漾濞大泡核桃類萌發(fā)素蛋白基因JsGLP1及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學以及基因工程相關技術研宄領域，特別是具有抗真菌活性 的漾濞大泡核桃類萌發(fā)素蛋白基因及應用。
【背景技術】
[0002] 植物在整個生長發(fā)育過程中會時刻受到外界環(huán)境信號的調(diào)控，遭遇各種逆境脅 迫，從而產(chǎn)生各種病害癥狀，影響植物的生長發(fā)育，在眾多的植物病害中，真菌病害是最重 要的一類，其發(fā)病率極高，且大規(guī)模發(fā)生時導致農(nóng)作物減產(chǎn)甚至死亡。傳統(tǒng)控制真菌病害的 方法主要是選育抗性新品種、采用合理的耕作制度和使用化學農(nóng)藥，這些方法雖然取得了 一定成效，但均不能從根本上解決真菌病害問題。近年來，隨著分子生物學和生物技術的快 速發(fā)展，利用基因工程方法培育抗真菌病害的新品種取得了一定成效，有望從根本上解決 真菌病害問題。
[0003] 類萌發(fā)素蛋白（Germin-like proteins，GLPs)是植物中普遍存在的一類可溶 性糖蛋白，與小麥aesiira?)萌發(fā)素（germin)序列高度相似，通過離子鍵結 合以糖蛋白的形式存在于細胞外基質(zhì)中，大多數(shù)GLPs為非常穩(wěn)定的低聚物（Bernier F, Berna A. Germins and germin-like proteins: Plant do-all proteins. But what do they do exactly Plant Physiology and Biochemistry, 2001， 39: 545-554; Lane BG. Oxalate, germins，and higher-plant pathogens. IUBMB life, 2002，539: 67-75.)〇 GLPs 最初在小麥中發(fā)現(xiàn)（Dunwell JM，Gibbings JG，Mahmood T，et al. Germin and germin-like proteins: evolution, structure, and function. Critical Reviews in Plant Sciences，2008，27: 342-375·)。在結構上，GLPs 和 germin 均含有一個"cupin" 蛋白結構域，三維結構具有β-折疊桶狀結構，共同屬于一個功能多樣化的超家族，SP cupin超家族。目前根據(jù)功能的差異將植物的GLPs分為3個亞類：第1亞類為真萌發(fā)素 (true gennin)，主要包括小麥、大麥的萌發(fā)素及一些其他谷類植物的GLPs，它們具有SOD 和0X0的雙重活性；第2亞類的GLPs主要是來自于除小麥和大麥之外的其他禾谷類、裸子 植物和茄科植物等，這一亞類主要與植物耐氧化脅迫有直接關系，并與錳超氧化物歧化酶 (MnSOD)極其相似；第3亞類的GLPs主要包括與生長素代謝相關的一些調(diào)節(jié)蛋白，它們與 植物的生理節(jié)律和花期誘導功能有關（Khuri S，Bakker FT，Dunwell JM. Phylogeny， function, and evolution of the cupins， a structurally conserved, functionally diverse superfamily of proteins. Molecular Biology and Evolution, 2001， 318: 593-605.)。
[0004] GLPs是一種多功能蛋白，主要以酶、受體和結構蛋白的形式參與多種生理生 化過程。其中，酶主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，S0D)、草酸鹽 氧化酶（oxalate oxidase，0X0)、ADP葡萄糖焦磷酸酶/磷酸二醋酶（ADP glucose pyrophosphatase/phosphodiesterase，AGPPase)，受體如雄激素結合蛋白（androgen binding protein，ABP19/20)激素受體、Rhicadhesins 受體等^ 0X0 和 SOD 能催化產(chǎn)生 H2O2，而H2O2迅速積累導致植物細胞壁結構的增強，觸發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，乙烯的合成，并 激活程序性細胞死亡（programmed cell death，PO))，同時H2O2能夠誘導防御基因表達， 從而提高植物的抗病性（Dunwell JM, Gibbings JG, Mahmood T, et al. Germin and germin-like proteins: evolution, structure, and function. Critical Reviews in Plant Sciences, 2008, 27: 342-375·)。另外，GLPs還可作為一種信號分子，直接或間 接誘導防御反應。從煙草iaAacw?)中分離純化得到的水楊酸結合蛋白，經(jīng)鑒 定確認該蛋白與H 2O2酶十分相似，并具有H2O2酶活性，水楊酸在植物體內(nèi)通過與H 2O2酶結 合來抑制H2O2酶的活性，使植物內(nèi)GLPs催化草酸氧化產(chǎn)生的H 2O2迅速增加，由于H2O2能 夠誘導與抗性有關的基因表達，從而使植物產(chǎn)生抗性（Chen Z，Silva H，Klessiq DF. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science, 1993，262: 1883-1886·)。因此 GLPs 在植物的防御反應中具 有重要作用。
[0005] GLPs的表達在不同的組織和不同發(fā)育階段差異較大。Godfrey等人在葡萄 hfli/era)中發(fā)現(xiàn)7個GLPs基因，這些GLPs的ORF所編碼蛋白長度從207-205個氨基酸殘 基不等，并且包含不同的GLP特征結構域[Godfrey D, Able AJ, Dry IB. Induction of a grapevine germin-like protein (VvGLP^) gene is closely linked to the site of Erysiphe necator infection: a possible role in defense. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2007, 20: 1112-1125·]。和 在葡萄葉和漿果（包括果皮和 果肉）中有表達；和分別只在根和成熟之前的漿果中表達；KWZ/y、KWZ/V、 在所有的組織中都表達。白粉病菌（iZrpiMeflecaior)侵染迅速誘導衆(zhòng)果和葉片 中和的表達，相對地，白粉病菌侵染的漿果中和發(fā)病葉中的 表達量都顯著減少，的表達卻基本不受白粉病菌侵染的影響。勺表達受凡 flecaior侵染的誘導，并具有SOD活性。峨江百合（Zi/ia? regah Wilson) 基因在 正常生長發(fā)育的根中有一定量的表達，而在莖和葉中幾乎檢測不到表達量，水楊酸、茉莉酸 以及H2O2處理均不同程度抑制的轉錄水平，但乙烯處理能明顯上調(diào)的表達 (劉亞龍，李紅麗，劉迪秋等.岷江百合類萌發(fā)素蛋白基因的克隆及表達譜分析。 植物生理學報，2013，10: 1063-1070·)。
[0006] GLPs 是病程相關蛋白（pathogenesis-related protein, PR)家族的一員，病原 體或其他外界因子的刺激能夠誘導其表達，使其在植物防衛(wèi)反應中發(fā)揮重要作用。 是從抗根結線蟲甜菜中分離的1個GLP基因，的異源超量表達顯著提高了轉 基因擬南芥對輪枝抱菌FeriiciBioiofe1)和立枯絲核菌（TPAizocioflia 的抗性（Knecht K, Seyffarth M, Desel C, et al. Expression of BvGLP-I encoding a germin-like protein from sugar beet in Arabidopsis thaliana leads to resistance against phyto-pathogenic fungi. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2010, 23:446 - 457.)。擬南芥中從/?71?的敲減突變體（5411^-433-!106)對甲基紫精（1116也 71 viologen，MV)脅迫敏感，而超表達旅]擬南芥對MV脅迫表現(xiàn)較強的抗性，與野生型 相比，轉基因擬南芥子葉變綠比率提高，且主根生長受抑制程度減輕，表明基因參 與調(diào)控擬南芥應對氧化脅迫，是MV氧化脅迫響應途徑的正調(diào)控因子（唐源江，閔伶俐， 高桂蘭等.擬南芥基因在植物抗氧化脅迫響應中的作用.植物學報，2011，46: 147-154.)。油菜（Aral5lSica 類萌發(fā)素基因同時具有OXO和SOD活性，還可以 在氧爆發(fā)時水解活性氧生成H2O2，降低植株對病原菌的敏感性，且在受核盤菌（5Wer 〇ii/7ia sc/eroiior應）侵染6 h后表達量迅速增加 （Rietz S, Bernsdorff FE Μ, Cai D. Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidates for the i