本發(fā)明公開了一種羅漢果皂苷v含量的測(cè)定方法，具體地說，是一種ase-hplc測(cè)定羅漢果中羅漢果皂苷v含量的方法，屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

羅漢果是我國(guó)廣西特產(chǎn)中藥，《嶺南采藥錄》記載：“果實(shí)味甘，理痰火咳嗽，和精肉湯服之?！泵耖g用于清肺止咳、涼血潤(rùn)腸。目前已從羅漢果果實(shí)中分離并鑒定了11種葫蘆烷三萜苷類化合物，該類化合物是羅漢果果實(shí)中主要活性物質(zhì)，有報(bào)道采用香草醛一高氯酸試劑與三萜皂苷顯色后進(jìn)行比色分析測(cè)定了羅漢果中三萜皂苷的含量。

其中羅漢果皂苷v為羅漢果果實(shí)中含量和甜度均較高的成分，且目前中國(guó)藥典只有對(duì)羅漢果浸出物的測(cè)定項(xiàng)，因此對(duì)羅漢果皂苷v含量的測(cè)定有利于完善羅漢果的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分析效率高，檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)好的ase-hplc測(cè)定羅漢果中羅漢果皂苷v含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc測(cè)定羅漢果中羅漢果皂苷v含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ase萃取方法萃取粉碎過的羅漢果并制備甲醇萃取液；

步驟2：采用hplc法檢測(cè)萃取液中的羅漢果皂苷v含量。

進(jìn)一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟s1：將羅漢果粉粹，過四號(hào)篩，取過篩后的粉末0.5g與1g硅藻土混合均勻；

步驟s2：在放有纖維濾膜的10mlase萃取池中加2g硅膠，再加入上述混合均勻的樣品，加硅藻土至與池口平行；

步驟s3：用甲醇萃取，收集并采用甲醇定容至25ml，過濾，得到甲醇萃取液。

進(jìn)一步的，步驟s3所述的萃取參數(shù)為：萃取溫度為100℃，靜態(tài)萃取時(shí)間為5min，萃取次數(shù)為1次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為60s，壓力位1500psi。

進(jìn)一步的，步驟2所述的hplc法進(jìn)行分析時(shí)參數(shù)設(shè)置如下：

流動(dòng)相：體積比為23:77的乙腈-水；流速：0.3ml/min；柱溫：40℃；色譜柱：thermosyncronisc18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。

進(jìn)一步的，所述的色譜柱的規(guī)格為3μm，3mm*100mm。

進(jìn)一步的，所述的萃取所使用的儀器為：美國(guó)dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀。

進(jìn)一步的，所述的hplc所使用的儀器為thermou3000uhplc液相色譜儀。

進(jìn)一步的，所述的色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

進(jìn)一步的，使用下述公式進(jìn)行計(jì)算：

式中cr—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升；ax—供試品的峰面積；ar—對(duì)照品峰面積。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

《中國(guó)藥典》2015年版中使用大孔吸附樹脂柱ab-8作為凈化劑，考慮到羅漢果中糖類雜質(zhì)較多，我們使用了psa、中性氧化鋁、硅膠作為凈化劑，發(fā)現(xiàn)在萃取罐底層加入2g硅膠能有效的除去糖類雜質(zhì)而不影響羅漢果皂苷的含量，故采用硅膠作為凈化劑；

萃取溫度，我們采用80、100、120℃作為萃取溫度，結(jié)果表明100和120效果最好且?guī)缀跸嗟?，故采?00℃作為萃取溫度；

提取時(shí)間我們采用3、5、8min，發(fā)現(xiàn)5min提取效果良好，時(shí)間較長(zhǎng)對(duì)結(jié)果影響不大，而提取次數(shù)影響結(jié)果不明顯；

本發(fā)明所提供的ase-hplc測(cè)定羅漢果中羅漢果皂苷v含量的方法分析效率高，檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)好。

附圖說明

圖1為羅漢果皂苷v的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖；

圖2為羅漢果皂苷v的濃度(μg/ml)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；

圖3為羅漢果皂苷v對(duì)照品的色譜圖；

圖4為根據(jù)藥典方法萃取所得的羅漢果皂苷v的色譜圖；

圖5為根據(jù)ase方法萃取所得的羅漢果皂苷v的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1.儀器設(shè)備及試劑

電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國(guó)dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀；

試劑：

甲醇(色譜純)；甲醇(分析純)；大孔吸附樹脂柱ab-8；乙醇(分析純)；硅藻土(粒徑約2mm)；硅膠。

羅漢果皂苷v的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

2.方法

2.1對(duì)照品溶液的制備：

取羅漢果皂苷v對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

2.2供試品溶液的制備：

步驟s1：將樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過三號(hào)篩，取0.5g與1g硅藻土混合均勻，得樣品1；

步驟s2：將濾膜放入10ml萃取池中，依次加入2g硅膠和步驟s1所得的樣品1，加入硅藻土至其與池口水平；

步驟s3：用甲醇對(duì)步驟s2所得的樣品進(jìn)行萃取，所述的萃取溫度為100℃，靜態(tài)萃取時(shí)間為5min，萃取次數(shù)為1次，沖洗體積為100％，即得。

2.3測(cè)定：

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，圖3為羅漢果皂苷v對(duì)照品的色譜圖，圖4為根據(jù)藥典方法萃取所得的羅漢果皂苷v的色譜圖，圖5為根據(jù)ase方法萃取所得的羅漢果皂苷v的色譜圖。

按外標(biāo)法：

計(jì)算，即得，式中cr—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升；ax—供試品的峰面積；ar—對(duì)照品峰面積；

2.4高效液相色譜法進(jìn)行分析時(shí)參數(shù)設(shè)置如下：

流動(dòng)相：體積比為23:77的乙腈-水，

流速：0.3ml/min，

柱溫：40℃，

色譜柱：thermosyncronisc18柱，3μm，3mm*100mm，

檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。

3.測(cè)定及結(jié)果

3.1線性關(guān)系

取羅漢果皂苷v對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加流動(dòng)相制成每1ml含羅漢果皂苷v880.4μg的溶液，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、0.8μl、1.0μl進(jìn)入lc測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定，結(jié)果詳見表1：

表1

以濃度(μg/ml)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程：y＝0.83977x-22.351，r²＝0.99967。羅漢果皂苷v在88～880μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，詳見圖2。

3.2重現(xiàn)性試驗(yàn)

取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：1510180)0.5g，共6份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中羅漢果皂苷v的含量見表2，rsd為1.5％，試驗(yàn)表明ase提取方法重復(fù)性良好：

表2

3.3精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取羅漢果皂苷v對(duì)照品溶液(0.8804mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為1.5％，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，1，3，6，12h依法測(cè)定。

結(jié)果羅漢果皂苷v峰面積的rsd為1.6％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

樣品(3批，批號(hào)分別為1508166，1510180，150723)不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較見表3：

表3

4.結(jié)果討論：

4.1ase提取溶劑的選擇：

試驗(yàn)中，曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》2015年版使用甲醇提取羅漢果皂苷v相對(duì)含量較高，故對(duì)使用甲醇、乙腈和乙醇進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇提取羅漢果皂苷v與中國(guó)藥典方法含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

4.2ase提取條件的優(yōu)化：

《中國(guó)藥典》2015年版中使用大孔吸附樹脂柱ab-8作為凈化劑，考慮到羅漢果中糖類雜質(zhì)較多，我們使用了psa、中性氧化鋁、硅膠作為凈化劑，發(fā)現(xiàn)在萃取罐底層加入2g硅膠能有效的除去糖類雜質(zhì)而不影響羅漢果皂苷的含量，故采用硅膠作為凈化劑。

萃取溫度，我們采用80、100、120℃作為萃取溫度，結(jié)果表明100和120效果最好且?guī)缀跸嗟?，故采?00℃作為萃取溫度；提取時(shí)間我們采用3、5、8min，發(fā)5min提取效果良好，時(shí)間較長(zhǎng)對(duì)結(jié)果影響不大，而提取次數(shù)影響結(jié)果不明顯。

最終確定條件為提取溶液為甲醇、萃取溫度100℃、萃取時(shí)間5min，循環(huán)次數(shù)1次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。