本發(fā)明涉及甾體皂苷衍生物，尤其涉及以偽原薯蕷皂苷為底物，采用生物轉(zhuǎn)化的方法所制備得到甾體皂苷衍生物，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該甾體皂苷衍生物在治療心血管系統(tǒng)疾病、抗腫瘤、提高免疫力或降低血糖等方面中的應(yīng)用，屬于甾體皂苷衍生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：甾體皂苷是天然產(chǎn)物中一類重要的化學(xué)成分，主要分為呋甾皂苷和螺甾皂苷(fengb,kangl-p,mab-p,etal.thesubstratespecificityofaglucoamylasewithsteroidalsaponin-rhamnosidaseactivityfromcurvularialunata[j].tetrahedron,2007,63(29):6796-812.)，大多具有一定的藥理活性，主要包括治療心血管系統(tǒng)疾病、抗腫瘤、提高免疫力、降低血糖、抗生育、抗菌作用等。甾體皂苷的研究在天然產(chǎn)物化學(xué)中一直占有重要的地位。其主要分為兩大類：呋甾烷型(furostanoside)和螺甾烷型(spirostanoside)。通過生物轉(zhuǎn)化對該類物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，能得到結(jié)構(gòu)新穎的物質(zhì)。生物轉(zhuǎn)化相比傳統(tǒng)的化學(xué)方法有很多的優(yōu)點(diǎn)，生物轉(zhuǎn)化的條件比較溫和，室溫、常壓和在近于中性的ph中進(jìn)行，反應(yīng)過程也更加環(huán)保綠色，并且具有高度的區(qū)域選擇性和底物專一性(hegazym-ef,mohamedta,elshamyai,etal.microbialbiotransformationasatoolfordrugdevelopmentbasedonnaturalproductsfrommevalonicacidpathway:areview[j].journalofadvancedresearch,2015,6(1):17-33)。甾體皂苷生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)過程主要包括脫糖反應(yīng)，加糖反應(yīng)，加羥基，脫甲氧基形成雙鍵、雙鍵氧化斷裂為羰基等。用生物轉(zhuǎn)化的方法對甾體皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，能夠得到一些化學(xué)方法比較難以獲得的化合物，反應(yīng)條件更加溫和環(huán)保，并具有高度的區(qū)域選擇性，因此生物轉(zhuǎn)化越來越重視并且得到了很多發(fā)展。偽原薯蕷皂苷廣泛存在于薯蕷屬植物中，是治療心血管疾病地奧心血康的有效成份之一，具有細(xì)胞毒、抗真菌、抗病毒以及心血管方面的活性。meidong等人(dongm,fengx,wangbx,etal.microbialmetabolismofpseudoprotodioscin[j].plantamed,2004,70(7):637-41)用煙曲霉對偽原薯蕷皂苷(化合物1)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，分離鑒定四個(gè)化合物，其中化合物2和3為新化合物(圖1)。原薯蕷皂苷是也是呋甾皂苷，全波等人(全波,馬百平.米曲霉對穿山龍中甾體皂苷的生物轉(zhuǎn)化[d]；沈陽藥科大學(xué),2006.)用米曲霉對其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并且研究了其生物轉(zhuǎn)化途徑(圖2)。以偽原薯蕷皂苷為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的制備方法大多存在生物轉(zhuǎn)化效率低、產(chǎn)物收率低等缺陷，此外，采用該生物轉(zhuǎn)化制備得到的甾體皂苷衍生物不同程度的存在藥理活性較低、毒性較大等問題，有待改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一類具有較高藥理活性且安全性更好的甾體皂苷衍生物；本發(fā)明的目的之二是提供一種高轉(zhuǎn)化效率的甾體皂苷衍生物的制備方法；本發(fā)明的目的之三是將所述的甾體皂苷衍生物應(yīng)用于制備治療心血管系統(tǒng)疾病、抗腫瘤、提高免疫力、降低血糖、抗生育、抗菌等方面。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：甾體皂苷衍生物，其結(jié)構(gòu)式為下述式ⅰ-式ⅴ所示的任何一種化合物：r1＝-β-d-glu所述甾體皂苷衍生物的鹽也當(dāng)然包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種所述的甾體皂苷衍生物的生物轉(zhuǎn)化制備方法，包括以下步驟：(1)以偽原薯蕷皂苷為底物，用橄欖色毛殼(chaetomiumolivaceum)菌株為生物轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；將反應(yīng)產(chǎn)物萃取，萃取液濃縮，得到粗提物；(2)把粗提物上硅膠柱后，用洗脫液進(jìn)行洗脫；洗脫液為氯仿-甲醇-水，極性由12.5:1:0.08到1:1:0.1；點(diǎn)板合并后，最終得到1-12份樣品；樣品9再次上硅膠柱洗脫液為chcl3–meoh–h2o，比例為7:1:0.1,5:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1,2:1:0.1和1:1:0.1，得到7份樣品a9-g9；d9和e9是主成分點(diǎn)，將d9上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o，比例為71:39,得到式ⅰ化合物和式ⅱ化合物；將e9上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o，比例為67:33,得到式?；衔?；樣品8上硅膠柱，洗脫液為chcl3-meoh-h2o，比例為10:1:0.07,8:1:0.07,6:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1；共接了18份組份，第8和第9份組份合并后上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o(62:38,2ml/min)得到式ⅳ化合物；將樣品7上凝膠柱，流動(dòng)相為meoh，最終獲得6份樣品a7-f7；將樣品b7上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o，比例為80:20,得到式ⅴ化合物。作為優(yōu)選的，步驟(1)中所述的萃取是每瓶培養(yǎng)基中加入等量的正丁醇進(jìn)行超聲萃??；步驟(2)中粗提物上硅膠柱是用100-200目的硅膠拌樣，用200-300目硅膠裝柱。本發(fā)明通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，式ⅰ-式ⅴ所示的化合物對hepg2(肝癌細(xì)胞)、mcf-7(人乳腺癌細(xì)胞)、nci-h460(人肺小細(xì)胞肺癌)、sf-268(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)等癌細(xì)胞株有強(qiáng)烈的抗癌活性，但是對正常細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)低于偽原薯蕷皂苷對正常細(xì)胞的毒性。本發(fā)明所述腫瘤包括：原發(fā)實(shí)體瘤、耐藥腫瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、惡性組織或細(xì)胞中的任意一種或多種；優(yōu)選的，所述癌包括：鼻咽癌，口腔表皮樣癌，梭形細(xì)胞癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，結(jié)腸癌(包括結(jié)腸直腸癌)，直腸癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌，非鱗狀非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌，轉(zhuǎn)移性her2陰性乳腺癌，腦癌，成人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，兒童腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，兒童抵抗性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，星形細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，兒童成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腦膜瘤，腎癌(如晚期腎細(xì)胞癌)，膀胱癌，宮頸癌，食管癌，胃癌，頭頸部癌，肝癌，肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)，鱗狀非小細(xì)胞肺癌，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤(包括骨肉瘤)，皮膚癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)，胃癌，睪丸癌，甲狀腺癌，子宮癌，間皮瘤，膽管癌，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，纖維肉瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌癌，唾液腺癌中的任意一種或多種。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種抗腫瘤的藥物組合物，含有治療上有效量的甾體皂苷衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括：溶劑、表面活性劑、增溶劑、助溶劑、潤滑劑、填充劑、等滲調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或支持劑中的任意一種或多種。本發(fā)明所述抗腫瘤制劑的劑型包括：注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、溶膠劑、凍干粉針劑、膠漿劑、氣霧劑、微囊、微球、納米制劑、緩釋制劑或控釋制劑中的任意一種或多種；優(yōu)選為納米制劑。其中，所述納米制劑包括：脂質(zhì)體、納米囊、納米球、脂質(zhì)納米?；蚰z束中的任意一種或多種，優(yōu)選為脂質(zhì)體或膠束中的任意一種或兩種。本發(fā)明所述納米制劑的粒徑為10納米-300納米。制備所述納米制劑的常規(guī)材料包括：脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、高分子聚合物、兩嵌段聚合物、三嵌段聚合物、蛋白、多肽、核酸、殼聚糖、表面活性劑、增溶劑、助溶劑、填充劑、等滲調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、支持劑等。本發(fā)明抗腫瘤組合物或抗癌制劑可通過臨床可接受的治療方式給藥，包括注射、口服、吸入、植入或灌注等。本發(fā)明采用對缺氧復(fù)氧h9c2心肌細(xì)胞存活率的影響實(shí)驗(yàn)評價(jià)本發(fā)明化合物對心肌的保護(hù)活性。通過細(xì)胞存活率的測定(mtt)、上清液中l(wèi)dh的測定、ctn-i蛋白釋放量的測定，確定本發(fā)明式ⅰ-式ⅴ所示的化合物對缺氧復(fù)氧損傷的大鼠心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，相比于偽原薯蕷皂苷，本發(fā)明式ⅰ-式ⅴ所示的化合物具有優(yōu)異的溶血栓活性，能夠應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種預(yù)防或治療心血管疾病的藥物組合物，含有治療上有效量的甾體皂苷衍生物和藥學(xué)上可接受的載體；所述載體包括：溶劑、表面活性劑、增溶劑、助溶劑、潤滑劑、填充劑、等滲調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或支持劑中的任意一種或多種。本發(fā)明所述預(yù)防或治療心血管疾病的藥物組合物可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)制劑方法制備成臨床上適宜的制劑劑型，包括：注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、溶膠劑、凍干粉針劑、膠漿劑、氣霧劑、微囊、微球、納米制劑、緩釋制劑或控釋制劑中的任意一種或多種；優(yōu)選為納米制劑。其中，所述納米制劑包括：脂質(zhì)體、納米囊、納米球、脂質(zhì)納米?；蚰z束中的任意一種或多種，優(yōu)選為脂質(zhì)體或膠束中的任意一種或兩種。本發(fā)明所述納米制劑的粒徑為10納米-300納米。制備所述納米制劑的常規(guī)材料包括：脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、高分子聚合物、兩嵌段聚合物、三嵌段聚合物、蛋白、多肽、核酸、殼聚糖、表面活性劑、增溶劑、助溶劑、填充劑、等滲調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、支持劑等。本發(fā)明治療心血管疾病的藥物制劑可通過臨床可接受的治療方式給藥，包括注射、口服、吸入、植入或灌注等。此外，式ⅰ-式ⅴ所示的化合物還具有提高免疫力、抗菌、抗生育等方面的藥理活性。附圖說明圖1是現(xiàn)有技術(shù)中偽原薯蕷皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑；圖2是原薯蕷皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑；圖3是本發(fā)明載體皂苷衍生物的結(jié)構(gòu)式；圖4粗體物的薄層板圖，從左到右依次為樣品1-12；圖5樣品9的薄層板圖；圖6樣品8的薄層板圖；圖7樣品7的薄層板圖；圖8甾體皂苷衍生物的對心機(jī)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9h9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的建立結(jié)果；圖10乳酸脫氫酶(ldh:lacticdehydrogenase)釋放量的測定結(jié)果；圖11心肌肌鈣蛋白(ctni)釋放量的測定結(jié)果；圖12對缺氧復(fù)氧損傷的h9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響測定結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1甾體皂苷衍生物的制備及鑒定1.菌株的擴(kuò)大及萃取先把試管中的菌(橄欖色毛殼chaetomiumolivaceumcgmcc3.3604)接種在一瓶250ml的三角瓶中培養(yǎng)了2天，然后用膠頭滴管把這個(gè)三角瓶中的菌轉(zhuǎn)接入17個(gè)1l的三角瓶中。實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基。搖床條件為28℃，160r/min；繼續(xù)培養(yǎng)2天后加入底物偽原薯蕷皂苷。加入的量為2.5g(把2.5g偽原薯蕷皂苷用17ml的甲醇溶解，然后把每個(gè)三角瓶中加入1ml)。加入底物4天后終止反應(yīng)：每瓶培養(yǎng)基中加入等量(400ml)的正丁醇超聲萃取30min,重復(fù)三次。把萃取液旋蒸濃縮。共得到粗提物19.32g。2.粗提物的分離把粗提物用35g100-200目的硅膠拌樣，500g200-300目硅膠裝柱。洗脫液為氯仿-甲醇-水，極性由12.5:1:0.08到1:1:0.1(表1)。用100ml的錐形瓶接樣品，所接樣品點(diǎn)板合并后得12份。薄層板圖見圖4。薄層板從左到右依次為樣品1-12(偽原薯蕷皂苷(實(shí)驗(yàn)室已有標(biāo)準(zhǔn)品)，纖細(xì)薯蕷皂苷(實(shí)驗(yàn)室已有標(biāo)準(zhǔn)品)，薯蕷皂苷(實(shí)驗(yàn)室已有標(biāo)準(zhǔn)品)，粗提物，空白對照)。表1樣品9為1.952g，用100-200目的硅膠5g版樣，300-400目的硅膠60g裝柱，洗脫液為chcl3–meoh–h2o(7:1:0.1,5:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1,2:1:0.1和1:1:0.1)(表2)，然后又得到7份樣品，合并后得七份樣品(a9-g9)，薄層板圖為圖5；薄層板從左往右依次為a9-g9(偽原薯蕷皂苷，纖細(xì)薯蕷皂苷，薯蕷皂苷)。表2洗脫液氯仿甲醇水比例(ml)280404300606240606300100102601301315015015d9和e9是主成分點(diǎn)，因?yàn)轭伾?，先上了凝膠除色素。然后d9上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o(71:39,2ml/min)得到純品化合物1(式ⅰ化合物)(20.59mg)和化合物2(式ⅱ化合物)(4mg)。e9也用制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o(67:33,2ml/min)得到化合物3(式?；衔?(15.8mg)。樣品8為468mg，用100-200目的硅膠1.5g拌樣，300-400目硅膠20g裝柱。上硅膠柱(300-400目,20g)洗脫液為chcl3-meoh-h2o比例為10:1:0.07,8:1:0.07,6:1:0.1,4:1:0.1,3:1:0.1(表3)，共接了18份組份，薄層板圖為圖6。表3洗脫液氯仿甲醇水比例(ml)100100.7160201.4180303200505180606第8和第9份合并后上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o(62:38,2ml/min)得到純品化合物4(式ⅳ化合物)(1.59mg)。樣品7(496mg)先上凝膠，流動(dòng)相為meoh.。最終獲得6份樣品(a7-f7)；薄層板圖見圖7(從左至右依次為a7-f7)。樣品b7上制備液相，流動(dòng)相為meoh-h2o(80:20,2ml/min)得到化合物5(式ⅴ化合物)(12.09mg)?；衔?：白色粉末。uv為末端吸收。[α]d20＝—20.86(c0.110,meoh)ir(neat)vmax(cm-1):3372,2935,1364,1033。hr-esi-msm/z:937.4758[m+na]+(calcdforc46h74o18na,937.4773)?；衔?：白色粉末。uv為末端吸收。[α]d20＝—20.41(c0.074,meoh)ir(neat)vmax(cm-1):3362,2932,1448,1379,1039。hr-esi-msm/z:937.4782[m+na]+(calcdforc46h74o18na,937.4773)。化合物3：白色粉末。uv為末端吸收。[α]d20＝—18.82(c0.090,meoh)ir(neat)vmax(cm-1):3369,2935,1363,1033。hr-esi-msm/z:955.4919[m+na]+(calcdforc46h76o19na,955.4879)?；衔?：白色粉末。uv為末端吸收。[α]d20＝—34.71(c0.081,meoh)ir(neat)vmax(cm-1):3384,2920,1762,1645,1033。hr-esi-msm/z:691.3331[m+na]+(calcdforc34h52o13na,691.3306)?；衔?：白色粉末。uv為末端吸收。[α]d20＝—20.86(c0.110,meoh)ir(neat)vmax(cm-1):3370,2935,1652,1456,1380,1033。hr-esi-msm/z:761.4097[m+na]+(calcdforc39h62o13na,761.4088)。實(shí)驗(yàn)例1甾體皂苷衍生物的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明實(shí)施例1制備的化合物1-5的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于偽原薯蕷皂苷或結(jié)構(gòu)類似化合物的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)例2甾體皂苷衍生物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明實(shí)施例1制備的化合物1-5的毒性明顯低于偽原薯蕷皂苷或結(jié)構(gòu)類似化合物的毒性。實(shí)驗(yàn)例3甾體皂苷衍生物的對心肌細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，在5％co2、37℃條件培養(yǎng)30h后移除培養(yǎng)液，加入用dmem配成的不同濃度(μg/ml)的化合物1-5，在同樣條件下培養(yǎng)24h。處理結(jié)束后，移除培養(yǎng)液，加入500μmh2o2放置1h后小心移除培養(yǎng)液，每孔中加入10μlcck-8，再放置2h后，在微孔板掃描酶標(biāo)儀測450nm處吸光度值(od值)。將各測試孔的od值減去本底o(hù)d值(無血清培養(yǎng)基加cck-8，無細(xì)胞)，根據(jù)各孔o(hù)d值計(jì)算平均值±sd。細(xì)胞存活率％＝(加藥細(xì)胞od值-本底o(hù)d值)/(對照細(xì)胞od值-本底o(hù)d值)×100％。細(xì)胞存活數(shù)如圖8所示。由圖8可見，本發(fā)明實(shí)施例1制備的化合物1-5對由過氧化氫引起損傷的心肌細(xì)胞，有顯著的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)例4甾體皂苷衍生物對h9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1、供試化合物：本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物1-5(s1)；2、陽性對照樣品：地奧心血康。二、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(一)h9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的建立對h9c2心肌細(xì)胞缺氧12h，分別復(fù)氧0、8、12、16和24h，采用mtt法檢測復(fù)氧不同時(shí)間h9c2心肌細(xì)胞存活率。復(fù)氧12h后，心肌細(xì)胞存活率為51.3％。表明缺氧8h，復(fù)氧12h的損傷條件最佳。此時(shí)細(xì)胞存活率為50％以上，損傷程度符合實(shí)驗(yàn)中建立細(xì)胞模型的要求(圖9)。(二)乳酸脫氫酶(ldh:lacticdehydrogenase)釋放量的測定h9c2細(xì)胞分為五組進(jìn)行給藥，對照組(con)、模型組(h/r)、s1低劑量組(h/r+l)、s1高劑量組(h/r+h)、陽性藥組(地奧心血康，da)。各組采用不含血清的dmem高糖培養(yǎng)基稀釋一定濃度的藥物對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理(孵育)24h。然后按照缺氧復(fù)氧的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集全部細(xì)胞上清，按照ldh測定試劑盒中的測定方法進(jìn)行檢測。測定結(jié)果表明，樣品s1低劑量及高劑量能明顯減少細(xì)胞上清的ldh釋放量(圖10)。(三)心肌肌鈣蛋白(ctni)釋放量的測定h9c2細(xì)胞分為五組進(jìn)行給藥，對照組(con)、模型組(h/r)、s1低劑量組(h/r+l)、s1高劑量組(h/r+h)、陽性藥組(地奧心血康，da)。采用不含血清的dmem高糖培養(yǎng)基稀釋一定濃度的藥物對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理(孵育)24h。然后按照缺氧復(fù)氧的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集全部細(xì)胞上清，按照ctni測定試劑盒中的測定方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明，樣品s1低劑量及高劑量能明顯減少細(xì)胞上清ctni的釋放量(圖11)。(四)對缺氧復(fù)氧損傷的h9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響檢測h9c2細(xì)胞分為五組進(jìn)行給藥，對照組(con)、模型組(h/r)、s1低劑量組(h/r+l)、s1高劑量組(h/r+h)、陽性藥組(地奧心血康，da)。各組采用不含血清的dmem高糖培養(yǎng)基稀釋一定濃度的藥物對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理(孵育)24h。然后按照缺氧復(fù)氧的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束除去細(xì)胞上清，清洗細(xì)胞后加入jc-1熒光探針液處理細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品s1低劑量和高劑量均能明顯降低缺氧復(fù)氧損傷的h9c2心肌細(xì)胞的線粒體膜電位而保護(hù)心肌細(xì)胞(圖12)。當(dāng)前第1頁12