本發(fā)明涉及一種藥材化學對照品的質(zhì)量控制方法領(lǐng)域，具體涉及一種蒽貝素的提取和質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

蒽貝素是一種二萜糖苷類化學成分，是植物活性成分之一，也是許多植物和藥品標準質(zhì)量控制的指標性成分。目前尚未相應的國家藥品標準物質(zhì)，國內(nèi)外對蒽貝素對照品的系統(tǒng)研究未見報道，參照中藥化學對照品（供含量測定用）的技術(shù)要求，對蒽貝素化學對照品進行研究，建立蒽貝素化學對照品的批量提取工藝、純度與含量以及雜質(zhì)檢查的分析測定方法，從而建立蒽貝素化學對照品的技術(shù)標準，為其作為中藥化學對照品以及藥材和制劑的質(zhì)量標準研究提供科學基礎(chǔ)和保證。

高純度的蒽貝素對照品，是控制植物酸藤子及含酸藤子的質(zhì)量的技術(shù)關(guān)鍵，眾多企業(yè)、科研和檢驗部門都需要高純度的蒽貝素對照品，其市場需求很大，由于蒽貝素在藥材中的含量低，提取分離技術(shù)要求很高、難度很大。本發(fā)明進行蒽貝素中藥化學標準品制備及其質(zhì)量控制技術(shù)研究，解決高純度蒽貝素化學對照品的問題，對中藥現(xiàn)代化的作用是顯而易見的，具有重大的實際意義和學術(shù)價值。

蒽貝素是從酸藤子植物分離得到的活性物質(zhì)，已有文獻報道蒽貝素的提取方法，如：1.【題名】應用水溶助長劑從酸藤果中提取摁貝素：建立一種用水溶助長劑從酸藤果中提取摁貝素的方法。酸藤果經(jīng)干燥，粉碎，加入異丙苯磺酸鈉(nacs)水溶液，攪拌，濾過。濾液加酸水稀釋到最小助溶濃度(mhc)以下，靜置60min使摁貝素沉淀，懸液離心分離富含摁貝素提取物。結(jié)果最佳提取條件如下，提取溫度:25~30℃，藥材粉粒度:100目，水溶助長劑濃度:2.0mol/l，攪拌提取時間:60min。該方法提取率>90%，蒽貝素純度>85%。

上述方法論述了蒽貝素的提取分離，分離純度較高，但純度均未達到中藥化學對照品的要求，即純度大于98%，分離過程繁瑣，且沒有蒽貝素純度與質(zhì)量控制方法，無法滿足高純度蒽貝素化學對照品的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為了克服現(xiàn)有的蒽貝素提取純度低、收率低或生產(chǎn)成本高的不足，以及無系統(tǒng)蒽貝素提取純化與質(zhì)量控制方法，提供一種高純度蒽貝素的制備及其質(zhì)量控制方法，該方法制備得到的蒽貝素純度高、質(zhì)量好，可以作為化學對照品或標準品，質(zhì)量控制方法有效、穩(wěn)定、均一。

本發(fā)明藥材來源：

酸藤子：紫金?？扑崽僮訉僦参锼崽僮觘mbelialaeta(l.)mez的葉子。

蒽貝素：從酸藤子中提取、分離、精制、純化而制得，英文名：embelin。

分子式：c17h26o4；

結(jié)構(gòu)式：

本發(fā)明蒽貝素的質(zhì)量控制方法通過以下方案來實現(xiàn)的：

蒽貝素的質(zhì)量控制方法可以采用高效液相色譜法測定，其色譜條件如下：

色譜柱為十八烷基鍵合硅膠填充劑；

分別以乙腈-水體積比為10-90:90-10，甲醇-水體積比為20-80:90-10為流動相；

檢測波長280-310nm；

流速為0.5～5毫升/分鐘。

優(yōu)選地，采用高效液相色譜法測定時，色譜條件如下：

分別以乙腈-水體積比為10-90:90-10，甲醇-水體積比為20:80-90:10為流動相；

流速為0.8～1.2毫升/分鐘。

蒽貝素的質(zhì)量控制方法還包括薄層色譜檢測方法，可以在蒽貝素粗結(jié)晶制備的時候進行快速預檢測，提高蒽貝素粗結(jié)晶的質(zhì)量，也可以在精制獲得結(jié)晶后，進行質(zhì)量監(jiān)控，該方法用蒽貝素對照品參比的方法，其色譜條件為，以硅膠g為層析板，層析板用3%草酸浸泡過，以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1為展開劑，石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2為展開劑，石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1為展開劑；然后濃硫酸乙醇顯色，置于白光下檢視，在薄層色譜中三個展開系統(tǒng)下均為黃色的單一的熒光斑點，則代表純度符合要求，否則不符合要求。

優(yōu)選地，蒽貝素的質(zhì)量控制方法中薄層色譜檢測方法為：

取蒽貝素樣品用甲醇制1mg/ml的溶液，在同一硅膠g層析板上，層析板用3%草酸浸泡過，按不同的點樣量梯度點樣，點樣量分別為20μg、40μg、60μg、80μg、100μg；分別以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1為展開劑，石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2為展開劑，石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1為展開劑；置展開缸分別展開，展距為15cm，然后濃硫酸乙醇顯色，置于白光下檢視，在5個不同濃度的梯度點樣及三個展開系統(tǒng)薄層色譜中，均為黃色的單一的熒光斑點。

本發(fā)明所述的蒽貝素的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述的蒽貝素樣品由以下方法制備而成：

1）提取：取酸藤子成熟干果，加乙醚提取，濃縮，過濾，經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯溶液體系進行梯度洗脫，收集含有蒽貝素的洗脫液，合并，濃縮，即得蒽貝素粗結(jié)晶；

2）精制：用制備型高效液相色譜法分離純化蒽貝素粗結(jié)晶，用c-18色譜柱，配合甲醇-水體系進行梯度洗脫，用甲醇-水體系將蒽貝素粗結(jié)晶溶解后，注入制備型高效液相色譜儀，收集純度在90%以上的蒽貝素溶液，減壓濃縮，即得。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，梯度洗脫時分組收集不同濃度的洗脫液，不同洗脫液采用薄層色譜法檢測，用蒽貝素對照品參比的方法，其色譜條件為，以硅膠g為層析板，層析板用3%草酸浸泡過，以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1為展開劑，或者石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2為展開劑，或者石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1為展開劑展距為15cm；然后濃硫酸乙醇顯色，置于白光下檢視，選擇在薄層色譜中，黃色單一熒光斑點亮度高的洗脫液，合并，濃縮，即得蒽貝素粗結(jié)晶。

優(yōu)選地，所述的步驟2)精制中，分別收集純度在90%-98%之間和純度大于98%以上的洗脫液，減壓濃縮，得到純度在90%-98%之間以及大于98%以上的蒽貝素。

優(yōu)選地，所述的步驟2)精制中，收集純度在90%以上的蒽貝素溶液后，采用高效液相色譜法再次測定其純度，其色譜條件為：

色譜柱為十八烷基鍵合硅膠填充劑；

分別以乙腈-水體積比為10-90:90-10，甲醇-水體積比為20-80:90-10為流動相；

檢測波長280-310nm；

流速為0.5～5毫升/分鐘。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步是：

1、本發(fā)明提取的蒽貝素純度很高，可以達到98%以上，純度符合化學對照品要求，解決了蒽貝素化學對照品的供應問題，為酸藤子藥材的質(zhì)量控制提供了提供科學基礎(chǔ)和保證。

2、本發(fā)明設(shè)計合理，工藝簡單，利用水溶劑提取，經(jīng)過硅膠柱層析后即可得到純度較高的蒽貝素，最后經(jīng)制備高效液相色譜法制備出純度達到98%以上的蒽貝素化學對照品，方法簡便易行。

3、本發(fā)明分離速度快，生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有很好的應用前景。

4、本發(fā)明采用薄層色譜和高效液相色譜進行純度檢查、含量測定及質(zhì)量控制，確保產(chǎn)品的質(zhì)量。

通過對蒽貝素化學對照品進行研究，建立蒽貝素化學對照品的批量提取工藝、純度與含量以及雜質(zhì)檢查的分析測定方法，從而建立蒽貝素化學對照品的技術(shù)標準，為其作為中藥化學對照品以及藥材和制劑的質(zhì)量標準研究提供科學基礎(chǔ)和保證。研究結(jié)果可為蒽貝素化學對照品提供更完整的基礎(chǔ)化學依據(jù)，掌握其化學信息和分析測試技術(shù)，有利于相關(guān)產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用，而且對于開發(fā)我國特有產(chǎn)物，開發(fā)具有高技術(shù)、高附加值的產(chǎn)品，提高市場競爭能力，將會產(chǎn)生潛在而不可估量的社會效益與經(jīng)濟效益。

附圖說明

分別取實施例1的最終樣品在流動相為乙腈-醋酸水體積比為85:15系統(tǒng)下檢測。

圖1：蒽貝素色譜峰紫外吸收光譜圖；

圖2：蒽貝素色譜峰純度檢查三維光譜圖，表明為單一純物質(zhì)峰；

圖3：蒽貝素dad峰純度檢查hplc色譜圖(>98%)，色譜圖為單一的峰，表明為純物質(zhì)峰；

圖4：蒽貝素質(zhì)量控制的hplc檢測色譜圖，主成分蒽貝素的含量大于98.0%。其中圖4中分析結(jié)果表定量方法：歸一化法

具體實施方式

實施例1：高純度蒽貝素的制備

取酸藤子成熟干果，加乙醚提取3次，每次加乙醚量為藥材重量8倍，每次提取時間為2小時，合并提取液，過濾，濾液濃縮，得浸膏，經(jīng)硅膠柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0:100～90:10）梯度洗脫，收集含有蒽貝素的洗脫部分，濃縮，得到蒽貝素粗結(jié)晶。

將粗結(jié)晶用制備型rp-hplc進行制備（色譜柱：c-18柱；流動相：甲醇:水體積比為87:13；檢測波長為290nm；流速為5ml/min），分別收集純度在90%-98%之間和純度大于98%以上的洗脫液，減壓濃縮，得到純度在90%-98%之間以及大于98%以上的蒽貝素。

用hplc分析方法對所有制備液進行檢測：色譜柱c-18柱；流動相為乙腈:醋酸水體積比為85:15；檢測波長為290nm；流速1ml/min；合并保留時間相同而且純度在重量90%～98%之間以及純度大于重量98%以上的蒽貝素制備液，減壓濃縮，得到純度在重量90%～98%之間以及純度大于98%以上的蒽貝素紅褐色粉末。

實施例2：高純度蒽貝素的制備

取酸藤子成熟果子，加乙醚提取2次，每次加乙醚量為藥材重量10倍，每次提取時間為3小時，濾過，合并濾液，濃縮，得浸膏，提取物經(jīng)硅膠柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0:100～85:15）梯度洗脫，收集含有蒽貝素的洗脫部分，濃縮，得到蒽貝素粗結(jié)晶。

將粗結(jié)晶用制備型rp-hplc進行制備（色譜柱：c-18柱；流動相甲醇:水體積比為80:20；檢測波長為290nm；流速為5ml/min），分別收集純度在90%-98%之間和純度大于98%以上的洗脫液，減壓濃縮，得到純度在90%-98%之間以及大于98%以上的蒽貝素。

用hplc分析方法對所有制備液進行檢測：色譜柱：c-18柱；流動相乙腈:醋酸水體積比為80:20；檢測波長為290nm；流速為1ml/min）；合并保留時間相同而且純度在重量90%～98%之間以及純度大于重量98%以上的蒽貝素，減壓濃縮，得到純度在重量90%～98%之間以及純度大于98%以上的蒽貝素紅褐色粉末。

實施例3：高純度蒽貝素的制備

取酸藤子成熟干果，加乙醚提取8次，每次加乙醚量為藥材重量2倍，每次提取時間為1小時，濾過，合并濾液，濃縮，得浸膏，提取物經(jīng)硅膠柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0:100～80:20）梯度洗脫，收集含有蒽貝素的洗脫部分，濃縮，得到蒽貝素粗結(jié)晶。

用hplc檢測，收集含有蒽貝素的流分，合并，濃縮，得到蒽貝素粗結(jié)晶。將粗結(jié)晶用制備型rp-hplc進行制備（色譜柱：c-18柱；流動相甲醇:水體積比為90:10；檢測波長為290nm；流速為5ml/min），分別收集純度在90%-98%之間和純度大于98%以上的洗脫液，減壓濃縮，得到純度在90%-98%之間以及大于98%以上的蒽貝素。

用hplc分析方法對所有制備液進行檢測：色譜柱：c-18柱；流動相：乙腈:醋酸水體積比為90:10；檢測波長為290nm；流速為1ml/min）；合并保留時間相同而且純度在重量90%～98%之間以及純度大于重量98%以上的蒽貝素，減壓濃縮，得到純度在重量90%～98%之間以及純度大于98%以上的蒽貝素紅褐色粉末。

實施例4：蒽貝素的檢測

取實施例1-3制得的含量在98%以上的蒽貝素，通過以下質(zhì)量控制方法進行檢測：

1、薄層色譜檢測方法：

分別取實施例1-3的最終樣品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅膠g為層析板上，層析板用3%草酸浸泡過，分別按20μg、40μg、60μg、80μg、100μg不同的濃度梯度點樣；分別采用以下展開劑系統(tǒng)置展開缸分別展開，展距為15cm：

展開劑系統(tǒng)1：以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1；

展開劑系統(tǒng)2：以甲苯-乙酸乙酯重量比例9：1；

展開劑系統(tǒng)3：石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2；

展開劑系統(tǒng)4：石油醚：乙酸乙酯重量比例9:1；

展開劑系統(tǒng)5：石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1；

展開劑系統(tǒng)6：石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例7:7:1；

展開后取出，晾干，碘顯色，置白光下檢視；結(jié)果在薄層色譜中，可見黃色的單一的熒光斑點，6種展開劑系統(tǒng)，3個樣品5個不同濃度的梯度點樣，均為單一斑點，未見雜質(zhì)斑點。

2、高效液相色譜法：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；

分別采用以下流動相系統(tǒng)，流速為1.0毫升/分鐘：

流動相系統(tǒng)1：乙腈-醋酸水溶液體積比為85:15；

流動相系統(tǒng)2：乙腈-醋酸水溶液體積比為90:10；

流動相系統(tǒng)3：乙腈-醋酸水溶液體積比為80:20；

流動相系統(tǒng)4：甲醇-醋酸水體積比為87:13；

流動相系統(tǒng)5：甲醇-醋酸水體積比為90:10；

流動相系統(tǒng)6：甲醇-醋酸水體積比為80:20；

檢測波長分別為290nm、310nm，理論板數(shù)按蒽貝素峰計算應不低于3000。

測定法取于105℃干燥至恒重的本品適量，精密稱定，分別加以上六個流動相系統(tǒng)溶液制成每1ml含3mg的溶液，搖勻，精密量取10μg注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分的出峰保留時間的2.5倍以上，用面積歸一化法計算含量，結(jié)果樣品測定蒽貝素含量在均98%以上。雜質(zhì)檢查，分別在不同系統(tǒng)記錄的色譜圖中，除溶劑峰外，雜質(zhì)峰面積總和結(jié)果均小于2.0%。

峰純度檢測：取對照品適量，分別按以上兩個流動相系統(tǒng)，在高效液相色譜儀上，用二極管陣列dad檢測器進行峰純度檢查，蒽貝素的hplc色譜峰>98%，其色譜峰紫外吸收光譜圖，三維圖譜以及5點光譜圖完全重合，表明為單一純物質(zhì)峰。

【結(jié)構(gòu)確證】

uvλ^cdcl3maxnm：290nm。

irνkbrmaxcm^-1：3300（-oh），1640（羰基）、1608（苯環(huán)）。

橙紅色結(jié)晶，mp141-143℃。ei-msm/z:294[m]⁺,154[m-c11h20]⁺(100)。¹h-nmr(600mhz,cdcl3)δppm：6.03(1h,s,h-6),2.40(2h,t,j=7.5hz,h-1?),1.43(2h,m,h-2),1.28-1.30(16h,m,h-3?~10?),0.89(3h,t,j=6.6hz,h-11?)；¹³c-nmr(150mhz,cdcl3)δppm：117.0(c-3),102.2(c-6),22.52(c-1?)~31.9(c-10?),14.1(c-11?)。

實驗結(jié)果表明：本發(fā)明分離、純化的蒽貝素化學對照品，經(jīng)紅外光譜、紫外光譜、核磁共振、質(zhì)譜以及理化檢測確認化學結(jié)構(gòu)。經(jīng)本發(fā)明公開的6個展開系統(tǒng)tlc檢測，6個流動相系統(tǒng)和2個不同波長的hplc檢測，同時對色譜峰用dad做純度檢查，表明符合中藥含量測定用化學對照品的要求，含量大于98%。