專利名稱：一類新的水稻葉片表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類新的水稻葉片表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片。
背景技術(shù)：
生物基因組中可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列(即基因)僅占總序列的3-5％，對這部分序列進(jìn)行測定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最為密切的信息。20世紀(jì)80年代，高通量的自動測序的出現(xiàn)，使從質(zhì)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫隨機(jī)選取許多cDNA克隆和決定來自非載體兩端的幾百個(gè)堿基的DNA序列成為可能。這些短的DNA序列叫作“表達(dá)序列標(biāo)簽”(Expressed Sequence Tags，簡稱ESTs)。表達(dá)序列標(biāo)簽的概念最早是由Adams等在1992年提出來的(Nature，355，642-644)。1992年Sikela和Matsubara(Sikela，et al.Nucleic Acids Res.19，1837-1843；Matsubara，et al.Nature Genetics，2，173-179)針對獲得大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切需要，提出大規(guī)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)測序的研究戰(zhàn)略。隨后Venter創(chuàng)立了大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)。其基本特征就是從以質(zhì)粒為載體，構(gòu)建完成的目的組織互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫中，隨機(jī)選擇許多cDNA克隆，利用質(zhì)粒上攜帶的通用引物對cDNA兩端進(jìn)行一輪脫氧核糖核酸序列測定，所獲得的來自3′端或5′端的幾百個(gè)堿基的非載體短脫氧核糖核酸(DNA)序列。簡而言之，表達(dá)序列標(biāo)簽是來自表達(dá)基因片段3′端或5′端的短脫氧核糖核酸序列，代表一個(gè)表達(dá)基因的部分轉(zhuǎn)錄片段。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展和生命科學(xué)發(fā)展的需要以及表達(dá)序列標(biāo)簽固有的特點(diǎn)，近幾年，人們發(fā)明了生物芯片。生物芯片(Biochips)的實(shí)質(zhì)就是在面積不大的基片上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識別分子(R.J.Lipshutz et al.，Bio Techniques 19(1995)，442-447；S.P.Fodor et al.，Nature364(1993)，555-556；S.P.Fodor et al.，Science 251(1991)，767-773；A.C.Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的生物芯片主要是用于DNA序列測定，基因表達(dá)譜鑒定(D.J.Lockhart et al.，Nature Biotechnol.14(1996)，1675-1680)和基因突變體的檢測和分析(Feriotto G，et al.，Hum Murat1999；13390-400；Hacia J.G.et al.，Nat Genet 1999；21(suppl 1)42-7；Hacia JG，etal.，Nat Genet 1999；22164-7；Nilsson P，et al.，Biotechniques 1999；26308-16)，所以又稱為DNA芯片或基因芯片。目前，這一技術(shù)以擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域，因此生物芯片已超出了原來的范圍。如今生物芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動電微陣列和蛋白質(zhì)芯片等。1995年10月Patrick Brown和他的同事(Bio Techniques，19(1995)，442-447)提出了cDNA微陣列技術(shù)，M.Schena(Science 1995；270(5235)，467-470)和D.Shalon(Genome Research 1996；6(7)，639-645)等首次制造了cDNA陣列，隨后這項(xiàng)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展。運(yùn)用生物芯片技術(shù)，將獲得的芯片運(yùn)用雜交技術(shù)和掃描技術(shù)對生物芯片進(jìn)行芯片處理、有效數(shù)據(jù)提取、分析和報(bào)告，可獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜(Gene expression profiling)。目前DNA芯片因具有強(qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA序列測定、基因多態(tài)性檢測、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS 2000；9711655-11660)、有機(jī)體的發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基因的協(xié)調(diào)性研究、檢測不同發(fā)育時(shí)期不同組織中基因的波動性活動等。分析基因組規(guī)模化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，將最終導(dǎo)致對細(xì)胞分化的整體性觀察，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、能量代謝、胞間和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)的產(chǎn)生、細(xì)胞遷移的基因組分子圖譜等(Charlie C.Xiang，et al.，Vaccine，2001，22(2002)，22-30)。
通過對表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，有助于發(fā)現(xiàn)并克隆基因家族新成員、基因定位克隆、作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence-TaggedSites，簡稱STSs)染色體的基因定位和基因圖譜制作、導(dǎo)致遺傳病的突變位點(diǎn)的鑒定、分析基因在不同組織中的表達(dá)特異性和建立DNA物理圖譜、新藥的發(fā)明和對細(xì)胞和有機(jī)體的整體研究等。正因?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽具有如此的優(yōu)越性，因此表達(dá)序列標(biāo)簽測序已經(jīng)成為許多基因組研究機(jī)構(gòu)的工作重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一類新的水稻葉片表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片。
本發(fā)明分離出的水稻胚乳cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列。
所說的cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中的一條或數(shù)條的組合。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列。cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的每條序列中的8～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
上述序列標(biāo)簽所組成的生物芯片是在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1～SEQ IDNo.50所示的序列、同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子。所說的載體為固相載體或液相載體。固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。所說的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片是用于生物功能的研究和檢測。所說的生物包括動物、植物以及它們的細(xì)胞、組織器官及其系統(tǒng)；所說的生物功能的研究包括藥物、疫苗、植物的抗逆性、植物育種和植物新品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選、動植物生長和發(fā)育的機(jī)理和藥物的毒理學(xué)；所說的生物功能的檢測包括轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、生物物種的鑒定，包括動植物和微生物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.用獲得的新的表達(dá)序列標(biāo)簽制成表達(dá)序列標(biāo)簽芯片具有許多商用價(jià)值和科研價(jià)值(1)應(yīng)用該表達(dá)序列標(biāo)簽芯片可用于克隆植物的重要農(nóng)藝性狀的基因，如抗干旱、抗鹽堿、抗蟲害和抗低溫等基因的克隆。(2)應(yīng)用該生物芯片也可用于對農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢進(jìn)行早期預(yù)測，篩選出最佳的優(yōu)勢雜交種。(3)應(yīng)用該生物芯片也能用于對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行商品檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)可食轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。(4)應(yīng)用該生物芯片還可用于查找藥物的毒性和副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究，利于對新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選。(5)該生物芯片可用于動植物的育種和植物新品種的產(chǎn)生。(6)該生物芯片還可用于從整體上研究整個(gè)信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，這對生物體基因調(diào)節(jié)的整體性研究具有重要的科研和實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。(7)應(yīng)用該生物芯片還可以運(yùn)用突變體研究植物中胞間和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)植物中的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據(jù)。(8)該生物芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于臨床，醫(yī)藥行業(yè)以及實(shí)際生產(chǎn)中。2.可以利用這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽繪制基因圖譜。如果一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽在基因組中只出現(xiàn)一次，那么它可以做為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)。由表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)建的物理圖譜叫表達(dá)圖或轉(zhuǎn)錄圖(expression or transcript maps)。利用表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因圖制作，可以加快序列標(biāo)簽位點(diǎn)的制作和新基因的染色體定位。3.表達(dá)序列標(biāo)簽序列可以作為基因特異性探針，對組織特異性基因表達(dá)的研究具有重要的作用。4.這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽豐富了表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，并可以最大限度地利用公開的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫信息，大大縮短克隆新的全長互補(bǔ)脫氧核糖核酸的周期并可減少克隆的成本，加快水稻的生物信息積累較薄弱的基因克隆進(jìn)度。5.表達(dá)序列標(biāo)簽還可進(jìn)行新基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。表達(dá)序列標(biāo)簽可以對所有動植物的基因作為一種數(shù)據(jù)庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進(jìn)化圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1cDNA文庫的構(gòu)建根據(jù)Gubler和Hoffman(1983)的流程并且用Dorssers和Postmes(1987)描述的定向克隆策略進(jìn)行的。
一、總RNA的提取采用了Chomezynski和Sacchi(1988)的方法準(zhǔn)備總RNA和為poly(A)+RNA進(jìn)行寡聚dT纖維素層析(Sambrook et al.，1989)。
取水稻胚乳，-20℃保存?zhèn)溆?。取?00mg組織，加1ml溶液D(含4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，5％十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)，0.1Mβ-巰基乙醇)，將組織充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，再加入0.1ml 2M的乙酸鈉(pH4.0)，1ml的水飽和酚和0.2ml的氯仿/異戊醇(49∶1)混合物，充分震蕩混勻后，再冰上靜置15分鐘。樣品4℃離心(10000g)20分鐘，吸取上層水相，與等體積異丙醇混勻，置-20℃冷凍至少1小時(shí)。4℃離心(10000g)20分鐘收集沉淀并溶于0.3ml溶液D中，加入0.03ml 2M乙酸鈉和0.3ml異丙醇，混勻，置-20℃冷凍1小時(shí)，4℃離心(10000g)20分鐘收集沉淀并溶于0.3ml焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的水中，加入0.03ml乙酸鈉和0.75ml乙醇，混勻，置-20℃冷凍1小時(shí)，4℃離心(10000g)20分鐘收集沉淀，用75％乙醇洗滌RNA沉淀，自然干燥后將RNA溶于DEPC處理過的水中，分裝置于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 二、帶poly(A)+的RNA的分離(1)用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床體積為0.5～1.0ml的一次性oligo(dT)-纖維素層析柱柱床。
(2)用滅菌的1×層析柱加樣緩沖液(20mmol/L Tris·HCl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1％十二烷基肌氨酸鈉)沖洗柱床直至流出的液體的pH值小于8.0。
(3)用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使其迅速冷卻至室溫，加等體積的2×層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗出液，再用1倍柱床體積的1×層析柱加樣緩沖液，繼續(xù)收集洗出液。
(4)將收集的全部溶液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。
(5)用5～10倍柱床體積的1×層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，每份1ml，并測定OD值。
(6)用2～3倍柱床體積的滅菌的無RNA酶的洗脫緩沖液(10mmol/LTris·HCl(pH7.6)，1mmol/L EDTA(pH8.0，0.05％SDS))洗脫poly(A)+RNA，以1/3～1/2柱床體積分部收集洗脫液。
(7)測定收集液的OD值。
(8)在poly(A)+RNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L并混勻。加2.5倍體積的冰乙醇，混勻冰浴至少30分鐘。
(9)4℃10000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70％乙醇沉淀，離心片刻，空氣中晾干。
(10)用少量水重溶RNA，測定OD值。
(11)將poly(A)+RNA溶液置于聚丙烯離心管中，加3倍體積乙醇，混勻于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 三、載體DNA的準(zhǔn)備Charon BS噬菌體DNA用HindIII和EcoR I限制性內(nèi)切酶消化幾個(gè)小時(shí)，隨后用小牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理。用1/10體積的0.5M EDTA在65℃溫育45分鐘使磷酸酶失活。用苯酚抽提純化DNA，然后用乙醇沉淀。用背景噬菌斑的生長來檢驗(yàn)噬菌體的質(zhì)量(Sambrook et al.，1989)。
四、cDNA的制備(1)第一鏈的合成將2.5～5.0μg poly(A)+RNA和2.5μg oligo(dT)(12～18)放入0.5mleppendorf管中。加無菌水至終體積為20μl。將試管放入90℃2～3分鐘，并快速放在冰上冷卻。按照下列順序加入試劑11μl第一鏈buffer(5×)(0.25MTris-Cl(pH8.3，室溫)，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.5mg/ml BSA(無核酸酶))、2.75μl dNTP混合物(每種10mM)、1.5μl水和2.5μl MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)。取出5μl放入另一個(gè)eppendorf管中(管中含有1～2μCi[α-32P]dCTP)，用作測試反應(yīng)。第一鏈和測試反應(yīng)管在37℃溫育2小時(shí)，然后往測試管里加入1μl 0.5M EDTA和44μl TE(pH8.0)(10mMTris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA)，儲藏在-20℃以備分析用。將第一鏈合成反應(yīng)管放在冰上。
(2)第二鏈的合成接著加入50μl第一鏈反應(yīng)混合物80μl第二鏈buffer(5×)(0.125MTris-Cl(pH7.5)，0.5M KCl2，25mM MgCl2，25mM DTT，0.5mg/ml BSA)、7.5μl dNTP混合物(每種10mM)、250μl水、10μl Escherichia coli DNA聚合酶(10U/μl)和1.75μl E.coli RNA酶H(2U/μl)。取出40μl放入另一個(gè)eppendorf管中(管中含有5μCi[α-32p]dCTP)，用作第二鏈合成的測試反應(yīng)。兩個(gè)試管15℃溫育4～5小時(shí)，然后往測試管加入2μl 0.5M EDTA和8μl TE(pH8.0)，儲藏在-20℃以備進(jìn)一步分析用。加10μl 0.5M EDTA至第二鏈反應(yīng)管中并用苯酚/氯仿(1∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)抽提，加0.1體積醋酸銨(終濃度為3M，(pH5.2))和2.5體積的乙醇沉淀DNA。-20℃儲存過夜。
(3)產(chǎn)生平末端cDNA雙鏈cDNA離心，用70％的乙醇洗滌并干燥。沉淀用42.5μl水和5μl T4DNA聚合酶buffer(10×)(0.67M Tris-Cl(pH8.7，室溫)，67mM MgCl2，100mM巰基乙醇，166mM(NH4)2SO4，67μM EDTA)、1μl dNTP混合液(每種10mM)、0.5μl BSA(20μg/μl)和1μl T4 DNA聚合酶。反應(yīng)在37℃進(jìn)行30分鐘，然后加入150ml TE(pH8.0)，反應(yīng)混合物用苯酚/氯仿(1∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次。cDNA用0.1體積醋酸銨(終濃度為3M(pH5.2))和2.5體積的乙醇沉淀cDNA，然后在干冰上放置30分鐘或-70℃放置1～2小時(shí)，再離心。
(4)甲基化cDNA微離心收集，用70％的乙醇洗一次，真空干燥，用20μl的水溶解。加入2.5μl的Alu I甲基化酶buffer(10×)(0.5M Tris-Cl(pH7.5)，0.1M EDTA，50mM巰基乙醇。)、1μl S-腺苷甲硫氨酸(2.5mM，新鮮配制)和1.2μl Alu I甲基化酶(5U/μl)。37℃溫育60分鐘。加入60μl水、8.75μl 1M Tris-Cl(pH8.0)、2μl 5M NaCl、2.5μl 2.5mM S-腺苷甲硫氨酸和1.5μl EcoR I甲基化酶(40U/μl)繼續(xù)溫育1～2小時(shí)。然后cDNA用苯酚/氯仿(1∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1體積醋酸銨(終濃度為3M(pH5.2))和2.5體積的乙醇沉淀。
(5)連接體連接和HindIII和EcoR I消化將cDNA沉淀溶解在6μl水中。加入0.5～2μg激活的寡核苷酸pGCTTGAATTCAAGC和無菌水調(diào)節(jié)終體積至10μl。加入1.2μl連接buffer(10×)和0.8μl T4 DNA連接酶15℃溫育過夜。65℃加熱15分鐘使連接酶失活，然后用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoR I消化cDNA，用乙醇沉淀，溶解在20μl的TE(pH8.0)中。
(6)清除未連接的連接體和cDNAs餾分用1％低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳使未連接的連接體和cDNAs餾分從cDNAs中清除。用干凈鋒利的刀片將＞0.8kb的片斷切下并用苯酚抽提(Sambrook et al.，1989)回收。
(7)cDNA與載體臂的連接將回收的cDNA溶解在20μl的水中，并從第二鏈反應(yīng)的測試管中取出1μl用來確定每分鐘總數(shù)(c.p.m.)，并計(jì)算cDNA的量。經(jīng)檢測文庫滴度為3.5×106cfu。
五、噬菌體cDNA文庫的擴(kuò)增要擴(kuò)增的cDNA文庫培養(yǎng)在多個(gè)培養(yǎng)皿以獲得完全裂解，分別收集所有的噬菌體。-20℃儲藏，作為文庫的儲備。
六、Charon BS噬菌體文庫(或克隆)轉(zhuǎn)化pBluescript質(zhì)粒在總體積為200μl的反應(yīng)體系中加入Not I限制性酶消化10～20μg噬菌體文庫(或克隆)DNA 2～6小時(shí)，65℃溫育30～60分鐘以滅活Not I。加入連接buffer(10×)100μl并用水補(bǔ)充至總體積為1ml。加2μl T4 DNA連接酶并在12℃溫育幾個(gè)小時(shí)過夜。用0.1體積醋酸銨(終濃度為3M(pH5.2))和2.5體積的乙醇沉淀DNA。70％的乙醇沉淀DNA，干燥并溶解在10～50μl水。用5μl作為轉(zhuǎn)化合適的宿主E.coli細(xì)胞，然后電穿孔轉(zhuǎn)入細(xì)菌中并在適當(dāng)?shù)目股剡x擇下繁殖以產(chǎn)生平均大小在1.5kb的插入片斷的cDNA文庫。文庫不含有小于500kb的插入片斷和非重組克隆。
實(shí)施例2cDNA測序(主要試劑均購自Amersham Pharmacia公司)根據(jù)《使用MultiScreen96孔板制備質(zhì)粒DNA》說明書操作(1)將獲得的cDNA文庫稀釋，進(jìn)行梯度試驗(yàn)，選出最佳稀釋濃度。
(2)在LB固體培養(yǎng)基(1L蛋白胨10g，酵母5g，NaCl 10g，瓊脂糖15g，pH7.5)上涂板。
(3)37℃培養(yǎng)16小時(shí)左右，直至長出菌落。
(4)將菌落接種在96孔板，每孔加入1ml 2YZ(Amp+)(1L蛋白胨16g，酵母10g，NaCl 5g，Amp終濃度為100μg/ml)接種單細(xì)菌克隆。37℃培養(yǎng)18小時(shí)左右。
(5)1500g離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞。
(6)加入200μl Solution I(50mM Tris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，0.1mg/mlRNA酶A，4℃)，用Tape封口，振蕩混勻。
(7)加入200μl SolutionII(0.2NNaOH，1％SDS，室溫)，用新Tape封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。此時(shí)裂解液應(yīng)該透明、粘稠，不含細(xì)菌碎片。
(8)加入200μl SolutionIII(3M乙酸銨，pH5.5，室溫或4℃)，用新Tape封口，翻轉(zhuǎn)混合10次。
(9)沸水浴5分鐘。
(10)冰水浴10分鐘。
(11)將一塊MultiScreen96孔板置于一塊新的深孔板上。
(12)從第10步中，取出底部清液300μl加入MultiScreen孔中。
(13)2500g離心5分鐘，使裂解液全部轉(zhuǎn)入下面的深孔板中。
(14)取下深孔板，加入200μl異丙醇溶液，用Tape封口，立即翻轉(zhuǎn)混合3次。
(15)離心15分鐘(3990r.p.m.)，沉淀DNA。
(16)用水重新溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (17)用水稀釋通用引物M13(M13正向引物為5’CCCAGTCACGACGTTGTAAA ACG3’，M13反向引物5’AGCGGATAATTTCACACAGG3’)。
注意加到每個(gè)反應(yīng)的DNA和引物的體積要依賴于他們的濃度。調(diào)整加入的無菌水的量，以至于DNA、引物和水的總體積是12μl。反應(yīng)混合物的終體積是20μl。
(18)在96孔板上，將要測序的每個(gè)模板加入下列試劑。
DYEnamic ET終止子試劑預(yù)先混合物8μl引物(5μM) 1μlDNA模板 11μl總體積20μl(19)將混合物輕輕震蕩充分混合。
(20)將96孔板封口并放到預(yù)先設(shè)計(jì)好程序的PCR熱循環(huán)儀上。
(21)按照下列條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
95℃，20s15℃，15s60℃，1min20-30循環(huán)(22)循環(huán)完成后，簡單離心收集管子底部的沉淀。
(23)每個(gè)反應(yīng)管中加2μl 7.5M乙酸銨，-20℃放置至少30分鐘。
(24)離心30分鐘(3500r.p.m.)。
(25)除掉上清夜。
(26)每個(gè)反應(yīng)管中加2.5體積(約55μl)的100％的乙醇或95％的乙醇，并混合好。使乙醇的終濃度為70％。
(27)離心20分鐘(3500r.p.m.)。
(28)除去上清夜，真空干燥或空氣干燥沉淀。不要過分干燥。
(29)將沉淀重新懸浮在10μl的水中，用力震蕩10-20s，確保完全懸浮。簡單離心收集樣品。
(30)將樣品放入Megabace1000中進(jìn)行測序。
(31)獲得的序列剔除載體序列和冗余序列。
(32)用非冗余序列對公共表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將其分類。
實(shí)施例3數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建水稻cDNA質(zhì)粒使用M13正向引物由3’端測序，去除序列中的載體序列并修正3’端測出序列中的模糊堿基后，將片段長度小于100bp的序列視為無效，所有的序列利用DNATOOLs 5.1(1995-1999，S.W.Rasmussen)進(jìn)行比對去除冗余序列后得到50條具3’端Poly(A)的ESTs，將這些ESTs與下載的GenBank水稻數(shù)據(jù)庫(截至2000年10月)用Blastn進(jìn)行搜索，得到的Blast最高分值，概率以及同源序列長度和功能識別描述編輯成ESTs數(shù)據(jù)庫。
實(shí)施例4生物芯片的制備一、對新的表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行重新擴(kuò)增水稻cDNA質(zhì)粒插入片段PCR擴(kuò)增(MBS 0.2S PCR儀-HYBAID公司)，引物為通用引物M13(正向引物為5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，反向引物為5’-AGCGGATAATTTCACACAGG-3’)，每100μl的反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 10μl；25mmol/L MgCl27μl；100ng/μl的正反向引物各1μl，20mmol/L dNTP 1μl，3U的Tag DNA Polymerase(Promega，USA)和約10ng的質(zhì)粒模板。PCR擴(kuò)增流程94℃預(yù)變性4min，每個(gè)循環(huán)于94℃變性30s，58℃退火60s，72℃延伸120s；36-40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。
二、PCR產(chǎn)物處理加入100μl異丙醇和10μl的醋酸鈉(3mol/L，pH5.2)于-20℃沉淀8h，3950rpm 4℃離心35min，棄上清，沉淀用70％的乙醇(W/V)洗滌，干燥后溶解于20μl DNA變性液(0.4mol/L NaOH，10mmol/L EDTA)。
三、芯片制備變性液溶解后的cDNA用于cDNA芯片的點(diǎn)制，cDNA芯片由arrayer(Genomic Solution，USA)使用直徑為0.2mm的384針點(diǎn)制，microarry載體為尼龍膜(Millipore Nylon N+)，所有的點(diǎn)點(diǎn)制為36×24的一級陣，每一個(gè)點(diǎn)在8個(gè)基因構(gòu)成的4×4的二級陣中平行兩次以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。
序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特征長度600個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.1TTTGGAGAGGCGTACCGAAAGAAAAAGATAGAACAGCGAACAGTACATTCGGTTGCGTTCGATAGGATGGCTGACTCCATAAATCTACCACCATATGGAGCTGTTGAACAGGTAGATGCTGTGGTCGATGAGGCGTTCAAGATGGCGAAAGCCGAGGACGGGAAGGCGGTGGATGAAACGGAGTTCAAGAAATTGCTCACTGAGATCCTTGGGGCAGTGATGCTGCAGCTAGATGGCAATCCAATATCGGTTTCGACCAACAGTGTACTCCATGAGCCATGTCCACTTCTTCCACCCTGCTTTCGCCATCGCCGCCGTCGCCATGGTGTCATCACCGAGTGAATAAAAGCAGATGGAAGGAAGCTGATCATAGAATGGACAGTGGAGAATATAATTTCCACTGGTGGTAACAGTAACTGCAATATAATGCTGGTTTTCTTCTGATCAATGAACCAACTGCAGTAACTTGATAGTTGCCATGTAACCTGGAGACCTGGTGCAAATATGTTTGTGTTGGTGTTTGTAACTACGTTCTAAGTGTTTAGTGTCGGAATAATAAGGCTTCTAATTAAGCCAGCAGTTGAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID No.2的信息(a)序列特征長度561個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.2CCATCCTCCTGGCCAGTTTTCCCCTCGTGTACAAGGTTGTCACCTTCCATCCACCAACCAAGGTACTTCCAAGAGAACACAGGCTTTGTCTCAGATTCTTCCATGCCGGCTCACCTGCCCGGCAATGTACATAGAGGAAGATATCCAGACAGGGCCTGTTCTTCTTCAGCTGAACCTCCTGCTTCAGCAAATCCGCGAAGCGTATATGGTAGGTATGGCCTTAGCAGAGAAGGTTTTGTTCAAACATCTGGATTTTGTCAAATGTAATTGTATACATTTCATAGTTTTAGCTGGAGTTTGGCAGCTGTGGTTACCACTGCCATTAAATACCGCCTCATGTTCTTTTATTTCAGATGAGGCATATTTAATTTTAGCTGCATATCCTAGGTTAGTTGAGTGAGTGACTCAATGTAGCAGGCCAGCAGGGTAGTTAGATTTGTCTAGGTGCCTAGCATTTCAGGAGATATATGTTAGAACACAGTGACAGGCTTTGTGCCATCCATTGTTCAACCAAAGCCAGTCATATCATTTATCTAGTTGCACAAAAAAAAAAAAAAAAAA(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特征長度475個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.3AATTCCCACATGCCACCCCATAAGATGATAAGAGGCTATGTGACAAGTGAGAACATGGAGAATCGGCGGATATAGTTAGGCAACACAGAGAGCTGAACCCAACTATCCACTTGTACCCGGTATTAATTTACAGTTTGACATCATAAGGTGTGGTTTGTTCAGTGTAAGTTTAGTAGTTCTGGTCGTCTGGTATTACAAATTACATCACGAAAGTGAGTGCAGCTAGTGGCTAGCCATACAGATATATATACAGGTATAGGTATGTGAAATACAGTTATACCAGCTTTTACAGTTCTGTAGTCTGTGTGAGGAGAAATGTGAAGGCAGAGAATTTTAGATAATGACATATTTCAGAGTTCTGAACTTAGAAATTATTCGGGTAAAAAGATAGAGAAGAACTGTATGCCGTGCGTGGGGATTGAATTGAAATGAAATATGGAAATGATGTTCGCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(4)SEQ ID No.4的信息(a)序列特征長度459個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.4CGGATGACCACGAGGTCGCCACTGGGTGGAAATATATTCCTGTTTAAGATAAGATTTAATCCAAACTTAAAATGCCCAATGCACAATTGGTTTCCAAATGGTTTGGGTTTTTAAAAAAAATACTGTACATAGATTCACCATAAGAACTCCTATGAATAATATCATGAAAATTTGATTGTATTTTGTAAACTTACTCTAAAAAAATTCTAATACCAAATGTCATCTTAAAAAGTAAATATTTTTTAAACATCAAATATTTATGATTGAATAAAGTACCGTTGTACAAAATTTCAAGTCAACTCGACCAATAGATCTATATTTTTTTTTCTTTTTCTTTCAAATGTGTATATCGAACTTCAGTTCACATTCTTTACGATGGTGTATTTGTATTGTAAATATATCATATTTCTAGTAATATGTGAAAACAATGTAATTTCTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA(5)SEQ ID No.5的信息(a)序列特征長度429個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.5TGCAGACTCTGGCACGGACCGCCCCTCCCCAGATCCTCTTCTTGACAGACGTCTACCAAGAAGCCGCTGCAGCAGAAGACTGCAGGCCTTGAAGGTGATGAATGATCTGTCAGGCCTGGAAACGCACCCCTCCCTGATAGATCATGGTTTTCACACATCACATCATTCGCTGAAATCTCCATCTGAACCTAGCCAGAAATGTCTTGTACTATACAATCTGATCCGAACATATTCTACCGTACGCTAGCAGCACAGTTAGCAATGGTTTGGTTAGGTTTAAGGCAGACATCTGGGGTGTAAATAAATGTGTAATAGTCCCAATCAAGCTAATACTATCATGCTCCCATTCCATCCAACCTGGAACAACAATTTCAGATGCATATACTACTACTTTACATTTGTTCCTTTTCCTGCAAAAAAAAAAAAAAA(6)SEQ ID No.6的信息(a)序列特征長度389個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.6GAGAACAAGAGAATACACTGAAAAGACTAGAAAGAAGCTTCTGATGGAGCGAAATGCGATAATCGCTGCCCGCATGGGTTCATTGCCATCTAGCCAAACCAGCCCGGTGCACCGGCAACAGATTACCAGCTGGATATGGAGGCCCCATCGTGAGACCACCACCAACGCAATGCCCCGCCCTAGCAGCTGATCGAGCTGACCGTGGTGATCCGGACAACTAGTGCTCTATACCCCCATTCTTTAGAGGGATATCTCGAAAGCCATGAACTGTGTTGTAGTAGTACCATTCTTTTAGAAGCAGAGAATACTGTATGACGATCTGTTGTTACTGCATAAGAGCTTCTATAAAATTTTTCACGATTTTCACTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAA(7)SEQ ID No.7的信息(a)序列特征長度460個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.7GGATGACGCTGCTGGAGTCCATCCCGACCCACGTGGGAGCTGGAGTGCTACCACGTGTTCTCCGCAGCGTGGGCATCAGCAAGCACCCGGGAAAGCTTCTCCGCCCCGTCGACCCGCGCTCGAGCTGCTCGGCGCGACGGAGCTCGAGCTGAGTGATGAGAAATGCCGGGATCTGTTGTCTTGATTCCTGCACTAACACAGATCCTTTTTCATCTTTTTTTTTTAAAAAAAAATATTTTTCTCAAAGATAGCTAATCCAAACGTGATGCCTCGTAGGTGATTCAGTTCATATTTTTGTACAGAACGAACCAATGAACGATAGCGGCAAGTACACTGGACTGACCTTTCACTTTTGTAGGAGTATGAACTTATACAATGTACTACGTACCTCAATTTGCTACAGTTGTAACTACTATTATACAAGATATAAACACCATCTGTTCGTAAAAAAAAAAAAAAA(8)SEQ ID No.8的信息(a)序列特征長度423個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.8CACGGTGAAACTCCCTAGTGTTCGAATTATTTGACCCAGATGTGCACGAGAAGCACAATTTTTGTATGCTGCCTAGATTGCTTTTAATCAGATGTCACGAGAACACAAGATTTTGTTTTCCTTCTTGTTTGTGGTCCCAAAAAGCCTGATTGTTGTAGCTGCTATGTTTGTTCCCTTTGCTGTCCATCCAGAATTTCTGATAAGATGACACTTGGAAGCACATCCTGCAGCACTCCAGTTACAGGAATGGGTTCAGTTGACTGTAACAGTTTAGCATAGTCCGTAGTGGACAGTAGCTGTGTTGTTTGTCGTGCCCTGTAGTCCTGTACTACCTTGAATTAGGACTGCTAAGTGAACCGATACAAGTACTTGTGACTGAAATCTATACCTCTTTTTTTCTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(9)SEQ ID No.9的信息(a)序列特征長度220個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.9CAACTGCCTGTTTGGCAGATCTTTGTTATATTATAGCATGCAAAGCTAAAAGAGACTCCTATCTGTACAGAGCAAACTGCTGAAGGAGCATTTCTGCTTCAGAGCTGAGCAATTATTTTGTTCTGTTTCCAGCATAAGAGGAGATACTCTGTTGTACTTGGAATCATGAAAATGAATCATATAAAAGCATTTTTGAAGATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(10)SEQ ID No.10的信息(a)序列特征長度460個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.10GATGAGGATGTGCCCTAGGCTGAAGAACACTTGCTGTTTCACGTTAATGAAGTGAGATGGGTATGAACCGGGCACCCTTGTCTGAGAGACCTGATTACTGAAATGTGCCGGTTTGGGGGTCAGAGATTCATCCCGTGGCTGCCTTCATTGGCGGAGTAGCATCCCCAGAAGTAATTAAGCTGGTCACCCAAACCAGTTTGTGCCTTTGCTGGGAACATTTATATTCAACGGGATTGATCACCAATCTCAAGTTTTGGCGTTATACATCCATCTGGTATAGAGCTTTTCGGAACCTCACCCCATTAATTACCTTAGAGTTGCCCCAGATTTTGTATTATGGCCTTCCGGTGCCATGAAAATCACTTGTCCATATAAATGATCATTGTCAGATTTGGAATTATCATCGTATTTACCTGGGAAAAGGTCCCAATACCCCCTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(11)SEQ ID No.11的信息(a)序列特征長度257個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.11AAGGGAATACCAATAACACCTCCCAATTCTAACCAATCCCTCTTCCTGTTTAAATTAAGGTTTTTTCCTTTCCTTAAAATTGGAAAAGGCCGGTTTGGAAACCTGGTAATTTTTCCAAATTAAATTTAAGGTTCCTTTTCCTAATAATAATGTATATTTGAACTTTGGGAATATTTTTGCCCTTGTAAAATATGTTTTTTTTTCCATTGAAATATGAATACAGTGGTATTACTTTTGTGTTAAAAAAAAAAAAAAAA(12)SEQ ID No.12的信息(a)序列特征長度392個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.12CGAGTAATGACCGTCATTGTTCTGCCCCGGATTCGGCACACCTTGAGCTCATCCGACAAGGGACCGCCAGGTGCAGCCACTGGACGGGGATGCACGGCCCGGTGCTTGGATGGTTTCTATGGCGTCTGAAGGGGATGGAGAGGAGGTGTTGATAGGGAGGAGAAGGATCACGTGGCGCCGGGGGCGATAAGAAGAGGCGGACGGATGAGCGACGATATGGAACGATGCTCTGGACACGTGGCGCTATTTTACTATATGTAATCTTGCTCTCAGATTGAGCCACGTGGCTCAATCAGGTGCCAGAGATTGGACCCTGAAATCGGTATTGTAGATTAGAGATGAAATGACTATGGTACTGATTGTTTGCTCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(13)SEQ ID No.13的信息(a)序列特征長度443個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.13TAATGATATTTTCCATTCTGATATTATAAATTGTTCACATTTGGTCCTTTCCTTCGTCACATCACACCAACTTTTCTTTATTAACCCATTACCGCGTATGATCTTCCTGATTGTTTATTCAGATGAAAATTGTTCATAGTCATACTGAGTTTCAAGTTTCCCTTGTACTTGCAGCTATCTCATCATCTGATATACCCGAGAAGTTAGCACAGGCAGACACAGACCCATCATGTGCTGGATTTGGGTGTTAACTGGGTTGTAAGTGTTGTGTTGTATTGAATGTTTGTCGGGTGGTGTTGGATGCTAATTGGGCTGTAACTTTTGTGCTATATGGGTTTTATTGTGTTTGATTGTTGGGTTTATATGGGCTTAGCTCACTTGTTATTTGATACTAATGTAAATGAATATAATATGATTGGGCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(14)SEQ ID No.14的信息(a)序列特征長度418個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.14CGAAGCTAGGATTGATGGTTGCTGGTGGTGTTGTGCTTGCATCTTTTATGACATACGCTTCAGAGCATATTGCTATCTCTGCCTTTTACAAGGGTCAGAGAGATAGAAATGTGTCCAGAAGTAGAAGCATCTGCTTCTTGTTTTAGTCGTTAACCCTGCTCCTACGCAATTCATTTAGTTCATGTACCATATGTACCATCCATGTTGTATCCTATGTCTTTTACACCAAAAAAAAAAACGAATGATGGTATACACAGCGATTCCATTTTTTGATGTCAATGAAGAGTAAATAGGTTCCAATGATGTTCATCCATCACAAATGACATGAAACTTGCAAAACACGTATTGTAAATCTTGTATATAAGCACTCACTGTTATTATTTTATTCTGTTCTTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(15)SEQ ID No.15的信息(a)序列特征長度490個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.15CGGCGAGGACGAGTACCTCAGGAGCTCGGCACGGTGGTACTCCGACTTCCTCAACGCGCGAGCTCCGCCGGTGAAACCCTTCGAATCGGGAAGATATTAATCTGGAGACGTAGACTAGAAGATGAGCAACTTACTACTCTCTCCGTCCCAAAAAAGCCATCCTCTCCTAGTAGAACGATTCTGGATTATACTAGGAGGGGTCATATTTTTAGATTGGGTTTTTTTTGACAGAGAAAGTATCAGTTAATATTTTTTTTTCTTTTTACTATATACGAAAGTGGAAGGTTCCAACCCTCCACGCATAGCCCAAATAATAAAAGCGACATCGTCTTCTAGAAGGAGGCCAGAGAATGTGTATGGATGTAAATGGAAAAATCGGACAGAATCACGAACAGAGGAGAACAGAAACACCTGGAATTCAGAAAAAATGGTGAGAGTTGGCGACCAATTTGAGTTGCTGTACTCCTTTGTGCCAAAAAAAAAAAAAAAA(16)SEQ ID No.16的信息(a)序列特征長度533個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.16TGCGAGGATGCCCATGCTCCTCTTCCTCGGCGTGTACTCGAGGAGAGGTTTTCATGGACCGTCCACGGTGGTGACGGATTGTTCCTGAAGCTGAGACGCTGCGCCACCAACATTGAGCTCACGTTTCTGCGGGGAGCGATGCCGATGCTCATGCTGTCAAATTCGGCGTGCTGGCGTGCAGGGAGGATGGTGCTGCCAATGACGTCGTTGGCTTGGGGAACCTGTCAATGCTCGAGACGGTTGGTGTTTACATCAACTGCAAGGGTGCAACGGCCAGTCAGGTGAAGCAAACGGAGGTGGCTTTGGAGCGAGAGATTGATGCCCACCCCAACCGTCTCGCGTCAATGGCTTCGCTATGTGATTAAATGTGGAGCATTTGTTATAGAGTTATATATACAGCCACAGTATTTACATTTTCTATCCATGATTGAACTTCATTCTGGGAAGAATGAAAAAAAATCCGTACGTGCTTAAATTTAATTTGATCTTCCTTGGAGGGAAGGTTTTGCATTTTGTTCAAAAAAAAAAAAAAA(17)SEQ ID No.17的信息(a)序列特征長度390個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.17ACCCAGAAAGGAGGACTATTAAGGGATCGACCACACCTGGAAGGAGGGAGACAACAATTCGCCACATTTTCTCACAAAGAAGAAAGGTGTAAGCCCACTGAAAGGTCTAGAACACCTGAGCAACTGTCCTGAGCCCATGCAGAAGGCATTCCCAATGGTATTTGGTTATCTGCTAGCCAAAAACTCGCGTGTCCATGCTGATCTGTTCCTAATTCTGAAATCTGAATAGCATATGTAGAACACCTACTGTTTCCAACCAGAGAGGCTGTTGTATGGCGTGCACTTGGTATTCAGTAGTCACCCCAACATAATTAGTGTAATTCAGGATTCTTTACATATGCCTCCATGAGGCTATATTTTTTTTACCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(18)SEQ ID No.18的信息(a)序列特征長度342個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.18GACGGCTCAATGCAGTACGCAAACGACAACGCGTTGCAGATGGCCAAGTCACTCAAGGTCTCACTGCTTGTTCTTGGCTACACATCTACTGCCCTCTCTGTTTTCGCATCAATCGGGCTGCTGTTGCTGGCGCAGCAGATCAACTCTGATGACCAAACCGGAGTAGCTGCCTACCACGTTGTCTGAAACTGTCGATGTGCCCTTGTGTGTGCTCTAATCAGTGGATCATGATTTCATGACACATTCATAGCGTTCTGTTGTACCAGTGTAATTAGCAACGCAACTGGATAATCTGTGTATAAATTACGGAATGTTTCTGTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(19)SEQ ID No.19的信息(a)序列特征長度186個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.19AATAAAGCCCAGACAATGTCAGATGCACGGCATCTTTCTGTTGTCTTTGGCCCAATCTTTTTGTATGCCATCCTATTTGGTTAATTACTAGTACATGATATCCCAGTGGATTCCATCCACCAAGGGCCTACCAGAAATTCTTGTAATACCGATAAATTTAAAAGAAACCCAAAAAAAAAAAAAAAA(20)SEQ ID No.20的信息(a)序列特征長度202個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.20TGACAATATAGAATATTTATGTTTTCAAACTGGTTACAAAAATTATGCTTTGGACTTATGCACTTTGGGTGTAATTGTAATTTATTTTTTGGATCTAGTGACCATTTTCATGTTTAAACATGATATTAGCACTTTGGGTCTGAGTATTTAGTCACAGCCATTATGAGCTGTTCTTGGGACACGGAAAAAAAAAAAAAAAAAA(21)SEQ ID No.21的信息(a)序列特征長度462個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.21GAAAAGGGAGGAGAGTCATCGATACGAGGAAGAGATCTAGCTTTGATTCGGCCTCTGATGATGATGATACCACCTTGTCGGATTCCAGTAGTGACAAGAAATGACACCCCTATGGATAAGAGCCTAGAAGATAGTTTTGTTATAGCTAAGAATGCAGATTCAAGTTCATAGAGGTGGTTCAATGCAGTGCTGCTGGCAATACATTCGAATGGAGTTGGTGAAGAAAGTCAGATTTAGCGACCCAGATCGGTTCACTTGTAAGTTGTAACAGTAGTGTAACATAGTTAATCCTTTTCTCGCCTAACTGTAATGCAGGTAGATTTGTTGAAGTAGCGTATCATGTAAGCAATTTGCAATTTGTAGCGTCTGATGATTGCGCCCAAAATAACAAGCATTATGTGTATCAGCGTATCTAGTTATTTTGTGGCGGATTGGTTGGTAACCTAAAAAAAAAAAAAAAAA(22)SEQ ID No.22的信息(a)序列特征長度538個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.22AGAACAGAGAACTTGATGAAATCACTGTGGAAGCTGCGAGGAACATGTCGGAAATTGAGGACATCATGGTTATCTCTGGCTGTAGCAGCAGCCTAAAGACTCTTGGTTCCCTTGTGAAAGAAGCTGAGGAACTCCTGCCTAGAGAGAGGGCATCCGAAATGGAAGTGATAATTGAGCATCCTACTGTGTCACATCGAAATCAGATAAATTAAATCGTACATAATCTGTATTATTTTAATCCATACCCTCATTGGAAAACTGTGCCGGGGAAATCTGATAATCGATCTGAAAACCGAAATTAAAAATTACTCGTGCCGGCCAGTAATAAAATCAAAGTGAAAATCGGCCTTTAATCAGCTGAGGCCATGTATAGTATTTTTTTCTTACACTTTTGTACATTCCATTTTGCTGCTCTTCTCTTCTTTTTTTCTACTCTTTCCCAATCATGTAACATGTAACTTATCATTTCTATCAATGAAATGGCTATAAGGTAGAGCTGGCTCTACGTCCTTATGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(23)SEQ ID No.23的信息(a)序列特征長度523個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.23CCGAAGATCCCTGGAGACTTCATTCTGAAGTACATATTCCAGATCACGTGCACCGGTCAAGTGGATTGATCTCTCAGTAATTTTCAGCATGATCTTCATCTACCGCATTCTGTTCTTCCTCATGATCACAGGTAAATGAGGATGCCTGCCATGGATTCGGGGGTACCTTGCACAGGAAAAGGCTTCAAAGAAGGAACCTCTTGGCAAGACACCCTCCCTCAGAGGCTACGTTGTGGATCCAGAGCTTGGTCCTAACGAAAGCTAGAATATAAACTGGTTAGCAGATATAGGCCCATTTCTTGCCGGTTCTTGGTGGAATATGTATCTAAGATCAGAGAAACTGGTATTTATACGTTTTGAAACTGAAGCTCAAGCTGATCGGAATACAGGTATATACAGACATGTAATGTGTGAAAAATGGCATCAGAGATGCAGAGTTGACACATAGCTGGTGGTTCAGAATTTACCTGTCTCTTCTTTTACAGATAATTTACGTTCTACATTCAGTAAAAAAAAAAAAAAA(24)SEQ ID No.24的信息(a)序列特征長度539個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.24TATCCTGACTGCTTCGGAAATCAGCATAGCTTTATGTCACGGGAATATTTGCTTATTGTTGGAGTCTGATTGACTGATTGGGAAGGATAAAAGCACAGTCCAGCAGTAATTTTCAAGCTCTATTTGTTGATTGTTCATGGGCTGACCCTGCAAAGTTACTATGGAGGAGTAAATGATATTTTTTGCAGGCTGGAGCTAGTGTCCTAATGTAGATGGTTATTGTCCCAGAGTACCTTGTCATCCTGAGAGGGTCGAAAGAAATTTAAGAAATGCTCGTGCAGCTGATATTAATTTATGTAGTTGCTTACTATAGCAAGTTAATGCAATCACTTTTGGTTAAGGAAAGAAGATGCACGTGGGTTTCCCAGTCACTTATTTTCTTTTTGTTATATAAACAGCGGGTCACGCGGTATTTGGTTGTCATGACTCATGATTAAACAGAAACAACTCATCTTCAGTGGTTTGTAAATTACTATGGGCAAGCAATTGCCAAATAATTTTATTTCGAGCTTGCTGTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(25)SEQ ID No.25的信息(a)序列特征長度381個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.25ATCTTCTCTGTTATAGCCTGAGGGTACTTCTGCGAGGAATCCCCATGCGACAACAGGGTCACTCATGTATGCCCGAACTGAGGCTTCCTCTTGTAGGCACATTGCTGCCCCGGCCACCAGCCTGGTTCAAATCTCCCCTTGGGTAGTCACCTCTAAGAAGTGGGTCCACCAGCTCATGGTGCCTACTTGGATTTTTGAGCACTGGGTTTGGCCTGTTGATCACAAATAAATTCAATGATCAGAAACTTTGTAGAAGGGCATCTTATTTGACTATTTTTTATCCCAAAATTTCATAGCCTTTTTTTTATGTTCCATTTGTTTGAATTATATGACCCAGTTATAGAAGTGGTTGTACTCTGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(26)SEQ ID No.26的信息(a)序列特征長度505個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.26CGCGGAGGCGCTGTCGCCGGCGTGCCGATGTGGCCTCCGCAGTGGACGACCAGCCGATGAACGCCGAGTACGTGGAGCCGTGTGGGGGCCGGCGTGCGCGTCGGCCGGCCGCCGCCGGCGGGCTCGCGGCGAGGGCGGAGGTGGCGCGCGGGATCGAGGAGGTGATGCGCGGCGAGAGGAGCGGCGAGTACCGGAGGAACGCCGCAGCGTGGATGGAGAAGGCCAGGGCGGCGAGCCGGGAGGGCGGGAGCTCGGACCGGAACATCGCCGAGTTCGTGGCCATGTACGGATGATATGATTTTGTTGTTGCGCACGTGTGCGTGTGTATGTTCGCACGTGCGAGAACCATTAATGATAGGTATCACATGGAATCATATGGATGGATTAAATAAGGGATTTATTATTACTGGAGTAATAATAAGTAAATAAATATGGCATGATTTTGTATTTTGGTTGAATAGTTTGTGGGTATAATTCGATCCGTTTGTGGAAAAAAAAAAAAAAA(27)SEQ ID No.27的信息(a)序列特征長度222個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.27CCGGTTGGTTCATTCCTTTAGCCATAGGATACAGAATTAGTCAGAAGATGAAATTAGGGAGGATTTGTCTTTCTTTTTCTTTCCACCCCTTGTGTATCTGTGGTGCCCTCAGGTTTTTACAGGAGAGATTGTACAGGACNGTGCCAAATGGTCAGCATGTTTGTAGGGTTCTTATTTTTTTTGAAGGACTTTTTGTCCTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(28)SEQ ID No.28的信息(a)序列特征長度547個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.28CGTAGTGAGGATTAGATGCCTCCAAGAGTGGGCCAGAGTAGTATTCTGAGTCGTCCTGTCCAGCTCCACCGCCCATGCAGCTTGCGTTCAAAACTGGGTCACCCATAATGGAGAGAAGTTAAGGCTAAGTATTGGTGGAGAAGGAACCATCAGCTCACACCCAGTTCAAAGTACAACCTTCTCTCGTTTAGAACATAAATGTTTGTGGTCATTGTCAAACTGTTTCTTCTCTATGTCCGTAAGCATGTAGGAGGCATGGCTACTAGTTTGATTCAAACACTTGGAGAAATCATTAGTTGTTAGATCTTACTCGCTTATTCTTTTTCTCTATTTTGGGATGGCCATAAATTTACTTGATAAAATTAGTTCTAGGGGTAAGATTTTCACTTTTAGCCCTCCATAAGAAGAGAAGGATGAATATGTTTTTCTCCTATCTTTTTCGCATTCTAAAGACTTACTTGAGGAATAATGAGTGACTATCTTATTTGCCCACACAAGTAAGAAGAAGGGATTTTTTGCGTACTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(29)SEQ ID No.29的信息(a)序列特征長度499個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.29GCTCATCATCTGGACTTGGTCGCCCATCGATCCGATGCACTTGCAACCACGATGAGGGGGTGACATCCCTGGCATGCTGGGCCCGTCCAGGTTCGTGGCGTCGGGGTGCATCGACGGCATGGTGCGAATCTGGGACAGCCTCTCCGGGGAGTGCGTGAGGGCCTTCGCCGGCCACGGTGACGTCGTGCAGTCCCTCGCCGTCTCTGCTGATGGCAACTCCATCGTCTCCGTGTCCACGGATGGCTCTGCCCTCATCTTCGACATTTCCATGTTCAAGTGAAACCATAGTAGCAGTAGTTACCATACATGATGAAGCCACGCAAACTGTACAATGGTCTCCTCAGCCACTTTGGTTATAGGCCAGGGGATTGAGATTTTATACATGGAGCCCTGCGAGTTGTACAATTAAACACCCTCGTCTAGGGGATTACACTGTAAGTCGAATCATTTTTGTGTGAGCATTTGGCATGGATTAATAGCATAAAAAAAAAAAAAAAAA(30)SEQ ID No.30的信息(a)序列特征長度325個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.30GAAGTACTGTAGTTTACTTTAGTTTCCCTGGATCATGGTTCCCTTATTTACCGGCCACTGATGGGGCTTCTCGGTTTGTTCATGCTCTTATCGTCGTCGCCCTGGTTTACTAGCCATGTGCGTCTGCCCAGTTGGCCAAAATTGTGTGTTCAGCTAACACTTCTAGCTGTGCTTTTGGAGTAGACTTGTGCTTGTTTGTAGCATATGGCTTTTGGAGAAGGTATATAACTCACATGGCTGTATGGAAAAGAGGTACTCTCCTTATGGGTAAAATGAAAAAGGAAAGAAAGATGGAAGTTATTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(31)SEQ ID No.31的信息(a)序列特征長度565個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.31TAGGTATGTCGAGAAAGTATATTGAGATGGAGGAGAAAGGACTGGTTTGCGTGGCTTTCGACCTGAGAAACAATTAGAAGGCCAGACACAATCCAGCCTGCAAAACAGAGGATGAATACGATTACTTGCAGGATGGCAGAAGACAGGCTGAAGGCCAGACTACAGAGGGCACTGGACCGGGTGCGCTCTATGACACATACCCAGAAGCACAGAGAACAGTACCGTAGGCTTACAACTTGTGTTGCTGAAATGCAACAGTCCAGGATGATGCAGGACGAGATGCTAAGTGAGGCAGCTGGTGCTGACGGAAGTGATTTCATGAATGGACTGGAGGACTTGATATGCAGAGACGACCCCCAATGACTGCCATTTGGTGAAGTCGAAGTTGTTACATCAGTTAGGCCGATCATTGCCTTGTTCATTGCCATATTAGCCTTGTAAATTCTTCCGCTTGTAGTTCACTCACTGCTTAATATCTAGCTCATGCTGTTAGTATTATGTAACTCTGTGCACTGATCATAATAGAATATTTCTCTCCTGTATGTTACCAAAAAAAAAAAAAAAA(32)SEQ ID No.32的信息(a)序列特征長度274個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.32TATATATCCCAACTTCCCACAGAAAAAAATTTTGTATGGGCGTGAAGTCTTGATCGATATTCTTTGTAGTGTTAGCTAAATCAGCCGGAAGATTATAGATGTAGGTAGTGAGTTAGGCACTGAGTGCTTCTGTGCTTGGAGTTTTATCTGTAGAAAGAGCCGTTCCCTTTGTTCATCATTTGTGTAGTGATGTTTAGGTGATAAAGTCTTTCGCCGATGTTTTTTGAGATTTGTACCATTTCCCCCTTTCTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(33)SEQ ID No.33的信息(a)序列特征長度495個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.33TCCGGAAAGATGCTTGAGGATCTGGTTTCCATCATGTCATTGCTGAAGACCGCACGGACCAGTTCCTGCGTGTTCTTCAAAGGGAGCTTGCTGAAGTTGAGAAGAACAAAGAAGCCTTCTTGCAGACTTCACCCAGGAGGACTACGATGACATTGTGAACGGCTGGAACGCGAAGCTGAACCGGAGCTCTGCCGGTGAGCAGAGGTGGGGGCTGTTCATTGCAACCAAATGATTCAGAAGCAGAGAGGGTTCAGAATAAAACGGGTGCTGCTGTTGTTGGCTGTGTTAACTAGTACTCCTACTAGATCTGTTGTTGCAGATTTATTTGTGCGCCCCATTGGTAGTTTGTTTGTGTGTGATGTATTCCAGTTTTAGAGGACGGCCATGTTCCATGTGACGTGATGTACGTTAAACTCAGTCTGTTTAAAGTATGTATTATCGTGCGTATTTGGTATGGAACTGTGTTATTGTTTGCAGATAAAAAAAAAAAAAAAA(34)SEQ ID No.34的信息(a)序列特征長度524個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.34TGCGCAGGTAGACCCCAAACCAGGCTACGTTCGGCGAGGACGGAAAAGGGTGGTCCGAGGCACGAGAGGAAGACCAAAGTAGAAGAGCATCTACTGCACCCACAATTGTTTGTATACCACTAATATTAACGGCCCAAATGGGTGGTATGATAATGATACCTAGGTTAACTAGAGTTAGCATTGATCGGTGGATTTTATCGTGCACCCACTCCTTGTATCCATGTTGTATTATTGTAGGCGTCATACTGACTACGTTTCACGATTTGGATGTGATTACTAGGACTGGTAGATGCCTCCTGTTTTTCTTCTCAGTGTAAAACTTATGAGTAGTTTGTGCAGATGGAAGAACACAATGGTTTGTTTTGTAGTATTGTTGTACAGTAAATGGCTAGCCATCTAGGTGACTAGAGATGTACTACCTCAGTATCATGCAGCGCTGGACGCTGAGGATTCTCGACATGTAACCAGTATTTCGTACTACGGATATTCTATTCATTGTGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(35)SEQ ID No.35的信息(a)序列特征長度454個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.35TCAGAGCAGCAAGGCTGTCTGTTAGGAGAGGCACTTAAGGACTATCCTAATCAAGCAGCGCTCGAGAATACGATGGTGATGAACTAACTCAGGTGTCTTACTCATCATGTAATTATGGTCGTTCAGTATCACCTGCATCTATCATCGTAAGCCCCACAAGGGAGCGCACGAACATAGGCGATGCAACAGAGTGGGTGAAATTATCGGCTTATCTATCTATCTATCTATCTATCTACCACGTTGTTTTGGTTGTTTCCACTTCCATGAAATTAGAATCGAGTTGTTTAGTTGGCTCTCTATAAAGAGCAGTACTATGTTATTTGGAATTCAAGCAAGAAGATATAAGACCCTGTTAGTTTTCATATTATTCATGGTGGGATTGTTGAAATGGAGTATTTACTCCACGGATTGAAATATATATTCTCCCTGCATTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA(36)SEQ ID No.36的信息(a)序列特征長度454個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.36TCAGAGCAGCAAGGCTGTCTGTTAGGAGAGGCACTTAAGGACTATCCTAATCAAGCAGCGCTCGAGAATACGATGGTGATGAACTAACTCAGGTGTCTTACTCATCATGTAATTATGGTCGTTCAGTATCACCTGCATCTATCATCGTAAGCCCCACAAGGGAGCGCACGAACATAGGCGATGCAACAGAGTGGGTGAAATTATCGGCTTATCTATCTATCTATCTATCTATCTACCACGTTGTTTTGGTTGTTTCCACTTCCATGAAATTAGAATCGAGTTGTTTAGTTGGCTCTCTATAAAGAGCAGTACTATGTTATTTGGAATTCAAGCAAGAAGATATAAGACCCTGTTAGTTTTCATATTATTCATGGTGGGATTGTTGAAATGGAGTATTTACTCCACGGATTGAAATATATATTCTCCCTGCATTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA(37)SEQ ID No.37的信息(a)序列特征長度620個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.37CAATAGGTACACATCGCCTTCCGAGCGCCTTCGAGGAATCGTCTGATCATGTCCAAGTCAGGCACAGGAATGCCATGTTCAGCATGGGATTGTTCATGGCGCAGCCAGGAGAAGATCATTCGCGTGCGGGACGAGCTTTGCGGCGCTGGGGCTGGTGCTAAAGTTCGCGCTCGGCCCCGCCGCCATGGCCATCGGCTCCATCGCCGTCGGCCTCCGCGGCGACGTCCTCCGCGTCGCCATCATACAGGCAGCCCTACCTCAATCCATCACATCATTCATATTTGCGAAAGAATACGGGCTGCATGCTGATGTGCTCAGTACTGCGGTGATTTTTGGAATGCTTGTCTCCCTACCCTTGTTAGTCGGATTTTACATAGTTTTAGAGCTAATTAGGTAGACGCAGAGCCATGGTACATCAGGAAAACATAGTTTTTCCTTGAGAATTCCAAACATACATACTGACAACAATGTTGCAAAATATCTCCTGCCAACATTCCTCATTGCATAAAACTGTAATGGGAGTATTGAGTTCTATGGAATACTTTTAACACGTTATGTAACAAGAATGTATACTTATTCTGTTATTCAAAAGAATGTGTTACAGTAAAAAAAAAAAAAAA(38)SEQ ID No.38的信息(a)序列特征長度574個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.38ACCTTGAGAAAGTTTCTTCATTCGAGGTGAAGCGAGGTCGAGGGCCCTTGTTCTAGGGATGGATGAGCCTGGTCCAATACCTTAATGTTGCATCTCCGTAGTCAAGAGAACGAACCTAATGCTGATACTCAGGTGGAAGAAAAATGGGAACGAAGAGTACAAGGCCCGGAGAAACCAGTGTCTTTGAGATCAAGATCACCTGATGACTATTGGCGTAGGGAAGCACTAGATGGAGAACCTTCCAGCCCTGAACTCCACAAGAAAAAGAGAAGAAGAAGGAAAAGAGTTCAGAGGAAAAAGGACAGGAAAGAGAGAAGGAAGAAAAAAGACAAGAAGAAATCTAAGCATCGCCACCACCACCATCACAAAGTCGGCAAAGGGAGTGATTGTTCTGCTTGCTGAGCATAAAAAATGTACACCAGAAACATGTTAGCTTCTAATTGCTACTGTTACTTCTCACTTGAAACATGTTGTACCCAAAAACTTGATATCGTGTGGAATGGAGAACTGTTCTTCTCACACGGAGTGTTGATACAAGCCATATGTTAGATTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(39)SEQ ID No.39的信息(a)序列特征長度295個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.39CTACACAGTGGCATGATGCTTCATGTTTATTTTCTGAAAATGCCAGCACCTAAGATTTTGAAGCACACAGCTAACAAGTGGACATGCTAGGAGTGCCATAGAACCAAATGCAGTACACATGTATGCTGATTGCAGTGCTAGGAGTGCCATAGATTTTTTTACATGGGTGTTTTTTTTTTTGAATGATGGATGTTAATTATTGAGGGATATGAATGAGTTAGCTGATATATACAAGGCGCGATGAATGAATTGAGGCCATCCTGATGTTGGGTTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(40)SEQ ID No.40的信息(a)序列特征
長度631個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.40CCTGGAGGAGGACCTATTGTGCACAGCATCTTTCATCTCTGTATGATACCTCCTGGGACAGAACCTTGTCAGGCTGATTGACCCGTACGCAAGGGTGGAGATTGCACATATCGCGGAGATGATTGAGTTGCCAGTTGATCATGTTGAGAAGAAGCTGTCGCAGATGATCCTTGACAAGAAGTTTGCAGGAAATCTCGATCAAGGTGCTGGCTGCCTCATTATCTTTGAGGATCCCAAGACCGAGGCACATCTTCCCTGCTACACTTGAAACTATTTCGAATGTTGGGAAGGTCGTTGACAGTCTTTACATGAGGTCTGCCAAGATCATGGCTTAATGTCTTTACAGTCATTTGCGTTTACTTGTTATCTCTAATTTCATCTTGCTTCAGTTACTGTTGGTCTTCATAGACATTTAATCCTGCATATTGACATTTTTATTCTGCATGTTGATCTCTCCTAGTTAAAGAAAAGGTACCCTCTTGAATGCGAACAAATACATTTGGTGTTTCTTACTTCGTATGGTGCAACTGTGCTAGTACCATAAACATAACCTGATGCCTAGGTTATATTTGTTATGTCAACTTATTTTGTCTTTAATGTCAGGCTAGCTTATTTAAAAAAAAAAAAAAAA(41)SEQ ID No.41的信息(a)序列特征長度487個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.41TTAATACAAGACTTGAATATTGCCTGATGAAGATAGTTCTTCGACATCACATGCTATGAACCTTCGGAAAATTGGCGCCTCACCACACATGTTCAGACACTGACATAACTTGATGATGAAGAACTGGAGGTGGAGCTTTTTACACAAGTCTAATGCATACGCGGAATTATCTTTGATAACTCTTTGTCTGGGATGAATGATTGCTCTAATATGGAGGGAAACCGGGATTGGTTTCCACACCCTTGAAACCGTTGAGACTTGAGAGAAAGTTGTTCCCGAATACCCGTTCTGGAAAAGAGACCTGAAGTGCCGTTGCACACTGGTGGCATCCTTTACCCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAATATTTTTAGGCAGTCATCATTGTGCTGCCATTTGAGCTTACCTGATTTTTCTAGGAAGATGTAAAATAGGGACATCAGGCCTCCCTTTTACATCCTCCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(42)SEQ ID No.42的信息(a)序列特征長度271個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.42TTGTTTTTTTTGGATACCTGAAGTACTACCAGTGTTGCATTTTAAAAGCCTGAGGTAATCAGAATGTGGAGTTTGATCGATGGCCGCACTAATCAGAATATGGTTCATAATTTTCACCGGTTTGTGGACAGAGTGGAACCATATATAAGAGCGTAGAGGATGGTCGTCGTCCATACTCAAATTTGTTAGGATTTGCGTCATGTATGTTATATGAAAGAGCAAATAAACACATAGGTTAGGTATGTGTAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(43)SEQ ID No.43的信息(a)序列特征長度575個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.43CATAAGCTCAATAGATTTCATTTGTTCACGTTTATGGAGGACATCGACAAGGAGATCAGTGAGCTAAAGCTTTCGGGTAAATACACGTGGGTCGGGTTAGTGGCACTGAATTCCTGAACAGTTCATATGACACACTTCTTGGCGATCTTTGGAAAACATAAACCCTAGCATTGTTAGCTATGCTGTCTTGGCCTTTGGCGACCAATCTGGAAGGATCTTTCCACCCACTTTGTTTTCCTTTTGTAAATGCGTTGACAAGGATATGTGAATTCTTGATCCAACTAGACCTCATTGCAGCTAAAATCTGCCCAGGCAAGAGAGATGAGGGGAAACAAAGTCATGGTCAGTAGGTTGAGATAGATTTTTTGGCCTTTTGGTTCAAGAATCCTGTACTGTGCCGGCCAAGTTTTATTGGAATGTGGAAAGGGCTGATTCTGATTCTGATATGTCAAAATTGGAATGTGAAAATCAGAGACGCTTGTTGTCTCTGATTCTGATTTCAGTTCCATGGCAGGCTGCCTTAGCTGCGTAAATATATTTCACTGTTCATCTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(44)SEQ ID No.44的信息(a)序列特征長度526個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.44CGAGGCTGATGAGGTACAGGGAGAATGCGGAAGAATCCGGCGGTTCGAGAAGACGATCCGGTACGCGTCGCGCAAGGCCTACGCCGAGACGCGCCCCCGGATCAAGGGCCCTGTTGCCAAGCGCCCGACCACGACGCCGACGACGCCGACGCCGACGCCGACGACCCCGCCAGCCGTCCCATCCTCCTACATGCTCGACTTCGGCTACGGCGTCGTCCCGTCCTTCTGATCGCCGCCCGCCGCCGGCCACCGCCGCCGCAGCCAGTCGCTTGTAATCTTGTATCAAATCGATCGATCAGATGTGTAGGGGCGTAGTAATCACCATGTAGTACTCATTTTGAGCTAGCTCACGCTAGTTTTGTACACTACTACTGCTACTAATTACGTGCTTACTACTTAGTGGTAATTATTTTTTTGATCAGCAAGATCTACTATATTGTATTAGCTCCCCCCAACGAATAAATCACAACTATATGGTATTATTCATCAGCTAGGAATTGTTGATGGAAACAAAAAAAAAAAAAAA(45)SEQ ID No.45的信息(a)序列特征長度638個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.45TTTCCCGAAGCTTCCTACCCGACCAAGGAAGGGGCCTCTGTCCAATCGTTGGCACCCACCGAGTCTGGAGCCCGTTCCGGTGGCGGTTCGTGACACACTGTGGATGGAACTCGTTTTGGAGCCGTCACACGGGGGTGCCCATGCTGGCATGCCTTGTACGCGGAGCAGAGGATGAACAAGGTGTTCTTGGTGGAAGAGATGCGCTTGGCCGTGGGGGTGGAAGGCTATGACAAAGGAATCGTTACGGCGGAGGAGATTCAGGAGAAGGCGAGGTGGCTCATGGATTCTGACGGTGGAAGAGAGCTCCGGGAGCGGACTTTGGCGGCCATGCGAGAGGTGAAAGAGGCGCCAAGTGACAAAGGTGAGTCCAAATGACGTTGTTAGAACTCGTAAGCCAGTGGAAAAGTGACTGAAAGGAGACGGATAGGGAGATGAACAGTAATGTTAACGGGCTAGCCTTCTGCACCGTTTGGTCCAAATAAACATACCAGGTCATACTATAGTATATTTCCGCCATAGTAGTAAAAATCCTTGTAGAATATTTAAGTTGGAGTGAATTGCATGCTGGATCATTTATTTTTATCAATGTTGTAGCTTAGACTAGAGGTAACACAATATTTTCAAAAAAAAAAAAAAAA(46)SEQ ID No.46的信息(a)序列特征長度543個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.46GTCTATCAGAAGGGGGTGAACCATCTGGTGATTTCTTCCGCTCATTTTTTGATAGAGGACAAGCCACCTGTGGCCTTTCCTATGTGGAGTTCCTTGTGCATAGTGCACAGGCACAATCCAGAGCACAGATGACGTGACAATGCCATATGCATTGTCGCACCTGTTTTTGGTTAGTGGATGGATTACAACTAAGAAGAGATCCAGTTTCGGCACACAGGATACTGCGAAGAAGCATAGGGCAACTCCAGATCACTGGTTGATTGGGGTTAGATATATCACTGTTTCCTGGAGAATAGATTTTCGCACGGAATTGAGGCCTGCAATGTTTACAGCAATAGTTTTTTTTGGGGGAGGGGGTGGTATATCTTGTAAACAGATGAGTTGTTGGATGTGATGCCTCTTTTTTGTGTTTCTCACCGTGCATCCTTATTGAAATCTCTTGTGAAGGGAGAAGGGTGTATTACGTTCAAAGGAATATAAGTGGTTTAGGAATAAAACTATACCTAGTTAATAGTTTTGAGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(47)SEQ ID No.47的信息(a)序列特征長度257個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.47ACTAGTTCTAGATCGCGAGCGCGGACGCGTGGGCGGACGCGTGGGCGGACGCGTGGGTGCAGCGGCAAGGAGTGTGTCCCTCCAAATCTCATTTTTTTATTCCCGAATTTCGCTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATTCTCAGAGTTATAAAAACCCGTTACTTTTTTTTATATAATAGAATAGAACATTTCGGTCTTTGCTAAGAAAAGCTACAGCTAATTATTACCAAAAAAAAAAAAAAA(48)SEQ ID No.48的信息(a)序列特征長度590個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.48AGAACTTCCAGCTCATCTCAACCCACCAGCTGCTCGGACCCCCAACTCCATCACAGCCTGTTCCACCACCCCCACCACGAGCATGATAAGGTCATACTCAATTCGGGAAGGTTCCAAGGACATGTTCACCATGGATTACCGCTACCCGCTCTCAGCCTTCCAGGCATTTGCTATCTCCCTGAGTAGTTTCGACACCAAGCTGCCTGGCGAATAGAACTTCCAGGCAGGCCAGAAACATCATGGATGCTTCTTATTTGACGCCCTGAGGGCATGCTCCTGGATGGGAGCTGACCATCCCCACAGTTTAGCCTGGGACCCGTTCTGTTGTATGTTACTGATGATGTGTTAACTCAGAAACACCCACAGCCACCAAAGGCACAATTGTTATTTTAGCACTTTAGCTTATTTATTCTGATTTTGCTTTGTAATTGAATGTTATCTTTATTTCTTTTTGACCCATAGCTCTCTCTATAACAGGTATTCTGTATGTGCATCGGATAATTTTCGCAGAATTCATTTGACTGTTCTCCAGTGATTTATTAACTGAGAAAGCTAATAATTTGGTGATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(49)SEQ ID No.49的信息(a)序列特征長度397個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.49TCAAGTATGATAAGGCCGGTGAACTGTGTCACCCACTCGGTACCGGTGCTTACGCATCGATCTCATACCAGATTGCTGGCAAATGTTAAGAGACTCGAGGATCCTATACCATTCTGGATGTAATTTTATTGATGATCATGCAAACTAGTAAGTAGTATCAGGTGTTATTGTCCTACTCAGGTGTTATTATATATATATGTGAGCATCCAATTTTGGCATAACCTGTTTTATGATGATGGTCGCCTTGTCAATTTGGTCCACTCTTTGTCAGCCCTGTGTTTTGCTGTAAACTGCTTTTCCCTCTTGTAGCACAATGCTTAAAAAACTGGGGGAAATGAATCCCTATAACTTTACCAAGTGAGTTATGTCTGATGCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(50)SEQ ID No.50的信息(a)序列特征長度591個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.50TCGGTTCCGTGTTCGTCTGCACCTGCGACGATTCCGATCACCGGCACGGCATCAACCCGGCGAGGACCTCGCCCCCGTGCTGTACAACCAGCACGCAGCTTGGAAAGATCACTGGATCTTCTGGGTGGGCCGGTGATCGGGGCGTTCTTGCGCGGCGTACCACAAGCTGGTGCTGCCGGCGAGCCCCAAGGCGCTCAGCTCGTTCAGGAGCACCAGCGTGACGGCGTGAGGAAGACGACGATGTTCATTTGATACGAGAGATCGATCAGCTGCTTGATTAATTGTTCTTGATTTCTTGTTCAATTTACATCTACGACTATGGACGATCATGCATATGATATGATCGATGCATGCGTCTGTTGTCAGTTTTATTTGGGACTTTCAGTGTGAGAGTGTGAATGGTTGTAAAATAAGTGGAGTGTCTGTATGTATCTGTATGCATGCACGGCACGGTACGCGTGTTTATGGATGATGCTTTGTTACGTAGCAGGCTTAATTATGTCAATATGTGTGCGTATGTTGTCGTGGTAATTATTATACTGGGTATATATATATATTGTGCAGCTTAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
權(quán)利要求
1.分離出的水稻胚乳cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離出的水稻胚乳cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中的一條或數(shù)條的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離出的水稻胚乳cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于所說的cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補(bǔ)序列或同源序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離出的水稻胚乳cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于所說的cDNA序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的每條序列中的8～100個(gè)連續(xù)核苷酸為探針的序列或其互補(bǔ)序列。
5.一種由權(quán)利要求1或2或3或4所述序列標(biāo)簽所組成的生物芯片，其特征在于在載體上結(jié)合有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列、同源序列或其互補(bǔ)序列的核酸分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的載體為固相載體或液相載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于用于生物功能的研究和檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種表達(dá)序列標(biāo)簽的生物芯片，其特征在于所說的生物包括動物、植物以及它們的細(xì)胞、組織器官及其系統(tǒng)；所說的生物功能的研究包括藥物、疫苗、植物的抗逆性、植物育種和植物新品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、新型除草劑和新型農(nóng)藥的篩選、動植物生長和發(fā)育的機(jī)理和藥物的毒理學(xué)；所說的生物功能的檢測包括轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、生物物種的鑒定，包括動植物和微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類新的水稻葉片表達(dá)序列標(biāo)簽及其構(gòu)成的生物芯片。cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ IDNo.50所示的DNA序列。運(yùn)用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)對構(gòu)建的水稻胚乳cDNA文庫進(jìn)行脫氧核糖核酸序列測序,獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽通過剔除冗余序列、互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、分類,富積非冗余序列,獲得了50條新的表達(dá)序列標(biāo)簽,這些新的表達(dá)序列標(biāo)簽應(yīng)用微陣列技術(shù)制成表達(dá)序列標(biāo)簽組合生物芯片;該芯片能用于對農(nóng)作物的重要農(nóng)藝性狀的基因克隆、雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的安全性檢測、新型除草劑的篩選和新型農(nóng)藥的篩選、新藥物的發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)研究、疾病診斷、動植物育種和植物新品種的產(chǎn)生、植物抗逆性的研究和動植物品種的鑒定等。
文檔編號C07H21/04GK1364936SQ0113767
公開日2002年8月21日 申請日期2001年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者李德葆, 董海濤 申請人:浙江大學(xué)