與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及一種與晉南牛生長(zhǎng)性狀 相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 晉南牛是我國(guó)四大地方良種黃牛之一，是我國(guó)珍貴的畜種資源，在我國(guó)物種基因 庫(kù)中占有重要位置。晉南牛不僅具有良好的役用性能，還具有良好的肉用性能。其育肥期 日增重居四大黃牛之首，飼料報(bào)酬和產(chǎn)肉性能均接近世界優(yōu)良肉牛品種。在肉質(zhì)上，晉南牛 強(qiáng)度育肥后肉質(zhì)鮮嫩，色澤鮮紅，禍體脂肪潔白，肌纖維束間脂肪沉積明顯呈大理石狀，符 合高檔牛肉標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行選 擇，從而綜合改良畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀。單核巧酸多態(tài)性（SN巧是一類(lèi)廣泛存在于畜禽基因 組上的分子遺傳標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于畜禽遺傳育種。SNP的檢測(cè)方法有多種，其中Snapshot 測(cè)序技術(shù)主要針對(duì)中等通量的SNP分型項(xiàng)目，其主要原理是將測(cè)序酶、四種巧光標(biāo)記的 ddNTP、緊鄰多態(tài)位點(diǎn)的延伸引物和PCR產(chǎn)物模板按一定體系混合，引物延伸一個(gè)堿基即終 止，經(jīng)測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)峰的顏色可W得知參與反應(yīng)的堿基種類(lèi)，從而判斷樣本在該位點(diǎn)的 基因型。該方法具有分型準(zhǔn)確，通量高，不受SNP位點(diǎn)多態(tài)性特性限制和樣本個(gè)數(shù)限制等優(yōu) 點(diǎn)，非常適用于分子育種中的SNP檢測(cè)。
[0004] Gli3基因是Gli-Kruppel基因家族的成員之一。與家族中的其他基因一樣，Gli3 也有5個(gè)保守的串聯(lián)鋒指結(jié)構(gòu)，鋒指間結(jié)構(gòu)由組氨酸-半脫氨酸連接，該基因在動(dòng)物的生長(zhǎng) 發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Gli3基因編碼的蛋白是一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào) 控關(guān)閉Sonichedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路，研究表明Gli3基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)裂解可產(chǎn)生抑制 因子阻止Sonichedgehog祀基因表達(dá)，而Sonichedgehog又可W抑制Gli3裂解，兩者間 相互制約W保證正常形態(tài)的形成?，F(xiàn)有研究表明Gli3基因?qū)χw的發(fā)育具有抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引 物對(duì)及含有該引物對(duì)的檢測(cè)試劑盒。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位于 晉南?；?3基因如SEQIDNO. 1所示序列的92bp處，此處堿基為C的晉南牛的生長(zhǎng)性能 顯著優(yōu)于此處堿基為T(mén)的晉南牛。
[0008] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對(duì)，包括正
[0009] 本發(fā)明還提供含有上述引物對(duì)的檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒還包括用于Snapshot 檢測(cè)的延伸引物 5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDM聚合酶、Mg2\PCR反應(yīng)緩沖液、測(cè)序酶、 核酸外切酶、熱敏堿性憐酸酶、四種巧光標(biāo)記ddNTP、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板等中的至少一種。
[0011] 本發(fā)明還提供所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定生長(zhǎng)性能優(yōu)的晉南 牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括W下步驟：1)提取待測(cè)晉南牛的基因組DNA;2)W待 巧惜南牛的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出晉南牛化i3基因 162bp片段；3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中92bp處的堿基為C，則待測(cè)晉南牛 屬于生長(zhǎng)性狀優(yōu)的優(yōu)勢(shì)品種。 陽(yáng)01引其中，PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系W25yl計(jì)為：100ng/yl模板DNAliiiaOpmol/ 引物F和R各lyl，PremixTaqTM12. 5^1，（1地2〇 9. 5yl。 陽(yáng)01引 PCR反應(yīng)條件為：95°C10分鐘；94°C30秒，60°C30秒，72°C30秒，35個(gè)循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在晉南牛分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括W下步驟：
[0015] (1)提取待測(cè)晉南牛的基因組DNA;
[0016] (2)通過(guò)Snapshot方法檢測(cè)待測(cè)晉南牛的基因型；
[0017] (3)根據(jù)基因型進(jìn)行生長(zhǎng)性能優(yōu)的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種的選育。 陽(yáng)0化]其中，Snapshot方法中使用的PCR引物對(duì)：包括正向引物F5'-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'和反向引物R5'-GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。
[0019] Snapshot方法中使用的延伸引物為：5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0020] 本發(fā)明對(duì)晉南牛的Gli3基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并對(duì)該基因的C92T與晉 南牛的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過(guò)SAS9. 2軟件GLM程序?qū)⒒蚍中徒Y(jié)果與晉南牛的生長(zhǎng) 性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC型個(gè)體的體重和體斜長(zhǎng)極顯著高于TT型個(gè)體（P<0. 01)， CC型個(gè)體的胸圍顯著高于TT型個(gè)體（P<0. 05)，CT型個(gè)體的體重顯著高于TT型個(gè)體 (P<0. 05)。該位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為晉南牛生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
[0021] 通過(guò)對(duì)晉南牛Gli3基因進(jìn)行單核巧酸多態(tài)性分析，將與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP作為 分子標(biāo)記，為晉南牛生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] (一）本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受晉南牛的年齡、性別等限制，可用于晉南牛 的早期選育，甚至在剛出生時(shí)就可準(zhǔn)確地進(jìn)行篩選，可顯著促進(jìn)晉南牛的育種進(jìn)程。
[0024] (二）檢測(cè)晉南牛Gli3基因單核巧酸多態(tài)性的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便。
[00對(duì) （S)晉南牛的Gli3基因的SNP位點(diǎn)的檢出，為晉南牛生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助 選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中晉南牛S種基因型測(cè)序圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中晉南牛S種基因型Snapshot測(cè)序分型圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0029] 實(shí)施例1與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得
[0030] 1. 1待測(cè)晉南牛血液基因組DNA的提取
[0031] 尾靜脈采集待測(cè)晉南牛血液，采血管中含有抗凝劑，抗凝血樣冷凍保存運(yùn)送至實(shí) 驗(yàn)室。
[0032] 利用BioTeke全血基因組DNA提取試劑盒從抗凝血樣品中提取基因組DNA，具體步 驟如下：
[0033] (1)在1. 5ml離屯、管中，加900y1紅細(xì)胞裂解液，將抗凝全血恢復(fù)到室溫并顛倒混 勻，吸取300y1全血到離屯、管中，室溫放置lOmin，期間多次顛倒混勻；
[0034] (2) 1200化pm離屯、Imin，倒棄紅色上清（上清主要是血清，紅細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，管 底殘留的為白色細(xì)胞團(tuán)為白細(xì)胞）；
[0035] (3)再加300y1紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)，重新裂解殘留的紅細(xì)胞碎片后，重復(fù) W上步驟（1)和（2)，徹底清除紅細(xì)胞碎片，否則會(huì)影響后續(xù)DNA質(zhì)量；
[0036] (4)縱滿(mǎn)振蕩直到管底白細(xì)胞團(tuán)重懸，分散；
[0037] 妨加300y1細(xì)胞核裂解液重懸白細(xì)胞團(tuán)，在55°C溫育30-60min，直到白細(xì)胞裂 解完全，此步驟至關(guān)重要，將影響后續(xù)DNA產(chǎn)量；
[00測(cè) （6)加100y1蛋白沉淀液，縱滿(mǎn)振蕩混勻；
[0039] (7) 1300化pm離屯、5min，管底出現(xiàn)暗褐色蛋白沉淀；小屯、取上清約350y1到新的 1. 5ml離屯、管；
[0040] (8)加300y1異丙醇輕柔顛倒混勻，會(huì)出現(xiàn)大團(tuán)絮狀或絲狀DNA;12000巧m離屯、 Imin，管底可見(jiàn)白色DNA沉淀，倒棄上清；
[0041] (9)加500y1 70%乙醇，顛倒多次漂洗DNA，12000巧m離屯、Imin，小屯、倒掉上清， 然后倒置在吸水紙上輕叩幾下W控干殘留乙醇，槍頭吸盡管底和管壁殘留乙醇，空氣中驚 干靜置lOmin;
[0042] (10)加50-100y1DM溶解液燈6緩沖液），輕彈管壁均勻，室溫或4°C放置一周 重新水化DNA，期間輕彈管壁，幫助充分水化DNA;DNA可存放在2-8°C，如需要長(zhǎng)期保存，需 放在-20°C冰箱。
[0043]1. 2擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核巧酸片段
[0044] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的Gli3基因序列（Gene10:785371)設(shè)計(jì)引物，包括正向引 物F5，-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3,和反向引物貼' -GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。W1. 1 中的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核巧酸片段，如SEQIDNO. 1所示。該SNP 位點(diǎn)位于PCR擴(kuò)增片段的92bp處，此處堿基可W為C或T。 W45]PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系W25y1計(jì)為：lOOng/y1模板DNA1y1，lOpmol/y1引 物F和R各 1y1，PremixTaq? 12. 5y1，dd&O9. 5y1。
[0046]PCR反應(yīng)條件為：95°C10 分鐘；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 個(gè)循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0047] 1.3檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段，獲得SNP標(biāo)記
[0048] 對(duì)1. 2中的P