CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中92bp處的堿基為C， 則待測(cè)晉南牛屬于生長(zhǎng)性狀優(yōu)的優(yōu)勢(shì)品種。s種基因型的測(cè)序峰圖如圖1所示。
[0049] 1.4基因型判定
[0050] 通過(guò)Snapshot方法檢測(cè)待測(cè)晉南牛的基因型，具體步驟如下：
[0051] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的Gli3基因序列（Gene 10:785371)和待測(cè)SNP位點(diǎn)的位 置設(shè)計(jì)用于Snapshot檢測(cè)的延伸引物：5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0052] 對(duì)1. 2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，取3y1PCR產(chǎn)物用Exol(核酸外切酶）和 化stAP(熱敏堿性憐酸酶）進(jìn)行純化，其中Exol用來(lái)去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，化stAP 用來(lái)去除反應(yīng)中剩余的dNTP。反應(yīng)體系為：3ylPCR產(chǎn)物，0.Exol，0. 8yl化stAP， 0. 7y1Exol反應(yīng)緩沖液，3. 3y1dd&O;反應(yīng)條件為：37°C15分鐘；80°C15分鐘。
[0053] 純化后向上述純化體系中加入延伸引物，進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2yl純化 體系，lyl Snapshot Mix試劑，延伸引物，lyl (1地2〇;反應(yīng)條件為：96°C1分鐘； 96°C 10秒，52°C 5秒，60°C 30秒，30個(gè)循環(huán)。
[0054] 取1y1延伸產(chǎn)物，加10y1上樣緩沖液，95°C變性3分鐘，立即冰水浴，上測(cè)序儀 進(jìn)行檢測(cè)。 陽(yáng)化5] 根據(jù)Snapshot的結(jié)果判定SNP位點(diǎn)在檢測(cè)群體中的基因型。根據(jù)樣品的峰圖的 顏色，基因型可分為CC型、CT型和TT型。S種基因型的分型結(jié)果如圖2所示。
[0056] 1. 5上述SNP標(biāo)記在晉南牛優(yōu)勢(shì)品種選育中的應(yīng)用
[0057] 該SNP可作為分子遺傳標(biāo)記，尋找與其相關(guān)或緊密連鎖的影響生長(zhǎng)性能的數(shù)量性 狀基因座，W對(duì)晉南牛直接進(jìn)行基因型選擇或分子標(biāo)記輔助選擇，從而加快晉南牛優(yōu)勢(shì)品 種的選育。
[0058] 實(shí)施例2晉南牛不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析與檢測(cè)應(yīng)用
[0059] 按照實(shí)施例1的方法，對(duì)采自山西晉南地區(qū)不同晉南牛養(yǎng)殖場(chǎng)的361頭晉南牛進(jìn) 行Snapshot檢測(cè)，Gli3基因如SEQ ID NO. 1所示序列92bp位點(diǎn)的分析結(jié)果如表1所示。
[0060] 運(yùn)用SAS9. 2軟件GLM程序進(jìn)行線性模擬分析SNP多態(tài)位點(diǎn)的基因型與生長(zhǎng)性狀 的關(guān)聯(lián)關(guān)系，采用的模型如下： 陽(yáng)06U Yui= ji+gi+hj+ai+eui
[0062]其中，yui為生長(zhǎng)性狀的表型值；y為總體均值；g1為基因型效應(yīng)；h,為場(chǎng)效應(yīng)；a1 為年齡效應(yīng)；eui為隨機(jī)殘差。分析結(jié)果如表2所示。
[0063] 表1SNP位點(diǎn)在晉南牛群體中的基因型頻率及等位基因頻率
[0064]
W65] 由表1可知，CC純合型個(gè)體數(shù)顯著高于TT型，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因。進(jìn)行卡方 適合性檢驗(yàn)，x2= 〇.675<x2。。5(1) = 3.84，可知該位點(diǎn)在群體中處于化'(17-胖61油6'邑平 衡狀態(tài)。
[0066] 表2晉南牛Gli3基因SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析
[0067]
[0068] 注：表2中的數(shù)值表示為最小二乘均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差；表中相同的字母表示差異不 顯著，不同的字母表示差異顯著，大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P<〇. 01)，小寫(xiě)字母表示差異顯 著（P<0. 05)。
[0069] 由表2可知，基因型對(duì)體重、體斜長(zhǎng)和胸圍的影響均達(dá)到了顯著水平（P<0. 05)。CC 型個(gè)體的體重和體斜長(zhǎng)極顯著高于TT型個(gè)體（P<0. 01)，CC型個(gè)體的胸圍顯著高于TT型個(gè) 體（P<0. 05)，CT型個(gè)體的體重顯著高于TT型個(gè)體（P<0. 05)。
[0070] 實(shí)施例3用于檢測(cè)與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的試劑盒
[0071] 試劑盒中的各成分組成如下：
[0072] 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，用于Snapshot檢測(cè)的特異性PCR引物F/R，用于Snapshot檢測(cè)的 延伸引物，Premixhq? (dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反應(yīng)緩沖液），測(cè)序酶，核酸外切 酶，熱敏堿性憐酸酶，四種巧光標(biāo)記ddNTP，dd&O等。 陽(yáng)073] PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系W25y1計(jì)為：lOOng/y1模板DNA(提取的待測(cè)晉南牛 的基因組DNA)lyl，10pmol/yl引物F和R各lyl，Premixl'aq?12.5yl，d地20 9.5yl。[0074]引物F:5' -GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'（沈QIDNO. 2) 陽(yáng)0巧]引物R:5' -GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'（沈QIDNO. 3)
[0076]延伸引物：5'-TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'（沈QIDNO. 4)
[0077]PCR反應(yīng)條件為：95°C10 分鐘；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 個(gè)循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0078]Snapshot檢測(cè)：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，取3y1PCR產(chǎn)物用Exol(核酸外切 酶）和化stAP(熱敏堿性憐酸酶）進(jìn)行純化，其中Exol用來(lái)去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物， 化stAP用來(lái)去除反應(yīng)中剩余的dNTP。反應(yīng)體系為：3ylPCR產(chǎn)物，0.Exol，0. 8yl 化stAP，0. 7y1Exol反應(yīng)緩沖液，3. 3y1d地2〇;反應(yīng)條件為：37°C15分鐘；80°C15分鐘。
[0079] 純化后向上述純化體系中加入延伸引物，進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2yl純化 體系，lylSnapshotMix試劑，延伸引物，lyl(1地2〇;反應(yīng)條件為：96°C1分鐘； 96°C10 秒，52°C5 秒，60°C30 秒，30 個(gè)循環(huán)。
[0080] 取1y1延伸產(chǎn)物，加10y1上樣緩沖液，95°C變性3分鐘，立即冰水浴，上測(cè)序儀 進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列第92bp位點(diǎn)上的堿基，從而判斷樣本的基因型，對(duì)待測(cè) 晉南牛的生長(zhǎng)性能做出判斷。
[0081] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可w對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于晉南牛GLi3基因如SEQID NO. 1所示序列的92bp處，此處堿基為C的晉南牛的生長(zhǎng)性能顯著優(yōu)于此處堿基為T(mén)的晉南 牛。2. 用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物 對(duì)，其特征在于，包括正向引物F5' -GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'和反向引物 R5,-GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3, 。3. 含有權(quán)利要求2所述引物對(duì)的檢測(cè)試劑盒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于SnaPshot檢測(cè) 的延伸引物5' -TCAITCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA 聚合酶、Mg'PCR反應(yīng)緩沖液、測(cè)序酶、核酸外切酶、熱敏堿性磷酸酶、四種熒光標(biāo)記ddNTP、 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板中的至少一種。6. 權(quán)利要求1所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定生長(zhǎng)性能優(yōu)的晉南牛優(yōu)勢(shì) 品種中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測(cè)晉南牛的基因組DNA; 2) 以待測(cè)晉南牛的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng) 擴(kuò)增出晉南牛GLi3基因162bp片段； 3) 檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中92bp處的堿基為C，則待測(cè)晉南牛屬于生 長(zhǎng)性狀優(yōu)的優(yōu)勢(shì)品種。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系 以 25y1 計(jì)為：IOOng/y1 模板DNAIy1，IOpmol/y1 引物F和R各Iy1，PremixTaq? 12. 5y1，CldH2O9. 5y1; PCR反應(yīng)條件為：95°C10 分鐘；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 個(gè)循環(huán)；72°C10 分鐘。9. 權(quán)利要求1所述與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在晉南牛分子標(biāo)記輔助育種中的 應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測(cè)晉南牛的基因組DNA; (2) 通過(guò)SnaPshot方法檢測(cè)待測(cè)晉南牛的基因型； (3) 根據(jù)基因型進(jìn)行生長(zhǎng)性能優(yōu)的晉南牛優(yōu)勢(shì)品種的選育； 其中，SnaPshot方法中使用的PCR引物對(duì)：包括正向引物 SnaPshot方法中使用的延伸引物為：5' -TCAITCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種與晉南牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于晉南牛GLi3基因如SEQ？ID？NO.1所示序列的92bp處，此處堿基為C的晉南牛的生長(zhǎng)性能顯著優(yōu)于此處堿基為T(mén)的晉南牛。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)所述SNP標(biāo)記的引物對(duì)、試劑盒以及檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的方法準(zhǔn)確可靠，操作方便，且不受晉南牛年齡、性別等限制，可用于晉南牛的早期選育，顯著促進(jìn)育種進(jìn)程。同時(shí)該SNP位點(diǎn)的檢出也為晉南牛生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105200136
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510618808
【發(fā)明人】張?jiān)獞c, 賀東昌, 王棟才, 王志俊, 劉文俊, 張喜忠
【申請(qǐng)人】山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月24日