本發(fā)明屬于食品檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種對茶葉中g(shù)aba含量檢測一種方法。
背景技術(shù)：
：γ-氨基丁酸(簡稱gaba)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有極其重要的生理功能，它能促進腦的活化性，健腦益智，抗癲癇，促進睡眠，美容潤膚，延緩腦衰老機能，能補充人體抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有良好的降血壓功效。促進腎機能改善和保護作用。抑制脂肪肝及肥胖癥，活化肝功能。每日補充微量的γ-氨基丁酸有利于心腦血壓的緩解，又能促進人體內(nèi)氨基酸代謝的平衡，調(diào)節(jié)免疫功能。γ-氨基丁酸(gaba)是一種天然活性成分，廣泛分布于動植物體內(nèi)。茶葉具有g(shù)aba合成的生物合成基礎(chǔ)，是gaba的天然來源，同時，茶葉也是一種天然的健康的植物飲料，其具有生津止渴、清心明目、利尿清熱、清除疲勞等功效，長期飲用能夠預防心腦血管疾病、抗癌、減肥等。因此建立通過提取獲得γ-氨基丁酸的方法，使用lc-ms-ms分析方法對茶葉中γ-氨基丁酸的含量進行定量，對茶葉價值的開發(fā)具有很好的應用效果?，F(xiàn)有的茶葉中g(shù)aba的檢測方法有：放射性免疫法[ria],紙上電泳法，酶聯(lián)熒光法[elisa]，紙層析法，氨基酸分析儀法，薄層掃描法，高效液相色譜法，氣相色譜法。其中的高效液相色譜法因其靈敏度高、精密度好，準確性高而被廣泛應用。由于gaba是一種有機酸，極性強，因而一般要經(jīng)過衍生，有柱前衍生和柱后衍生，多用柱前衍生，該方法較繁瑣費時。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種高效、快速、準確測定茶葉中g(shù)aba含量的檢測方法，為茶葉的價值利用提供了保障。本發(fā)明的技術(shù)方案：一種檢測茶葉中g(shù)aba含量的方法，該方法采用液質(zhì)聯(lián)用，對gaba進行定量檢測。一種檢測茶葉中g(shù)aba含量的方法，依次包括以下步驟：樣品處理，uplc-ms/ms分析，外標法定量。所述樣品處理方法為：茶葉的提取：稱取一定量的茶葉，以1:10的比例加入水浸泡，并于超聲儀中超聲1-4h后取上清，經(jīng)濾膜過濾后進樣即可。更優(yōu)選的，茶葉的提?。悍Q取2-4g的茶葉，以1:10的比例加入20-40ml水浸泡，并于超聲儀中超聲2h后取上清，經(jīng)濾膜過濾后進樣即可。標線的樣品處理：精密稱取1.84mg的gaba標準品，加水溶解配制成2mg/ml的母液，接著用水逐級稀釋為500、200、100、50、20ng/ml的系列溶液后進樣分析即可。所述uplc-ms/ms分析：將處理后的樣品使用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，在以下條件下進行分析：液相方法液相色譜柱：acquityuplcbehhilic,2.1*100mm,1.7μm柱溫：35℃流動相：a：水(含0.1％甲酸，v/v)，b：乙腈；流速：0.3ml/min；柱溫：35℃；進樣量：10μl；梯度洗脫，洗脫條件見表1。表1液相梯度time/min01.5355.017a％101090901010質(zhì)譜方法：待測成分的質(zhì)譜參數(shù)如下：表2mrm模式檢測質(zhì)譜參數(shù)targetcompoundmodechanreactioncone(volts)collision(volts)gabaesi+103.88>86.671513所述外標法定量，以待測物濃度為橫坐標，待測物的峰面積為縱坐標，求得的直線方程，即為工作曲線:y＝217.375x-693.954，r＝0.999,標準曲線見圖1。使用標準曲線計算出茶葉樣品提取液中的gaba濃度。一種檢測茶葉中g(shù)aba含量的方法，線性范圍均為20～500ng/ml，定量下限為20ng/ml，檢出限為1.5ng/ml，在20～500ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢查方法對gaba的回收率為94.4％，滿足茶葉中g(shù)aba濃度檢測分析的要求。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：uplc-ms/ms檢測方法檢測茶葉中g(shù)aba的含量，簡單快捷，靈敏度高，抗干擾能力強，為衡量茶葉的價值提供了可靠依據(jù)。附圖說明圖1gaba標準曲線。圖2空白溶劑色譜圖。圖3定量限20ng/mlgaba標準溶液色譜圖。圖4濃度為500ng/mlgaba標準溶液色譜圖。圖5實施例3中檢測樣品1的色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步闡述，但不限制本發(fā)明。實施例1檢測茶葉中g(shù)aba含量的方法1.1樣品處理茶葉的提?。悍Q取適量的茶葉，以1:10的比例加入水浸泡，并于超聲儀中超聲1-4h后取上，經(jīng)濾膜過濾后于4℃保存待用。標線的處理：精密稱取1.84mg的gaba標準品，加水溶解配制成2mg/ml的母液，接著用水逐級稀釋為500、200、100、50、20ng/ml的系列溶液后于4℃保存待用。1.2uplc-ms/ms分析1.2.1液相方法液相色譜柱：acquityuplcbehhilic,2.1*100mm,1.7μm流動相：a：水(含0.1％甲酸，v/v)，b：乙腈流速：0.35ml/min；柱溫：35℃；進樣量：10μl梯度洗脫，洗脫條件見下表time/min01.023.53.515a％1010909010101.2.2質(zhì)譜方法：待測成分的質(zhì)譜參數(shù)如下：mrm模式檢測質(zhì)譜參數(shù)targetcompoundmodechanreactioncone(volts)collision(volts)r-aminobutyricacidesi+103.88>86.671513本實施例中所用儀器：watersuplc-quattropremierxe三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(含binarysolventmanager，samplemanager，quattropremierxems，masslynxv4.1色譜工作站)；渦旋混合器，型號：mx-s，美國scilogex公司生產(chǎn)；超聲清洗機，寧波新芝生物科技公司生產(chǎn)，型號：hba-m-090601-99。本實施例中所用試劑與標品：甲酸:色譜純cnw批號:l401k140；乙腈:色譜純fisher批號:071757；水:milliq；gaba：色譜純chromadex批號：00001674-5qo，純度：99.0％，室溫保存。實施例2方法學驗證實驗2.1選擇性考察選擇性是指在樣品中存在干擾成分的情況下，分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力，該實驗方法的選擇性效果較好，結(jié)果如圖2空白溶劑色譜圖，圖320ng/mlgaba標準溶液色譜圖，圖5樣品1色譜圖所示，表明基質(zhì)對目標化合物gaba的檢測無任何干擾，該方法選擇性好。2.2檢出限考察對gaba檢測限的確定是根據(jù)信噪比法來確定的。把已知濃度的貯備液稀釋至低濃度的試樣，測出的信號與空白處的信號(基線噪音)進行比較，算出可能被可靠的檢測出的最低濃度或百分比。要求：檢出限信噪比不低于3。檢出限試驗：取gaba適量，精密稱定，分別用水稀釋制成每1ml中含gaba20ng的溶液，精密量取該溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以基線噪音的3倍計算出最低檢出限約為1ng/ml，將標準溶液分別稀釋至0.5、1、1.5、2ng/ml后注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算信噪比，濃度為1.5ng/ml即符合信噪比大于等于3的要求。結(jié)論：即gaba的檢出限為1.5ng/ml。2.3定量限考察對gaba定量限的確定是根據(jù)信噪比法來確定的。把已知濃度的貯備液稀釋至低濃度的試樣，測出的信號與空白處的信號(基線噪音)進行比較，要求：定量限信噪比不低于10，測定6次峰保留時間的相對標準差應不大于2.0％，峰面積的相對標準差應不大于5.0％。定量限試驗：取gaba適量，精密稱定，分別用水稀釋制成每1ml中含gaba20ng的溶液，精密量取該溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，平行測定6次。結(jié)果如表3。表3定量限檢測結(jié)果序號123456meanrsd保留時間(min)2.372.362.372.362.362.372.370.232峰面積47034789466748054687476547361.22結(jié)論：重復測定6次，gaba保留時間rsd為0.232％，峰面積的rsd為1.22％。符合驗證方案要求(峰保留時間rsd不得大于2.0％；峰面積rsd不得大于5.0％)2.4系統(tǒng)精密度試驗取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6針，6次測定結(jié)果要具有良好的重復性；對照品溶液6次測定結(jié)果的峰面積的rsd不得過5.0％，保留時間的rsd不得過2.0％，來證實系統(tǒng)具有良好的精密度。按上述樣品處理方法處理茶葉樣品是兩年，精密量取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復進樣6次。分別計算各峰面積和保留時間的rsd，結(jié)果見表3。表4精密度檢測結(jié)果序號123456meanrsd保留時間(min)2.332.372.362.362.362.332.350.732峰面積215712040120793209002134321682211152.36結(jié)論：系統(tǒng)精密度：重復測定6次，gaba保留時間rsd為0.732％，峰面積的rsd為2.36％。說明系統(tǒng)精密度良好，符合驗證方案要求。2.5線性試驗用稀釋液水配制成濃度為20、50、100、200、500ng/ml的gaba系列標準溶液進行研究。線性關(guān)系以測得的響應信號(峰面積)為縱坐標(y)，以各被分析物濃度為橫坐標(x)，進行線性回歸分析。要求回歸方程的相關(guān)系數(shù)r的值不得小于0.990。將gaba標準品1.84mg，加水溶解為2mg/ml的儲備液，接著用水逐級稀釋為500、200、100、50、20ng/ml的系列標準溶液，結(jié)果見表5。表5標準曲線結(jié)論：線性：gaba在20～500ng/ml的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.990。2.6回收率試驗回收率是通過在已知供試品中加入指標的100％標準溶液，以測得值減去供試品值再除以加入量所測得結(jié)果即為回收率值，以百分率％表示，要求回收率在80.0％～115.0％之間，rsd不高于5％，以證實方法具有良好的準確度。取茶葉樣品2.89g，以1：10比例加入28.9ml純水溶解提取，再精密稱取gaba標準品2.38ug，混勻后于超聲儀中超聲2h，取上清，過濾膜，等待進樣即可，結(jié)果見表6。表6回收率結(jié)果結(jié)論：茶葉中g(shù)aba的回收率93.3％～97.5％之間，平均回收率為94.3％，rsd為1.82，符合方法學驗證要求，說明本方法準確度高。2.6重復性試驗重復性試驗是通過配制6個100％加樣溶液，100％加樣溶液每個溶液進樣1針，100％加樣溶液6次測得的測得量的rsd不得過5.0％，來證實方法具有良好的重復性。精密量取回收試驗100％加樣溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，照上述方法重復測定6次。結(jié)果如表7。表7重復性檢測結(jié)果結(jié)論：gaba100％樣品溶液保留時間rsd為0.566％，峰面積rsd為1.51％，符合方法學驗證要求，重復性良好。2.7溶液穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，處理后室溫放置，并分別于0、0.5、2、4、6、8、12、24小時后進樣，記錄峰面積，考察化學物峰面積的變化情況，計算峰面積的rsd。要求：化合物的峰面積rsd應不大于5.0％。若符合驗證方案要求，則說明對照品溶液在該時間段內(nèi)放置是穩(wěn)定的，為以后檢測時測試溶液放置時間的期限提供依據(jù)。稱取茶葉樣品適量，精密稱定，按樣品處理方法進行處理，處理后分別于0、0.5、2、4、6、8、12、24小時依次量取溶液10μl進樣，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，實驗結(jié)果見表8。表8穩(wěn)定性檢測結(jié)果結(jié)論：茶葉中g(shù)aba在24h內(nèi)保留時間rsd為0.15％，峰面積rsd為3.64％，符合方法學驗證要求，表明樣品溶液在該段時間內(nèi)放置穩(wěn)定，為以后檢測時測試溶液放置時間的期限提供依據(jù)。實施例3實際樣品的測定于市面上分別購買不同類型的茶葉，并將它們命名為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6，本次實驗分別針對這些茶葉樣品進行定量檢測：取樣品1，3.01g，以1：10比例加30.1ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲2h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；取樣品2，3.52g，以1：10比例加35.2ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲2.5h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；取樣品3，2.04g，以1：10比例加20.4ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲1h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；取樣品4，2.25g，以1：10比例加22.5ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲1.5h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；取樣品5，3.33g，以1：10比例加33.3ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲3.5h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；取樣品6，2.97g，以1：10比例加29.7ml水溶解，混勻于超聲儀中超聲4h，吸取上清液，經(jīng)濾膜過濾后，在上述色譜條件下，進樣分析；結(jié)果如下表9。表9樣品檢測結(jié)果以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。當前第1頁12