專利名稱：水稻葉片傾角控制基因sal1的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種利用水稻葉片傾角控 制基因SALl轉(zhuǎn)化植物調(diào)節(jié)葉片傾角的方法，用以獲得農(nóng)作物的理想株型，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，也是禾本科作物研究的模式植物。水稻的株型與產(chǎn)量和 抗病性等密切相關(guān)，其構(gòu)成因素包括有效分蘗數(shù)目、分蘗角度、穗部形態(tài)、株高以及葉夾角 的大小等，合理的株型可以使一定的水稻群體最大限度地提高單產(chǎn)。水稻的分蘗角度決定 了植株緊湊程度，進而影響了單位面積內(nèi)的播種數(shù)目，水稻的葉夾角是水稻品種的重要評 價指標(biāo)，與水稻的產(chǎn)量和抗病性密切相關(guān)，合適的葉夾角可以減少葉片之間的相互遮蔽，使 植株具有良好的光捕獲能力，進而提高植株光合作用效率，提高水稻產(chǎn)量。目前控制水稻株型或葉片形狀的基因有水稻基因RL10，SLl 1, RLAL1，這些基因已 經(jīng)公開專利申請 CN100582231A，CN1923850A, CN101386859A 中。目前的研究表明油菜素內(nèi)酯(BR)和生長素均能影響葉片傾角的大小，其中參與 BR合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多個基因參與控制水稻葉片傾角的大小，這些基因中，P450家族 基因成員調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成、生長發(fā)育、對生物逆境和非生物逆境的反應(yīng)等眾多生理過 程。本發(fā)明利用水稻葉片傾角減小突變體，通過圖位克隆結(jié)合T-DNA標(biāo)簽法在水稻中克隆 了 SALl基因，該基因編碼一個P450蛋白，該P450蛋白調(diào)節(jié)水稻葉片傾角功能為首次發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從水稻半矮化葉片傾角減小突變體中克隆 新基因SALl，該基因編碼的蛋白，將該基因轉(zhuǎn)化進入植物，尤其是水稻以調(diào)控葉片的傾角的 方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻葉形控制基因SAL1，該基因具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，上述SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列中可以添加、取代，插入或缺失一個 或多個核苷酸形成SALl衍生物，該SALl衍生物與水稻葉形控制基因SALl具有相同的功 能。本發(fā)明還提供了一種水稻葉形控制基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由SEQ IDN0. 1所 示的核苷酸序列編碼，其具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，上述SEQ ID NO. 2的氨基酸序列中可以添加、取代、插入或缺失一個或多 個氨基酸或其他物種的同源序列，從而生成氨基酸序列的衍生物。本發(fā)明還提供了一種培育植物減小葉傾角的方法，該方法包括用SEQ IDN0. 1所示 的核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物細胞，再將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株，其中植物細胞優(yōu)選為水稻、 大麥、小麥、玉米、高粱或甘蔗細胞，尤其優(yōu)選為水稻細胞。
本發(fā)明還提供了一種培育水稻減小葉傾角的方法，該方法包括用含有SEQID NO. 1 所示的核苷酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化的細胞培育成植株，其中質(zhì)粒含有上述 基因序列SEQ ID NO. 1。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種培育水稻減小葉傾角的方法，該方法包括用含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化的細胞培育成植株，表達載 體為含有基因序列SEQ ID NO. 1的載體pCAMBIA-35S-SALl-N0S。本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞含有基因序列SEQ ID NO. 1或其衍生 物。上述宿主細胞可以是大腸桿菌細胞、農(nóng)桿菌細胞或植物細胞。其中植物細胞優(yōu)選 為水稻、大麥、小麥、玉米、高粱或甘蔗細胞。本發(fā)明的水稻葉形控制基因SALl (SEQ ID NO. 1)是從水稻葉片傾角減小突變體 sail中分離出來，并通過遺傳分析確定控制突變體的突變性狀。水稻葉片傾角減小突變體sail是通過大量篩選水稻T-DNA插入突變體庫獲得，通 過對TO代，Tl代和突變體與野生型水稻正反雜交實驗，證明該突變體受一對顯性核基因控 制，野生株與突變株的外形如圖1、圖2所示?？刂扑救~傾角的SALl基因的克隆方法如下1、SALl基因的分子定位為了分離SALl基因，本發(fā)明首先建立了一個大的多態(tài)性高的F2定位群體，由sail 純合體(粳稻品種中花11)為母本，選用秈稻品種9311為父本，雜交獲得的F2群體中的隱 性個體組成，再通過圖位克隆的方法，并利用SSR分子標(biāo)記對SALl位點進行初步定位，將 其初步定位在第6染色體的長臂上，并介于RM454和RM162兩SSR標(biāo)記之間。然后通過對 RM454和RM162兩標(biāo)記之間的BAC序列進行分析，發(fā)展了新的STS標(biāo)記，將SALl精確定位于 PAC克隆AP003623和AP003612之間重疊的區(qū)段上STS標(biāo)記P5和P15之間IlOKb的范圍之 內(nèi)(圖3)，隨后發(fā)現(xiàn)突變體與T-DNA插入共分離，隨即用T-DNA標(biāo)簽法分離SALl基因。2、T-DNA插入與突變表型的共分離檢測通過PCR擴增對Tl代和T2代植株的HPT基因進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入與 突變表型共分離，表明sail突變由T-DNA插入引起，可由T-DNA標(biāo)簽法分離SALl基因。3、T-DNA標(biāo)簽法分離SALl基因利用TAIL-PCR技術(shù)分離T-DNA插入位點處的側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入到第6染 色體長臂上的PAC克隆AP003612的36kb處，與SALl基因定位的結(jié)果是一致的。根據(jù)BAC 克隆P0457B11序列的基因注釋信息(NCBI)，T-DNA沒有插入到基因內(nèi)部，而是插入基因之 間，與T-DNA插入位點處下游相隔4. Ikb處有一 P450基因，推測為SALl的侯選基因(圖 4)。4、定量RT-PCR技術(shù)鑒定sail突變體通過定量RT-PCR檢測sail突變體和中花11野生型葉片中上述P450基因的表達 情況，發(fā)現(xiàn)P450基因在sail突變體的表達量比野生型顯著增加(圖5)，表明T-DNA插入 造成了該P450基因的超量表達，引起了 sail突變體的功能獲得型突變。該P450基因即為 SALl基因。5、SALl基因的鑒定和功能分析
通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對SALl基因進行過量表達，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了比野生型葉 片傾角減小的轉(zhuǎn)基因植株，即能夠重現(xiàn)突變體表型(圖7，圖8)，證明了本發(fā)明正確克隆了 SALl基因。本發(fā)明利用水稻葉片傾角減小突變體，通過圖位克隆結(jié)合T-DNA標(biāo)簽法克隆到了 SALl基因，該基因編碼一個P450蛋白。通過對SALl基因的功能研究，進一步闡明了植物特 別是禾本科植物葉片傾角建成的遺傳機制及其作用機理，為構(gòu)建理想株型及創(chuàng)建水稻新種 質(zhì)打下基礎(chǔ)。通過植物基因工程技術(shù)將SALl基因在水稻中特定組織部位或特定時期異位表 達，從而通過調(diào)控SALl基因的時空表達模式及表達量達到調(diào)控水稻葉片傾角而改良水稻 株型的目的。此外，可以利用植物基因工程技術(shù)超量表達SALl基因的同源基因在其他禾本 科作物(如大麥、小麥、玉米、高粱、甘蔗等)中特定組織部位或特定時期異位表達，改良作 物的株型，提高植株對光合作用的利用效率，從而達到增產(chǎn)的目的。


圖1是水稻中花11野生型和葉片傾角突變體sail的表型；箭頭所示為葉傾角；左 面的植株是野生型，右面的植株是sail突變體；圖2是水稻中花11野生型和葉片傾角突變體sail的倒二葉的葉角表型；箭頭所 示為葉傾角；左面的植株是野生型，右面的植株是sail突變體；圖3是SALl基因在水稻第6染色體上的精細定位；圖4是SALl基因的T-DNA插入示意圖；圖5是定量RT-PCR檢測sal 1突變體中P450基因表達；圖 6 是 pCAMBI1300-35S-SALl-N0S 載體圖譜；圖7是SALl超表達實驗TO轉(zhuǎn)基因水稻的表型；左面的植株為空載體對照植株，右 面的植株是35S-SAL1轉(zhuǎn)基因超表達植株；箭頭所示為葉傾角；圖8是SALl超表達實驗TO轉(zhuǎn)基因水稻倒二葉的葉角表型；左面的植株為為空載 體對照植株，右面的植株是35S-SAL1轉(zhuǎn)基因超表達植株；箭頭所示為葉傾角；圖9是轉(zhuǎn)基因植株的定量RT-PCR檢測；WT為中花11野生型，CK為空載體對照植 株，35S-SALl(2-2)和35S-SAL1 (2-10)為兩個獨立的轉(zhuǎn)化植株；
具體實施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實施例進一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。實施例1 SALl基因的克隆1、水稻材料/JcfS (Oryza sativa ssp. zonghua 11)突變體 sail (small angle leaf!),原女臺里予 生型材料為粳稻品種中花11 (來自中國農(nóng)科院)(圖1，圖2)。2、分析和定位群體純合sail突變體和原始野生型品種9311進行雜交，F(xiàn)l代自交，得到F2群體，并 從中選出350個隱性個體(葉片傾角與野生型相似)作為定位群體。在抽穗初期每株取1 克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
3、SALl基因的初步定位和精細定位采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基 因組DNA，該DNA抽提的方法為CTAB法(參照Liu等，A genome-wide analysisof wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecularmap, Theor Appl Genet，1997 :809_814)。取大約 IOOmg 水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍， 在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到2ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于 120 μ 1超純水中。每一個PCR反應(yīng)用1. 2 μ 1的DNA樣品。在SALl基因的初步定位階段，對由93個F2個體組成的小群體進行SSR分析，根據(jù) 公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物， 根據(jù)已知的反應(yīng)條件進行PCR擴增，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和浪化乙錠(EB)染色，檢測 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將SALl初步定位在第6號染色體長臂RM454和RM162標(biāo)記之間。在精細定位SALl基因時，通過對PAC克隆ΑΡ003623和ΑΡ003612的序列分析，發(fā) 展了 12個STS標(biāo)記，對F2群體中選出的350個野生型中花11表型一致的個體進行STS分 析。將SALl精確定位于STS標(biāo)記Ρ5和Ρ15之間，位于PAC克隆ΑΡ003623和ΑΡ003612重疊 區(qū)IlOkb的范圍之內(nèi)(圖3)。隨后發(fā)現(xiàn)，sail突變體與T-DNA插入共分離，隨即利用T-DNA 標(biāo)簽法分離SALl基因。STS標(biāo)記引物序列P5F 5' -GTCGGAATTGTAAATAGCAGAGG-3，(SEQ ID N0. 3)R 5' -GCAGTGGATAAATCTGAAGCG-3，(SEQ ID N0. 4)P15F 5' -TGTGAGTGTGGCGACGAAAG-3，(SEQ ID N0. 5)R 5' -AAGCTAAGCTACTTCCTACTACG-3，(SEQ ID N0. 6)4、T-DNA插入與突變表型的共分離檢測為了檢測sail突變體T-DNA插入與其突變表型是否共分離，本發(fā)明從20株Tl代 單株中抽提總DNA用作PCR反應(yīng)模板，DNA抽提采用CTAB微量提取法。檢測了 Tl代20個 單株的HPT基因，其中表現(xiàn)為野生型的植株均沒有HPT擴增條帶，而表現(xiàn)為sail突變體的 植株均有HPT目的條帶擴出，Tl代單株收獲種子，隨即選取6個單株播種T2代，后代中2個 純合突變株系所有單株均可擴增出HPT目的條帶，而發(fā)生分離的4個單株中，凡是表現(xiàn)sal 1 突變體的單株均可擴增出HPT目的條帶，而表現(xiàn)野生型的單株均無目的條帶擴出。這表明 sail突變體是由于T-DNA單位點插入造成的顯性突變體，可用T-DNA標(biāo)簽法分離SALl基 因。檢測HPT基因所用的引物序列HptII-F :5，-CAGAAGAAGATGTTGGCGAC-3，(SEQ ID N0. 7)HptII-R :5，-ATGTCCTGCGGGTAAATAGC-3，(SEQ ID N0. 8)
5、T-DNA標(biāo)簽法分離T-DNA插入位點的側(cè)翼序列利用 TAIL-PCR 技術(shù)(參照 Liu 等 Efficient isolation and mapping ofArabidopsis thaliana T-DNA insert junction by thermal asymmetric interlaced PCR，Plant J, 1995，8 =557-463所示方法和步驟)分離了 sail突變體T-DNA插入位點的
6側(cè)翼序列。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，該側(cè)翼序列定位于水稻第6染色體上，對應(yīng)NCBI克隆登陸 號為AP003612，與SALl基因的精細定位結(jié)果一致，根據(jù)RiceAutotation Systemftittp:// RiceGAAS. dna. affrc. ro. id)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在插入位點下游4. 1Kb處有一編碼P450蛋白的 基因。本發(fā)明將該基因命名為SAL1。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，它包括5 個外顯子和4個內(nèi)含子，T-DNA插入在起始密碼子前4083bp處(見圖4)。Tail-PCR技術(shù)分離得到的sail突變體T-DNA插入位點的側(cè)翼序列如下TCGTTTGGCCCAGAAGTACACAACCGCGCGCGATGATTGACCGGCCGGCTGCATATCGCTGCCGACGTC AACGTCGCGAGCTAAGCTAATAAGCTAGTAGCCACCACACGCACTATCACAAAATATGTGATGCATTGTGTACATTT GCAGACTAAAATTGCCTACGTCTCTAAAATAACACCAGAAACTCGTGGAATATATAACAACATAGTCCATATATCTG TGATAACTAGCTTTCTTGGTTGAGGCCGAATTAATCCTCTCTTGACCAATCATCACGGACGCGTACATATATAGAAG AATCATACTTGTACACGATATATATTGGACACAGACGCATGCCTGTAACCACCGTTCTGATGGACGCTGCTAGCTAA CCTATACCCGTGTCTGTGTGATGAACGTTAACCCCGTATGTAA(SEQ ID NO. 15)實施例2 =SALl基因的定量RT-PCR分析定量RT-PCR的實驗具體步驟參照Huang等的實驗方法進行(Huang等， Down-regulation of SLIENT INFORMATION REGULAT0R2_related histonedeacetylase gene, OsSRTl, induces DNA fragmentation and cell death in rice, PlantPhysiol, 2007 :1508-1519)。具體步驟如下(I)RNA材料準(zhǔn)備挑選約100株sail純合型單株的種 子和100株野生型中花11的種子播種于小缽中。播種15天后每份樣品取1克左右的新鮮 葉片提取RNA，每份RNA樣品各取3個生物學(xué)重復(fù)。(2)RNA樣品抽提及反轉(zhuǎn)錄方法如下 用Axygen公司的Trizol試劑分別提取總RNA。每份材料各取IygS RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。 逆轉(zhuǎn)錄過程如下在0. 2μ 1的離心管中加入1μ g總RNA, 1 μ 1 oligo(dT)18(Promega公 司)，加無RNA酶水至8 μ 1，在70°C水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，稍離心后加入4 μ 1 的 5 X First strand Buffer (Promega 公司)、5 μ 1 的 2. 5mM dNTPs (Takara 公司)、1 μ 1 RNase inhibitor (Takara 公司)及 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (Promega 公司)， 輕輕混勻，42°C反應(yīng)1小時，70°C5分鐘，終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于定量PCR擴增。(3)定 量RT-PCR方法如下在LightCycler Systems (Roche,瑞士)上進行，采用2_Δ Δετ相對定 量的方法進行表達量的比較。20yL反應(yīng)體系包含1μ反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下 950C /IOsec, (95°C /5sec，55°C /10sec，745°C /lOsec)，45cycles。所有定量 RT-PCR 引物 如下定量RT-PCR弓丨物序列為UBQ F :ACCAGGACAAGATGATCTGC, (SEQ ID NO. 9)R TGATCTTCTTCTTGGGCCTC ； (SEQ ID N0. 10)SALl F :ATCTCAGCCGTCCAATTAGC, (SEQ ID NO. 11)R:TGTCACTATGCACACAACGG(SEQ ID NO. 12)定量RT-PCR結(jié)果如圖5，sail突變體中P450基因的表達量比野生型中花11的表 達量顯著增加，表明T-DNA插入增強了 sail突變體中這一 P450基因的表達，為一功能獲得 型突變，這一現(xiàn)象與sail突變體為顯性的表型是吻合的，該P450基因即為SALl基因。
實施例3 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?、超量表達載體的構(gòu)建由于sail突變體是一功能獲得型突變，所以本發(fā)明構(gòu)建SALl基因的超量表達載 體驗證SALl基因的功能。設(shè)計一對分別帶BamHI和PstI酶切位點的引物擴增SALl基因 含ORF的cDNA序列，電泳檢測后切膠回收，回收產(chǎn)物用BamHI和PstI酶切，連接至同樣酶切 的pCAMBIA-35S-N0S載體上，構(gòu)建后的載體結(jié)構(gòu)圖為pCAMBIA_35S-SALl_N0S (圖6)，把構(gòu)建 好的載體電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (購自 CAMBIA 公司，http // www, cambia. org/daisy/cambia/home. html)菌株中，將含有載體 pCAMBIA_35S-SALl_N0S 的菌株命名為35S-SAL1。擴增ORF序列的引物序列為SALl-BamHI :CGACCGGATCCCTCTGCGTTTGTG (SEQ ID NO. 13)SALl-PstI :GCCACCTGCAGAGCCTTTTGTTAG(SEQ ID NO. 14)2、遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof T-DNA. Plant J, 1994,6 271-282)利用中花11成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng) 過誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長旺盛愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體，將PCAMBIA-35S-N0S空載體 和35S-SAL1載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養(yǎng)3天后，在含有 40mg/L Hygromycin的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有50mg/L預(yù)分化培養(yǎng)基上培 養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗 性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進行鑒定和連續(xù)的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)空載體的轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型 相比不發(fā)生變化，而轉(zhuǎn)35S-SAL1菌株的陽性轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出與sail突變體同樣的表型， 即葉傾角明顯減小，附圖7，圖8。3、轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定為鑒定轉(zhuǎn)35S-SAL1植株的表型突變確實由SALl基因的超量表達引起，選取1株 空載體轉(zhuǎn)化植株和2株獨立的轉(zhuǎn)35S-SAL1基因陽性株進行定量RT-PCR檢測，RNA抽提及 定量RT-PCR的步驟和方法參加事實例2，轉(zhuǎn)空載體植株的SALl基因表達與野生型相比沒 有發(fā)生變化，而2株轉(zhuǎn)35S-SAL1的轉(zhuǎn)基因陽性株SALl基因的表達量比野生型均顯著增加 (圖9)，結(jié)果表明，SALl基因的超量表達確實引起sail突變表型，使葉片傾角減小。本發(fā)明所描述的基因、蛋白及其應(yīng)用的方法已經(jīng)通過具體的實施例進行了描述。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā)明的內(nèi)容適當(dāng)改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它 目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種培育水稻減小葉傾角的方法，該方法包括用含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化水稻細胞，再將轉(zhuǎn)化的細胞培育成植株，表達載體為含有基因序列SEQ ID NO.1的載體pCAMBIA 35S SAL1 NOS。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻葉片傾角控制基因SAL1的應(yīng)用，水稻葉片傾角控制基因SAL1具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的P450蛋白質(zhì)具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及含有基因SAL1的質(zhì)粒、植物表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還公開了培育植物葉傾角減小的方法用含有基因SAL1的植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞，再將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株。該方法能改變植物葉片的傾角，改良植物株型，最終能提高產(chǎn)量。
文檔編號A01H5/00GK101921777SQ20101026763
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者汪得凱, 陶躍之 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院