技術領域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取分離技術領域，尤其涉及重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的制備方法。
背景技術：
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重樓甾體皂苷是重樓屬植物的主要活性成分，具有抗癌、止血、抗胃粘膜損傷等藥理活性[王躍虎,牛紅梅,張兆云,胡向陽,李恒.重樓屬植物的藥用價值及其化學物質(zhì)基礎.中國中藥雜志,2015,40(5),833-839]。但是，由于重樓甾體皂苷單體化合物的分離、純化非常困難，是限制其新藥研發(fā)潛力的瓶頸之一。到目前為止，還沒有單一的重樓甾體皂苷為主要成分的新藥上市。因此，重樓甾體皂苷單體的規(guī)?；苽?，對基于單一皂苷的新藥研制具有重要意義。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在了上述問題，提供從滇重樓[parispolyphyllavar.yunnanensis(franch.)hand.-mazz]果皮中制備重樓皂苷ii和vii的方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案：
從滇重樓[parispolyphyllavar.yunnanensis(franch.)hand.-mazz]果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法，該方法是將滇重樓果皮粉碎后，用溶劑提取得到粗提物，再從粗提物中富集重樓皂苷ii和vii，得到富含重樓皂苷ii和vii的部位，并經(jīng)過進一步分離、純化后，得到重樓皂苷ii和重樓皂苷vii。
如所述的從滇重樓果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法，其中所述的溶劑提取，是指用水或1％～99％乙醇提取，超聲提取，提取時間30～120分鐘，提取溫度25～60℃，提取液經(jīng)過濃縮后得粗提物。
如所述的從滇重樓果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法，其中所述的富集重樓皂苷ii和vii，是指將滇重樓果皮粗提物，加水制成混懸液，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，萃取液濃縮后，分別得到乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分，正丁醇萃取部分經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，經(jīng)甲醇洗脫后得到富含重樓皂苷ii和vii的部位。
如所述的從滇重樓果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法，其中所述的富集重樓皂苷ii和vii，是指取滇重樓果皮粗提物，經(jīng)d101大孔樹脂層析，分別用水洗脫、80％乙醇洗脫、95％乙醇洗脫和丙酮洗脫，其中，80％乙醇洗脫部分濃縮后，加水制成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位，正丁醇萃取部位為富含重樓皂苷ii和vii的部位。
如所述的從滇重樓果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法，所述的分離、純化重樓皂苷ii和重樓皂苷vii，是指取富含重樓皂苷ii和vii的部位，經(jīng)制備型hplc，ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為:0～15min,甲醇-水，87:13；15～30min,甲醇-水,90:10制備得到化合物重樓皂苷vii和重樓皂苷ii；或者取富含重樓皂苷ii和vii的部位，經(jīng)制備型hplc，ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水,90:10制備得到化合物重樓皂苷vii和重樓皂苷ii；或者取富含重樓皂苷ii和vii的部位，經(jīng)制備型hplc，ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水,87:13制備得到化合物重樓皂苷vii和重樓皂苷ii。
本發(fā)明同時提供了更具體的從滇重樓果皮中大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的方法：
1.重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的提?。?/p>
干燥的滇重樓果皮(0.50克)粉碎后，采用水、90％乙醇或無水乙醇提取，超聲提取，提取時間為30～120分鐘，提取溫度為25℃～60℃。不同提取條件下，檢測到重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的含量如表1所示。提取液過濾后，在60℃以下蒸干，即得粗提物(0.14～0.27克)。
表1.不同提取方法中重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的含量比較
注：重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的含量是按提取原料干物質(zhì)計算的
2.重樓皂苷ii和vii的富集方法：
方法一：取按提取方法5～8所得的滇重樓果皮粗提物6.85g，加100ml水制成混懸液，依次用100ml的乙酸乙酯、正丁醇分別萃取5次。萃取液濃縮后，分別得到乙酸乙酯萃取部分(0.41g)和正丁醇萃取部分(3.22g)。正丁醇萃取部分經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱色譜，經(jīng)甲醇洗脫后得到富含重樓皂苷ii和vii的部位(1.50g)。
方法二：取按提取方法5～8所得的滇重樓果皮粗提物500g，經(jīng)d101大孔樹脂層析，分別用水洗脫、80％乙醇洗脫、95％乙醇洗脫和丙酮洗脫。其中，80％乙醇洗脫部分濃縮后，得到洗脫物150g。取80％乙醇洗脫部物10g,加100ml水制成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到石油醚萃取部位(21.6mg)、乙酸乙酯萃取部位(1.08g)和正丁醇萃取部位(6.80g)，正丁醇萃取部位即為富含重樓皂苷ii和vii的部位。
2.重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的分離、純化方法：
方法一：取富含重樓皂苷ii和vii的部位1.50g，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為:0～15min,甲醇-水,87:13；15～30min,甲醇-水，90:10)制備得到化合物重樓皂苷vii(156.0mg,tr＝12.943min)和重樓皂苷ii(145.8mg,tr＝24.010min)。
方法二：取富含重樓皂苷ii和vii的部位164.6mg，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水，90:10)制備得到化合物重樓皂苷vii(24.4mg,tr＝11.520min)和重樓皂苷ii(27.1mg,tr＝21.320min)。
方法三：取富含重樓皂苷ii和vii的部位150.3mg，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水,87:13)制備得到化合物重樓皂苷vii(26.5mg，tr＝14.040min)和重樓皂苷ii(30.0mg,tr＝30.257min)。
通過上述方法，可以大量制備重樓皂苷ii和重樓皂苷vii。
具體實施方式：
下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
實施例1：
本發(fā)明的重樓皂苷ii和vii的提取方法：
干燥的滇重樓果皮(0.50克)粉碎后，采用水、90％乙醇或無水乙醇提取，超聲提取，提取時間為30～120分鐘，提取溫度為25℃～60℃。不同提取條件下，重樓皂苷ii和重樓皂苷vii檢測到的含量如表1所示。提取液過濾后，在60℃以下蒸干，即得滇重樓果皮粗提物(0.14～0.27克)。
表1.不同提取方法中重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的含量比較
注：重樓皂苷ii和重樓皂苷vii的含量是按提取原料干物質(zhì)計算的
實施例2：
本發(fā)明的重樓皂苷ii和vii的富集方法：
方法一：取滇重樓果皮粗提物6.85g，加100ml水制成混懸液，依次用100ml的乙酸乙酯、正丁醇分別萃取5次。萃取液濃縮后，分別得到乙酸乙酯萃取部分(0.41g)和正丁醇萃取部分(3.22g)。正丁醇萃取部分經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱色譜，經(jīng)甲醇洗脫后得到富含重樓皂苷ii和vii的部位(1.50g)。
方法二：取滇重樓果皮粗提物500g，經(jīng)d101大孔樹脂層析，分別用水洗脫、80％乙醇洗脫、95％乙醇洗脫和丙酮洗脫。其中，80％乙醇洗脫部分濃縮后，得到洗脫物150g。取80％乙醇洗脫部物10g,加100ml水制成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到石油醚萃取部位(21.6mg)、乙酸乙酯萃取部位(1.08g)和正丁醇萃取部位(6.80g)，正丁醇萃取部位即為富含重樓皂苷ii和vii的部位。
實施例3：
本發(fā)明的重樓皂苷ii和vii的分離、純化方法：
方法一：取實施例2方法一中富含重樓皂苷ii和vii的部位1.50g，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為:0～15min,甲醇-水，87:13；15～30min,甲醇-水，90:10)制備得到化合物重樓皂苷vii(156.0mg,tr＝12.943min)和重樓皂苷ii(145.8mg,tr＝24.010min)。
方法二：取實施例2方法二中富含重樓皂苷ii和vii的部位164.6mg，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水，90:10)制備得到化合物重樓皂苷vii(24.4mg,tr＝11.520min)和重樓皂苷ii(27.1mg,tr＝21.320min)。
方法三：取實施例2方法二中富含重樓皂苷ii和vii的部位150.3mg，經(jīng)制備型hplc(ymc-pack,ods-a色譜柱,直徑250×20mm,5μm；流速v＝8.0ml/min；洗脫劑為甲醇-水,87:13)制備得到化合物重樓皂苷vii(26.5mg,tr＝14.040min)和重樓皂苷ii(30.0mg，tr＝30.257min)。
實施例4
本發(fā)明的重樓皂苷ii和vii的結(jié)構鑒定：
重樓皂苷ii，白色固體，分子式c51h82o20，cas登記號50773-42-7。1hnmr(c5d5n，500mhz)δ:6.42(1h,brs),6.30(1h,d,j＝1.2hz),5.85(1h,s),5.30(1h,d,j＝5.1hz),1.77(3h,d,j＝6.2hz),1.59(3h,d,j＝6.1hz),1.58(3h,d,j＝6.1hz),1.13(3h,d,j＝7.0hz),1.04(3h,s),0.82(3h,s),0.68(3h,d,j＝5.6hz)。13cnmr(c5d5n，126mhz)δ:140.8,121.8,109.3,103.4,102.2×2,100.4,81.1,80.5,78.1,78.0,77.8,77.6,77.1,74.2,74.1,73.4,73.0,72.9,72.7,72.6,70.5,69.6,68.4,66.9,62.9,61.2,56.6,50.3,42.0,40.5,39.9,39.0,37.5,37.2,32.3,32.2,31.8,31.7,30.6,30.2,29.3,21.1,19.4,18.9,18.7,18.5,17.4,16.4,15.1。esimsm/z1013[m-h]-。其nmr數(shù)據(jù)跟文獻[王羽,高文遠,袁理春,劉新橋,王書軍,陳翠.滇重樓的化學成分研究.中草藥,2007,38(1):17-20]中的數(shù)據(jù)基本一致。
重樓皂苷vii，白色固體，分子式c51h82o21，cas登記號55916-45-5。1hnmr(c5d5n，500mhz)δ：6.40(1h,s),6.30(1h,s),5.84(1h,s),5.30(1h,brd,j＝3.7hz),1.76(3h,d,j＝6.2hz),1.60(3h,d,j＝6.0hz),1.58(3h,d,j＝6.0hz),1.22(3h,d,j＝7.1hz),1.07(3h,s),0.95(3h,s),0.67(3h,d,j＝5.2hz)。13cnmr(c5d5n，126mhz)δ：140.8,121.9,109.9,103.4,102.2×2,100.3,90.2,90.0,80.4,78.0×2,77.8,77.6,77.0,74.2,74.1,73.4,73.0,72.9×2,72.7,72.6,70.5,69.6,68.4,66.7,61.2,53.1,45.2,44.8,39.0,37.6,37.2,32.5,32.4,32.1,31.9,30.5,30.2,28.8,21.0,19.5,18.9,18.7,18.5,17.4,17.2,9.8。esimsm/z1013[m-h]-。其nmr數(shù)據(jù)跟文獻[景松松,王穎,李雪嬌,李霞,黃璐琦,肖培根,高文遠.黑籽重樓化學成分及其抗腫瘤活性研究.中草藥,2017,48(6),1093-1098]中的數(shù)據(jù)基本一致。