本發(fā)明屬于化學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測定人參中人參皂苷rg1和re含量的方法。
背景技術(shù)：
：人參是我國地道藥材中應(yīng)用最廣泛的代表，人參皂苷是人參的主要藥效成分，人參皂苷具有增強記憶力，提高免疫力，改善心血管，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，延緩衰老和抗腫瘤等功能，人參皂苷的含量測定已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點。但是在測定過程中，由于樣品中的色素雜質(zhì)過多，從而造成測定結(jié)果不準(zhǔn)確，因此建立有效除雜并測定準(zhǔn)確的人參皂苷檢測方法對人參及其制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述不足，本發(fā)明旨在將ase(快速溶劑萃取法)、gcb(石墨化炭黑)和hplc(高效液相色譜法)三者有效結(jié)合，從而提高測定的準(zhǔn)確率以及穩(wěn)定性，提高方法的重復(fù)性的一種ase-hplc法測定人參中人參皂苷含量的方法，且該方法可同時測定人參中的人參皂苷rg1和re。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測定人參葉中人參皂苷rg1和re含量的方法，依次包括下述步驟：步驟1：采用ase對粉碎后的人參進(jìn)行甲醇萃取，取1ml萃取液與75mg石墨化炭黑混合，過濾，得甲醇萃取液；步驟2：采用hplc法檢測甲醇萃取液中人參皂苷rg1和re的含量。進(jìn)一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：步驟s1：將樣品粉碎，過三號篩，取過篩后的粉末0.2g；步驟s2：將0.2g的人參粉末與1g硅藻土混合，裝于放有過濾膜的5mlase萃取池中，加硅藻土至與池口平行；步驟s3：用甲醇萃取，蒸干，加甲醇溶解，并用甲醇定容至10ml；步驟s4：取1ml步驟s3所得溶液與75mggcb混合，漩渦振蕩1min，離心，取上清液過0.22微米濾膜后得甲醇萃取液。進(jìn)一步的，步驟s3所述的萃取，參數(shù)如下：萃取溫度為110℃，萃取時間為7min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為80％，吹掃時間為60s。進(jìn)一步的，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為體積比等于18:82的乙腈-水；檢測波長：203nm。進(jìn)一步的，步驟s4所述的離心參數(shù)為：速度為10000r/min，時間為4min。進(jìn)一步的，步驟1所述的萃取所采用的儀器為美國dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀；步驟2所述的hplc法檢測所采用的儀器為agilent1290高效液相色譜儀。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點：1.本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，使用過正己烷飽和的甲醇和甲醇兩種溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果顯示甲醇提取和藥典方法的含量一致且雜質(zhì)峰基本相同，正己烷飽和的甲醇提取的樣品含量偏低，故采用與藥典一致的提取溶劑；2.本發(fā)明曾對提取并定容后的樣品進(jìn)行凈化，分別取定容后的樣品1.00ml分別加入到裝有25mg、50mg、75mg、100mg的gcb的2ml離心管渦旋1min，10000r/min離心4min后吸取上清液過濾上機測定。結(jié)果表明gcb能優(yōu)先吸附色素使樣品中的雜質(zhì)明顯降低，但當(dāng)色素被吸附完全后樣品中待測成分就有可能gcb吸附，故選擇75mg的gcb添加量。3.本發(fā)明將ase(快速溶劑萃取法)、gcb(石墨化炭黑)和hplc(高效液相色譜法)三者有效結(jié)合，從而提高測定的準(zhǔn)確率以及穩(wěn)定性，提高方法的重復(fù)性的方法，且該方法可同時測定人參中的人參皂苷rg1和re。附圖說明圖1為人參皂苷rg1以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；圖2為人參皂苷re以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；圖3為人參皂苷rg1和re對照品圖譜圖；圖4為ase法萃取的樣品圖譜圖；圖5為藥典方法提取的樣品圖譜；圖6為使用不同量的gcb對樣品雜質(zhì)的影響圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。實施例11.儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、agilent1290高效液相色譜儀1.2試劑(除特別注明外，本實驗所用試劑均為分析純)：水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；甲醇(ch3oh)：色譜純(液相色譜用)。2方法2.1對照品溶液的制備：取人參皂苷rg1對照品、人參皂苷re對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1ml含人參皂苷rg10.2mg、人參皂苷re0.2mg的溶液。2.2供試品溶液的制備2.2.1《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品粉末約0.2g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷30ml，加熱回流1小時，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇30ml，加熱回流3小時，提取液低溫蒸干，加水10ml使溶解，加石油醚(30～60℃)提取2次，每次10ml，棄去醚液，水液通過d101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5cm，柱長為15cm)，以水50ml洗脫，棄去水液。再用20％乙醇50ml洗脫，棄去20％乙醇洗脫液，繼用80％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液70ml，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，約0.2g，精密稱定，與1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好過濾膜的ase5ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，再吸取1ml至裝有75mggcb的2ml離心管中，漩渦振蕩1min，離心，濾過，濾液過0.22微米濾膜后進(jìn)入hplc測定。2.3ase萃取條件萃取溫度為110℃，萃取時間為7min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為80％，吹掃時間為60s。2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(18:82)為流動相梯度洗脫；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按人參皂苷re峰計算應(yīng)不低于1500。2.5測定法照高效液相色譜法(通則0512)測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，即得。hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為體積比等于18:82的乙腈-水；檢測波長：203nm。2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求本品含人參皂苷rg1(c42h72o14)和人參皂苷re(c48h82o18)的總量不得少于2.25％。2.7計算式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；ax——供試品的峰面積；ar——對照品峰面積。注意：1.使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；2.萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；3.萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過多；4.開機前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；5.使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。3結(jié)果3.1線性關(guān)系取人參皂苷rg1對照品、人參皂苷re對照品，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含0.2mg的混合溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、3μl進(jìn)入lc測定，并依照上述方法測定，人參皂苷rg1線性試驗結(jié)果見表1，人參皂苷re線性試驗結(jié)果見表2。以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得人參皂苷rg1的回歸方程：y＝1264.2x+7.6763，r2＝0.99979,在0.0911～0.5466mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；詳見圖1。以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得人參皂苷re的回歸方程：y＝1148.8x-0.96132，r2＝0.99998，在0.1013～0.6078mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；詳見圖2。表1表23.2重復(fù)性試驗取相同批號的樣品(批號：15071601)0.2g，共3份，精密稱定，按2.2.2ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中人參皂苷rg1和re的總含量見表3，rsd為0.5％，試驗表明ase提取方法重復(fù)性良好。表33.3精密度和穩(wěn)定性試驗取人參皂苷rg1對照品溶液(0.1822mg/ml)，和人參皂苷re對照品溶液(0.2026mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd人參皂苷rg1為1.1％，人參皂苷re為0.5％，表明儀器精密度良好，詳見圖3，其中人參皂苷rg1(tr：9.443)和re(tr：10.021)。取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，8，12h依法測定。記錄峰面積，峰面積rsd人參皂苷rg1為0.6％，人參皂苷re為0.9％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(3批)樣品不同ase儀器提取結(jié)果詳見表4，圖譜詳見圖4；使用ase法提取與使用藥典方法提取結(jié)果的比較結(jié)果詳見表5，藥典方法提取樣品的圖譜詳見圖5。表4樣品批號ase1方法測得含量(％)ase2方法測得含量(％)rad(％)150716013.453.272.7％1203033.203.121.3％14072211.901.851.3％表5樣品批號ase1方法測得含量(％)藥典方法測得含量(％)rad(％)150716013.453.430.3％1203033.203.131.1％14072211.901.930.8％4討論：4.1ase提取溶劑的選擇：試驗中，曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，使用過正己烷飽和的甲醇和甲醇兩種溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果顯示甲醇提取和藥典方法的含量一致且雜質(zhì)峰基本相同，正己烷飽和的甲醇提取的樣品含量偏低，故采用與藥典一致的提取溶劑。4.2ase提取凈化試驗中，曾對提取并定容后的樣品進(jìn)行凈化，分別取定容后的樣品1.00ml分別加入到裝有25mg、50mg、75mg、100mg的gcb的2ml離心管渦旋1min，10000r/min離心4min后吸取上清液過濾上機測定。結(jié)果表明gcb能優(yōu)先吸附色素使樣品中的雜質(zhì)明顯降低，但當(dāng)色素被吸附完全后樣品中待測成分就有可能gcb吸附，故選擇75mg的gcb添加量。使用不同量的gcb對樣品雜質(zhì)的影響圖詳見圖6。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12