本發(fā)明涉及一種高效液相色譜分析分離方法，尤其是通過柱前衍生化分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的方法。

技術(shù)背景

前列腺素(prostaglandins，縮寫pgs)是一類重要的具有內(nèi)源性生理活性的物質(zhì)，在體內(nèi)各個(gè)組織中廣泛存在，是多種生理過程的重要介質(zhì)。由于在人體中含量極低，臨床上前列腺素類藥物主要是通過人工合成而來?？屏?nèi)酯二醇(coreylactonediol)是合成pgf2α前列腺素藥物的關(guān)鍵中間體，分子式為c8h12o4，化學(xué)名為：六氫-5-羥基-4-羥甲基-2h-環(huán)戊并[b]呋喃-2-酮，結(jié)構(gòu)式為：

通?？屏?nèi)酯二醇化合物分子中含有一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，即(3as,4r,5s,6ar)-六氫-5-羥基-4-羥甲基-2h-環(huán)戊并[b]呋喃-2-酮((+)-科立內(nèi)酯二醇)和(3ar,4s,5r,6as)-六氫-5-羥基-4-羥甲基-2h-環(huán)戊并[b]呋喃-2-酮((-)-科立內(nèi)酯二醇)，二者互為對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)在后續(xù)合成中繼續(xù)參與反應(yīng)，進(jìn)而形成多種對(duì)應(yīng)雜質(zhì)，難以分析分離和去除，嚴(yán)重影響前列腺素類藥物的質(zhì)量。

在眾多分析分離光學(xué)異構(gòu)體的方法中，應(yīng)用手性固定相的液相色譜法較為常見。但科立內(nèi)酯二醇分子極性較強(qiáng)，且紫外吸收較弱，直接應(yīng)用手性固定相的液相色譜分析分離科立內(nèi)酯二醇較為困難。

因此，如何建立一種能夠簡(jiǎn)單、高效的分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)其質(zhì)量的控制，是目前需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種采用柱前衍生的方法，使其能夠應(yīng)用手性固定相的液相色譜法進(jìn)行分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)科立內(nèi)酯二醇的質(zhì)量控制。

本發(fā)明提供一種通過柱前衍生分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的hplc方法，采用多糖衍生物類手性色譜柱，使用正相混合溶劑為流動(dòng)相的正相色譜法進(jìn)行分析分離。

本發(fā)明所述的柱前衍生分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的方法，所使用的衍生化試劑為三苯氯甲烷、苯甲酰氯或1,4-聯(lián)苯甲酰氯。

進(jìn)一步地，柱前衍生科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的方法，包括以下步驟：

(1)將科立內(nèi)酯二醇供試品及其對(duì)照品分別與衍生化試劑按摩爾比例1:1～1:2溶解到適量吡啶中，恒溫0℃～30℃反應(yīng)1～12h，得反應(yīng)液；

(2)將反應(yīng)液與水按體積比為1:5～1:20混合，得混合液；

(3)將混合液用適量乙酸乙脂萃取，分液，濃縮乙酸乙酯層，得到粗品；

(4)將粗品與異丙醚按照質(zhì)量/體積比為1:2～1:10混合，加熱攪拌0.5～1h，冷卻至室溫，過濾，干燥制得科立內(nèi)酯二醇衍生物供試品及其對(duì)照品。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的柱前衍生科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的方法，所制得的科立內(nèi)酯二醇衍生物是三苯氯甲烷衍生物、苯甲酰氯衍生物或1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物，其結(jié)構(gòu)式分別如下：

圖中a是三苯氯甲烷與科立內(nèi)酯二醇的衍生物，即三苯氯甲烷衍生物；b是苯甲酰氯與科立內(nèi)酯二醇的衍生物，即苯甲酰氯衍生物；c是1,4-聯(lián)苯甲酰氯與科立內(nèi)酯二醇的衍生物，，即1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物。由于不同衍生化試劑反應(yīng)活性不同，所得的科立內(nèi)酯二醇衍生物有所不同。三苯氯甲烷與科立內(nèi)酯二醇的伯醇羥基容易發(fā)生烷基化反應(yīng)，得到科立內(nèi)酯二醇單羥基衍生物；而苯甲酰氯，1,4-聯(lián)苯甲酰氯與科立內(nèi)酯二醇的伯醇和仲醇容易同時(shí)發(fā)生?；磻?yīng)，得到科立內(nèi)酯二醇雙羥基衍生物。

本發(fā)明所述的一種通過柱前衍生分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的hplc方法，所使用的多糖衍生物類手性柱可以是硅膠表面涂覆有纖維素類手性色譜柱，硅膠表面涂覆有直鏈淀粉類手性色譜柱中的一種，具體為硅膠表面涂覆有纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，硅膠表面涂覆有直鏈淀粉-三(s)-α-甲基苯基氨基甲酸酯。

本發(fā)明所述的一種通過柱前衍生分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的hplc方法，選用正相色譜法所使用的流動(dòng)相是正己烷/異丙醇或正己烷/無水乙醇的混合溶劑。

進(jìn)一步地，所使用的流動(dòng)相正己烷/異丙醇的體積比例為95:5～50:50；所使用流動(dòng)相正己烷/無水乙醇的體積比例為95:5～50:50.

本發(fā)明所述的分析分離方法，可按照以下方法實(shí)現(xiàn)：

(1)科立內(nèi)酯二醇衍生物對(duì)照品用無水乙醇溶解，分別配制成濃度為1μg/ml的科立內(nèi)酯二醇衍生物的對(duì)照品溶液

(2)科立內(nèi)酯二醇衍生物供試品用無水乙醇溶解，配制成1ml含科立內(nèi)酯二醇的衍生物1～10μg的供試品溶液；

(3)設(shè)置正己烷/異丙醇或正己烷/無水乙醇流動(dòng)相流速為0.2～1.5ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為230±5nm；柱溫為15-40℃；

(4)取步驟(1)和(2)所制溶液各2～20μl分別注入手性色譜柱(250×4.6mm,5.0μm)，完成科立內(nèi)酯二醇衍生物對(duì)映異構(gòu)體的分析與分離。

與以往技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明采用的柱前衍生化，所得科立內(nèi)酯二醇衍生物分子增加了生色團(tuán)，提高紫外吸收強(qiáng)度，增加了紫外波長(zhǎng)處的可檢測(cè)性；所得科立內(nèi)酯二醇衍生物分子極性降低，手性固定相對(duì)其選擇性增加，提高了其對(duì)映異構(gòu)體的分離度；

(2)采用較優(yōu)選的手性色譜柱，采用較優(yōu)選的流動(dòng)相，選用較優(yōu)的進(jìn)樣量，選用較優(yōu)的波長(zhǎng)，從而確保了衍生物的穩(wěn)定性，提高了色譜峰的對(duì)稱性，并且有較好的分離效果；

(3)本發(fā)明能夠使科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體適用于手性固定相的液相色譜法分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)科立內(nèi)酯二醇的質(zhì)量控制。

可見，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決了科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的分析分離問題，能夠快速、準(zhǔn)確和高效分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體，有效控制其質(zhì)量，進(jìn)而確保前列腺素類藥物質(zhì)量和安全性。

因此，本發(fā)明開發(fā)的一種通過柱前衍生分析分離科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體的hplc方法是十分必要的。

附圖說明

圖1：三苯氯甲烷衍生物hplc圖，色譜條件：色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)；流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(90:10)；柱溫：30℃。

圖2：苯甲酰氯衍生物hplc圖，色譜條件：色譜柱：bcas-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(80:20)；柱溫：35℃。

圖3：1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物hplc圖，色譜條件：色譜柱：bcas-h(250mm×4.6mm,5.0μm)；流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(70:30)；柱溫：30℃。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于具體實(shí)施例。

實(shí)施例1

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(95:5)

柱溫：40℃

流速：1.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為14.5.

實(shí)施例2

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(50:50)

柱溫：15℃

流速：0.2ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

實(shí)驗(yàn)步驟

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各5μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為4.8。

實(shí)施例3

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(90:10)

柱溫：30℃

流速：0.8ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

實(shí)驗(yàn)步驟

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見附圖1，用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為9.2。

實(shí)施例4

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(95:5)

柱溫：40℃

流速：1.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

實(shí)驗(yàn)步驟

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各20μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為12.1。

實(shí)施例5

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(50:50)

柱溫：15℃

流速：0.2ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

實(shí)驗(yàn)步驟

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為11.1。

實(shí)施例6

1.三苯氯甲烷衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與三苯氯甲烷按摩爾比例1:1溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:5將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到三苯氯甲烷衍生物供試品及兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

儀器與條件

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(80:20)

柱溫：30℃

流速：0.8ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

實(shí)驗(yàn)步驟

分別精密稱取上述兩種三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取三苯氯甲烷衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取三苯氯甲烷衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用三苯氯甲烷衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為10.9。

實(shí)施例7

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(90:10)

柱溫：30℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.0。

實(shí)施例8

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(70:30)

柱溫：35℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各20μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.5。

實(shí)施例9

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(80:20)

柱溫：35℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.4。

實(shí)施例10

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(90:10)

柱溫：25℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各20μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為1.7。

實(shí)施例11

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(70:30)

柱溫：30℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.0。

實(shí)施例12

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcod-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(80:20)

柱溫：25℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為1.6。

實(shí)施例13

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(80:20)

柱溫：35℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各20μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見附圖2，用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.2。

實(shí)施例14

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(60:40)

柱溫：30℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為1.5。

實(shí)施例15

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(70:30)

柱溫：30℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為1.7。

實(shí)施例16

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(90:10)

柱溫：25℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各15μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為3.7。

實(shí)施例17

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(80:20)

柱溫：30℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各5μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.6。

實(shí)施例18

1.苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:10將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到苯甲酰氯衍生物供試品及兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(70:30)

柱溫：30℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

分別精密稱取上述兩種苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.7。

實(shí)施例19

1.1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與1,4-聯(lián)苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:20將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品及兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(80:20)

柱溫：35℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm

分別精密稱取上述兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的供試品溶液；分別吸取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為4.2。

實(shí)施例20

1.1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與1,4-聯(lián)苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:20將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品及兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(50:50)

柱溫：25℃

流速：0.5ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

分別精密稱取上述兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為5μg/ml的供試品溶液；分別吸取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各10μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.5。

實(shí)施例21

1.1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生科立內(nèi)酯二醇的方法：

將科立內(nèi)酯二醇供試品、(+)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品、(-)-科立內(nèi)酯二醇對(duì)照品分別與1,4-聯(lián)苯甲酰氯按摩爾比例1:2溶解到適量吡啶中，恒溫反應(yīng)；按體積比1:20將反應(yīng)液與水混合；將混合液用適量乙酸乙酯萃取，濃縮乙酸乙酯層得粗品；粗品用適量異丙醚重結(jié)晶，得到1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品及兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品。

2.液相色譜分析方法

色譜柱：bcas-h(250×4.6mm,5.0μm)

流動(dòng)相：正己烷-無水乙醇(70:30)

柱溫：30℃

流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm

分別精密稱取上述兩種1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品分別用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為1μg/ml的對(duì)照品溶液；精密稱取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物供試品用無水乙醇溶解，稀釋，配制成濃度為10μg/ml的供試品溶液；分別吸取1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生物對(duì)照品及供試品溶液各2μl進(jìn)入液相色譜儀，記錄色譜圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見附圖3，用1,4-聯(lián)苯甲酰氯衍生的科立內(nèi)酯二醇對(duì)映異構(gòu)體能夠有效分離，分離度為2.6。