑蛭 弧菌混合制劑，使水體中蛭弧菌混合制劑菌體濃度達(dá)到107pfu/mL，同時(shí)，每次投餌的餌 料用濃度為107pfU/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡半小時(shí)。
各組在養(yǎng)殖過(guò)程中，每天18:00pm進(jìn)行投餌，餌料為鮑魚人工配合飼料，投放 量控制在鮑體重的7%。養(yǎng)殖過(guò)程中水池的曝氣量控制在100L/h/m3，每天采用虹吸法進(jìn) 行池底的吸污，并清理出死鮑，記錄數(shù)據(jù)。
(3)九孔鮑養(yǎng)成的生長(zhǎng)情況
歷經(jīng)6個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)最終每口池子所存活的鮑魚數(shù)目，分別從每口池子各隨機(jī) 抽取100只九孔鮑，用尺子測(cè)量其殼長(zhǎng)(cm)，電子天平測(cè)其重量(g)，計(jì)算以下參數(shù)
1)增重率(％ ) = (WrW0)/W0X 100% ；
2)殼長(zhǎng)增長(zhǎng)率(% ) = (LrL0)/L0X 100% ；
3)殼長(zhǎng)日平均增長(zhǎng)量(μιη)=(最終殼長(zhǎng)-3.2)/180 X 10000
4)重量平均日增長(zhǎng)量(mg)=(最終重量-4.5 /180 X 1000
5)存活率=存活數(shù)/8000X100%
(4)鮑魚免疫指標(biāo)測(cè)定
試驗(yàn)結(jié)束后，每組各取5只九孔鮑，分別檢測(cè)其免疫指標(biāo)。用ImL注射器，5 號(hào)針頭插入鮑的心臟取血，由于血量太少，再用刀片將鮑的腹足從中間切開，吸取滲出 的藍(lán)色血液。將吸取的血液置于小離心管中于4°C過(guò)夜，然后將析出的藍(lán)色血清直接傾 出，進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定。
1)超氧化物歧化酶(SOD)活力的測(cè)定
連苯三酚自氧化速率的測(cè)定，在25°C下，于4.5mL 50mmol/L，Ph = 8.30的 K2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入10 μ L 50mmol/L連苯三酚，迅速搖勻，倒入光徑Icm的 比色杯內(nèi)，在325nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)A值一次，要求自氧化速率在0.0700D/mte左右。 酶活性測(cè)定，在加入連苯三酚前，加入待測(cè)SOD樣，測(cè)得數(shù)據(jù)，按下式計(jì)算酶活性
酶活性=(0.070-A325nm) /minX 100 % X反應(yīng)液總體積X樣液稀釋倍數(shù)/ (0.070X50% X樣液體積)
酶活單位定義每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶 量定義為一個(gè)酶活單位(U/mL)。
2)溶菌酶活力測(cè)定
以溶壁微球菌凍干粉為底物。用O.lmol/L，pH = 6.4的磷酸鹽緩沖液配成底物 懸液(OD57tlnnMU)，取3.0mL該懸液于試管內(nèi)置冰浴中，再加入50yL待測(cè)血清，混合， 測(cè)AO值。然后將試液移入37°C溫浴中置30η ι，取出后再置于冰浴中l(wèi)Omin，以終止反 應(yīng)，測(cè)其A值。溶菌活力隊(duì)按(AcrA) /A式計(jì)算。
(5)攻毒實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從對(duì)照組(A組)和各個(gè)實(shí)驗(yàn)組(B-G組、b_g組、Bb-Gg組)分 別隨機(jī)抽取100只鮑魚，殼長(zhǎng)6.2 7.0cm。每只鮑注射50 μ L濃度為1 X IO8嗜水氣單胞 菌菌液。于鮑腹足部注射細(xì)菌后，按不同組別分別正常養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)期間流水式養(yǎng)殖，日 換水量會(huì)水體的4倍，正常投餌，以50L/h/m3連續(xù)曝氣，水溫為20°C，pH控制在7.2。 3d后記錄各組死亡數(shù)目，最終計(jì)算成活率，采用相對(duì)存活率(Relative Percent Survival， RPS)計(jì)算式
RPS(% ) = (1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)X 100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1-12所示。其中，表1-6分別指不同的換水周期下(5天、10天、 15天、20天、25天、30天)，通過(guò)三種方式添加蛭弧菌混合制劑，其對(duì)九孔鮑養(yǎng)成中鮑 生長(zhǎng)情況的影響。可見(jiàn)，在相同的換水周期下，隨著濃度的升高(101、ΙΟ3、105、107pfu/ mL)，九孔鮑的殼長(zhǎng)、重量以及存活率都有一定程度的增加或提高；并且，無(wú)論采用何 種換水周期，添加有蛭弧菌混合制劑的實(shí)驗(yàn)組均比對(duì)照組(A組)能更好地促進(jìn)九孔鮑的 生長(zhǎng)。從表中可以看出，三種不同的蛭弧菌混合制劑添加方式中，直接水體添加的效果 優(yōu)于餌料浸泡，而兩者都加的效果最優(yōu)。
表7-12分別指在不同的換水周期下，通過(guò)三種方式添加蛭弧菌混合制劑，其對(duì) 九孔鮑免疫力的影響。表中可以看出，無(wú)論采用何種換水周期，添加了蛭弧菌混合制劑 的實(shí)驗(yàn)組，其鮑魚的超氧化物歧化酶60D)活性、溶菌酶活性值都高于對(duì)照組。可見(jiàn)， 無(wú)論是在水體，還是在餌料，抑或兩者中都添加蛭弧菌混合制劑，都能顯著地增強(qiáng)鮑魚 的免疫力。
表13指攻毒實(shí)驗(yàn)中各組的相對(duì)存活率。結(jié)果表明，A組的相對(duì)存活率為0，而 其他實(shí)驗(yàn)組的鮑魚均有較高的相對(duì)存活率，均達(dá)到85%以上。在相同的換水周期下，隨 著蛭弧菌混合制劑濃度的升高，相對(duì)存活率也逐漸升高；從不同換水周期來(lái)看，相同濃 度下的各組對(duì)蝦相對(duì)存活率沒(méi)有顯著的變化。三種不同的蛭弧菌混合制劑添加方式中， 直接水體添加的效果優(yōu)于餌料浸泡，而兩者都加的效果最優(yōu)。這間接說(shuō)明蛭弧菌混合制 劑中的蛭弧菌蛭質(zhì)體能夠發(fā)揮一個(gè)潛在疫苗的作用，增強(qiáng)九孔鮑的免疫力。
水質(zhì)方面，氨態(tài)氮用次溴酸納氧化法測(cè)定(GB12763.4-91)；亞硝酸鹽氮用重 氮-偶氮光度法測(cè)定(GB12763.4-91)。經(jīng)過(guò)測(cè)定，A組水池中的各項(xiàng)水質(zhì)測(cè)定值均高于 試驗(yàn)組。其中，A組氨態(tài)氮的檢測(cè)結(jié)果為0.083mg/L，高于5天換水周期組(B組、b組、 Bb組)的 0.072-0.075mg/L，10天換水周期組(C 組、c組、Cc組)的 0.072_0.076mg/L， 15天換水周期組(D組、d組、Dd組)的0.073-0.078mg/L，20天換水周期組(Ε組、e 組、Ee 組)的 0.075-0.079mg/L，25 天換水周期組(F 組、f組、Ff組)的 0.075_0.080mg/ L，30天換水周期組(G組、g組、Gg組)的0.076-0.080mg/L ； A組亞硝酸鹽氮的檢測(cè) 結(jié)果為0.012mg/L，高于5天換水周期組(B組、b組、Bb組)的0.005_0.007mg/L，10 天換水周期組(C組、c組、Cc組)的0.005-0.007mg/L，15天換水周期組(D組、d組、 Dd 組)的 0.006-0.008mg/L，20 天換水周期組(Ε 組、e 組、Ee 組)的 0.007_0.008mg/ L，25天換水周期組(F組、f組、Ff組)的0.007-0.009mg/L，30天換水周期組(G組、 g組、Gg組)的0.007-0.010mg/L。結(jié)果表明，無(wú)論是在水體，還是在餌料，抑或兩者 中都添加蛭弧菌混合制劑，都能明顯的改善水質(zhì)，達(dá)到節(jié)水節(jié)能的良好效果。
另外，細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)檢測(cè)方面，分別采用涂布營(yíng)養(yǎng)肉湯平板法和TCBS 平板法檢測(cè)。結(jié)果顯示，A組水體中的細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)分別達(dá)到IO5和IO3的數(shù)量 級(jí)(cfu/mL)，添加蛭弧菌混合制劑的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)分別為IO2 IO3和 IO1 IO2的數(shù)量級(jí)(cfo/mL)，比對(duì)照組低，說(shuō)明蛭弧菌混合制劑能有效控制水體的細(xì)菌數(shù)目。
綜合各方面結(jié)果，添加蛭弧菌混合制劑，能明顯的提高鮑魚的生長(zhǎng)速度，提高 成活率，增強(qiáng)免疫力，而且能夠改善水質(zhì)，達(dá)到節(jié)水節(jié)能的良好效果。
表1 5天換水周期對(duì)九孔鮑生長(zhǎng)情況的影響
權(quán)利要求
1.一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)取海域無(wú)污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀和消毒后，注入 養(yǎng)殖池；在養(yǎng)殖池上方蓋遮光布以控制光照強(qiáng)度在500 20001UX之間；在養(yǎng)殖池的池底 騎疊式擺放四腳磚；(2)選取健康且狀態(tài)良好的九孔鮑稚鮑投入養(yǎng)殖池中，稚鮑的殼長(zhǎng)為1 4cm，投放 密度為300 1000只/m2 ；(3)向養(yǎng)殖池中噴灑蛭弧菌混合制劑，使池水中的蛭弧菌混合制劑的濃度達(dá)10 107pfu/mL ；(4)日投餌量控制在九孔鮑體重的5% 15%；餌料在投入前用濃度為10 107pfo/ mL的蛭弧菌混合制劑浸泡15 45min ；每隔5 30天換掉池水一次，每次換水后噴灑 蛭弧菌混合制劑，使池水中的蛭弧菌混合制劑的濃度達(dá)到10 107pfu/mL ；(5)養(yǎng)殖期間按照曝氣量70 110L/h/m3進(jìn)行曝氣，每天吸污1 2次，并及時(shí)清 理出死鮑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(1)所 述養(yǎng)殖池在注入養(yǎng)殖用水之前用淡水浸泡，消毒后沖洗干凈；所述養(yǎng)殖用水注入養(yǎng)殖池 前，在養(yǎng)殖池進(jìn)水管口包扎一個(gè)200目的網(wǎng)袋，防止養(yǎng)殖用水中的細(xì)沙入池。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(1)所 述遮光布的遮光率為80 95%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(4)所 述餌料為新鮮切碎的江蘺、海帶和裙帶菜中的至少一種，或鮑魚人工配合飼料；每天投 餌一次，投餌的時(shí)間在16:00 18:00pm之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(3)和 (4)所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO M 209172。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(3)和 (4)所述蛭弧菌混合制劑為蛭弧菌游泳體菌液和蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按細(xì)菌個(gè)數(shù)1 1混合 而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于所述蛭弧 菌蛭質(zhì)體菌液按照以下方法制備得到接種宿主于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在35°C和 200rpm搖床培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液經(jīng)4°C，5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀加入至 DNB液體培養(yǎng)基中，接入蛭弧菌BDFM05，在溫度25 下，以150 300rpm搖床 培養(yǎng)36 48h，得到含蛭弧菌蛭質(zhì)體和蛭弧菌游泳體的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4°C溫度下以 6000 8000rpm離心15 20η ι后，去除含蛭弧菌游泳體的上清，得到的沉淀即為蛭弧 菌蛭質(zhì)體；將蛭弧菌蛭質(zhì)體用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO6 109pfo/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液；所述蛭弧菌游泳體菌液按照以下方法制備得到將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭 弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20η ι后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、 水、生理鹽水或0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO6 109pfU/mL的蛭弧菌游泳體菌液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于所述宿主 為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法，其特征在于所述DNB 液體培養(yǎng)基是將營(yíng)養(yǎng)肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.Ig溶于IOOOmL蒸 餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2 7.6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種節(jié)能減排的九孔鮑養(yǎng)殖方法。該方法包括以下步驟取海域無(wú)污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；選取健康且狀態(tài)良好的九孔鮑稚鮑投入養(yǎng)殖池中；向養(yǎng)殖池中噴灑蛭弧菌混合制劑，使池水中的蛭弧菌混合制劑的濃度達(dá)10～107pfu/mL；每天投餌一次，每次餌料投放量控制在九孔鮑體重的5％～15％；餌料在投入前用濃度為10～107pfu/mL的蛭弧菌混合制劑浸泡；每隔5～30天換掉池水一次，每次換水后噴灑蛭弧菌混合制劑。本發(fā)明養(yǎng)殖方法對(duì)九孔鮑的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，提高了九孔鮑的免疫力和存活率，改善了養(yǎng)殖環(huán)境的水質(zhì)。由于蛭弧菌混合制劑對(duì)鮑魚無(wú)毒副作用，適合于鮑魚大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102017915SQ20101027107
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔡俊鵬, 陳小紅 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)