專利名稱：洋金花總甾體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種洋金花總甾提取物，該提取物的制備方法以及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查表明，全球腫瘤患者比例約占6.89‰，而每年新增腫瘤患者為1.78‰，生存數(shù)近4000萬人。國(guó)家衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)資料表明，目前中國(guó)惡性腫瘤患病率達(dá)到1.15～1.27‰，因惡性腫瘤死亡居全部死因的第二位。惡性腫瘤的治療雖然取得很大進(jìn)展，但目前還缺乏理想的治療藥物，無法滿足臨床需要，惡性腫瘤仍被人們視為難治疾病，仍在不斷尋找安全有效的抗腫瘤藥物。
洋金花為傳統(tǒng)中藥，系茄科植物白曼陀羅Datura metel L.或毛曼陀羅Daturainnoxia Mill.的干燥花。亦名曼陀羅花(《御藥院方》)、大鬧楊花(《生草藥性備要》)等。中醫(yī)藥認(rèn)為其味辛，性溫，有毒。入肺、心、脾經(jīng)。功能定喘、祛風(fēng)、麻醉止痛。主治哮喘、驚癇、風(fēng)濕痹痛、腳氣、瘡瘍疼痛。并作外科手術(shù)麻醉劑。
含洋金花的中藥復(fù)方制劑有用于腫瘤治療(癌痛)專利申請(qǐng)見CN96118736.0、CN95119652.9。但單味藥及有效部位沒有抗腫瘤方面的文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明人通過深入研究篩選，首次發(fā)現(xiàn)洋金花中所含總甾體部位對(duì)治療惡性腫瘤非常有效。本發(fā)明人研究了該有效部位(總甾提取物)的制備方法，并進(jìn)一步研究了該總甾提取物的化學(xué)組分，該總甾提取物可用于制備抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究具有抗腫瘤活性的洋金花總甾提取物及其制備方法，提供其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
洋金花含有生物堿、黃酮、甾體類等化學(xué)成分，通過本發(fā)明人的篩選研究，發(fā)現(xiàn)甾體類組分具有顯著抗腫瘤活性，因此對(duì)洋金花總甾體的制備工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，得到洋金花總甾體提取物。
本發(fā)明提供了一種洋金花總甾提取物。
本發(fā)明涉及的洋金花總甾提取物，用植物化學(xué)方法分析鑒定發(fā)現(xiàn)其中包含豆甾-4-烯-3，6-二醇，豆甾-5，28-二烯-3，24-二醇，麥角甾-5，25-二烯-3，24-二醇，魏察曼陀羅素B，魏察曼陀羅素G，枸杞物質(zhì)B，12-去氧魏察曼陀羅內(nèi)酯，withatatulin(化合物分離及結(jié)構(gòu)鑒定見實(shí)施例4)。
該提取物的總甾體含量通過分光光度法測(cè)定見東戰(zhàn)國(guó)等，分析化學(xué)。1996，24(2)227-229，以β-谷甾醇或魏察曼陀羅素B或魏察曼陀羅素G為對(duì)照品，洋金花總甾提取物中總甾體含量為10-80％，優(yōu)選范圍為50-75％。
本發(fā)明的另一目的是提供了洋金花總甾提取物的制備方法洋金花以單一溶劑或混合溶劑提取，溶劑包括水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，所選提取溶劑包括并不限于以上種類(例如50％7醇)。提取方法可采用冷浸、超聲波提取、滲漉、加溫提取(例如回流提取)?？蓡未翁崛?，也可多次提取后(例如提取3次)，合并提取液，蒸發(fā)揮去溶劑得到洋金花提取物，將提取物按以下方法分離可以得到洋金花總甾提取物1、向洋金花提取物中加入含水醇，最終調(diào)節(jié)成含醇量為0％-30％的溶液(如15％)，用石油醚萃取此溶液0-6次(如3次)，將非石油醚層溶液通過吸附性樹脂(如D101大孔吸附樹脂)，以水洗脫水溶性物質(zhì)，以5-35％的乙醇(如25％)洗脫非甾類物質(zhì)，再以30-95％的乙醇洗脫(如95％)，便得到含有甾類物質(zhì)的餾分，揮去乙醇得濃縮液，以正丁醇或乙酸乙酯(如乙酸乙酯)萃取濃縮液1-6次(如3次)，合并有機(jī)相，以PH8-14的堿水(如PH11)洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以水洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以PH1-6的酸水(如PHi)洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以水洗滌有機(jī)相至中性，回收有機(jī)溶劑后得到洋金花總甾提取物。
具體包括下列步驟①提取稱取洋金花生藥，加入3-50倍重量的溶劑，溶劑為水、低級(jí)醇、丙酮或乙酸乙酯，或它們中的2種或2種以上混合溶劑；然后采用冷浸、超聲波、滲漉或加溫方法提取1-5次，合并提取液，除去有機(jī)溶劑，得到洋金花提取物；②樹脂分離向洋金花提取物中加入含水醇，最終調(diào)節(jié)成含醇量為0％-30％的溶液，用石油醚萃取此溶液0-6次，將非石油醚層溶液通過吸附性樹脂，以水洗脫水溶性物質(zhì)，以5-35％的乙醇洗脫非甾類物質(zhì)，再以35-95％的乙醇洗脫并收集洗脫液，得到含有甾類物質(zhì)的餾分，揮去乙醇得濃縮；③精制以正丁醇或乙酸乙酯萃取濃縮液1-6次，合并有機(jī)相，以pH8-14的堿水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相1-6次，以pH1-6的酸水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相至中性，回收有機(jī)溶劑后得到洋金花總甾提取物。
2、洋金花提取物以PH8-14的堿水(如PH3)溶解，以石油醚萃取此堿水溶液0-6次(如3次)，棄去石油醚層，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取堿水溶液1-6次(如3次)，合并有機(jī)相，以PH8-14的堿水(如PH13)洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以水洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以PH1-6的酸水(如PH3)洗滌有機(jī)相1-6次(如3次)，以水洗滌有機(jī)相至中性，將有機(jī)相濃縮后與氧化鋁或活性炭(如活性炭)混合，靜置10-100分鐘(如30分鐘)，過濾，用有機(jī)溶劑洗滌氧化鋁或活性炭(如活性炭)，有機(jī)溶劑選自低級(jí)醇、含水低級(jí)醇、丙酮、乙酸乙酯(如乙酸乙酯)，而且包括并不限于以上種類，可以使用一種有機(jī)溶劑，也可以使用2種或2種以上有機(jī)溶劑混合物，揮去溶劑，得到洋金花總甾提取物。
具體包括下列步驟①提取稱取洋金花生藥，加入3-50倍重量溶劑水、低級(jí)醇、丙酮或乙酸乙酯或它們的多種混合溶劑，采用冷浸、超聲波、滲漉或加溫方法提取1-5次，合并提取液，除去溶劑，得到洋金花提取物；②萃取洋金花提取物以pH8-14的堿水溶解，以石油醚萃取此堿水溶液0-6次，棄去石油醚層，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取堿水溶液1-6次，合并有機(jī)相，以pH8-14的堿水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相1-6次，以pH1-6的酸水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相至中性，揮去有機(jī)相得到洋金花總甾提取物。
本發(fā)明涉及的洋金花總甾提取物經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)顯示具有強(qiáng)大抗腫瘤作用。
本發(fā)明的洋金花提取物的體內(nèi)、體外藥效試驗(yàn)結(jié)果如下(一)洋金花總甾提取物體內(nèi)抑制S180腫瘤作用實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物和瘤株昆明種小鼠30只，雄性，體重20±1g，S180腹水瘤小鼠1只，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院動(dòng)物房提供。洋金花總甾提取物用時(shí)吐溫助溶，0.5％CMC Na配制為所需濃度。陽(yáng)性對(duì)照藥注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。
方法與結(jié)果小鼠30只，分為生理鹽水組、環(huán)磷酰胺(CTX)組(30mg/kg，i.p)、洋金花總甾提取物大(0.1g/kg)、中(0.05g/kg)、小(0.025g/kg)劑量組，每組6只，接種次日開始按體重口服給藥，連續(xù)給藥10天后處死小鼠，測(cè)小鼠體重及瘤重并記錄結(jié)果，計(jì)算洋金花總甾提取物的抑瘤率。抑瘤率＝(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％。
結(jié)果見表1。
表1、洋金花總甾提取物對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用

(2)洋金花總甾提取物體外抗腫瘤細(xì)胞作用試驗(yàn)材料MCF-7、K111、K562、L1210細(xì)胞單層或懸浮均可，制成細(xì)胞懸液的濃度為10-20×104/ml。MTT液濃度5mg/ml，溶解于生理鹽水，溶液儲(chǔ)存4℃，有效期為3周。溶解液含10％十二烷基硫酸鈉，5％異丁醇及0.02mol/L HCl液。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液按常規(guī)配制(含滅活小牛血清及適量抗生素)。受試藥物洋金花總甾提取物(按方法及結(jié)果取細(xì)胞懸液(相當(dāng)于1-2×105/孔的細(xì)胞)，取96孔微量培養(yǎng)板，加入一定密度的100μl/孔，每擋濃度設(shè)三復(fù)孔，陰性對(duì)照孔加入培養(yǎng)也來代替。另外，同時(shí)設(shè)無細(xì)胞無試劑100μl純培養(yǎng)液/孔的空白對(duì)照1-2空作為調(diào)儀器的零點(diǎn)孔，然后振蕩使混合，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱(48hr)后再加入MTT液20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4hr后，加入溶解液100μl/孔，在放置37℃培養(yǎng)箱中，次日，以A570波長(zhǎng)測(cè)各孔的光密度。各檔試液孔均值與陰性對(duì)照值比較得各檔濃度的百分抑制率(同時(shí)設(shè)一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥作為陽(yáng)性對(duì)照)。計(jì)算公式為IC％＝(C-T)/C×100％(T為試液組OD值C為陰性對(duì)照組OD值)。然后根據(jù)各個(gè)檢測(cè)液各檔濃度的IC％，以回歸曲線求得IC50值。
表2洋金花總甾提取物體外抗腫瘤活性

(3)洋金花總甾提取物口服抑制B16腫瘤作用試驗(yàn)材料洋金花總甾提取物(批號(hào)050926)使用時(shí)吐溫助溶，0.5％CMC Na配制為所需濃度。對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)020806。配制時(shí)用生理鹽水溶解。C57BL/6J種小鼠24只，雄性，體重20±1g，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院動(dòng)物房提供。
試驗(yàn)方法C57BL/6J荷瘤小鼠2只，無菌條件下取瘤，磨碎，用生理鹽水稀釋為1-2×107個(gè)/ml，按0.2ml/只給小鼠腋下皮下接種。次日將小鼠隨機(jī)分組，每組8只。對(duì)照品環(huán)磷酰胺采用腹腔注射途徑給藥，劑量為30mg/kg×7d。另設(shè)空白對(duì)照組。動(dòng)物接種次日開始按體重給藥，灌胃0.5ml/20g，連續(xù)9天，根據(jù)體重給藥，接種后第10天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率
抑瘤率＝(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100％試驗(yàn)結(jié)果表3、洋金花總甾提取物對(duì)移植B16腫瘤小鼠的抑瘤作用

以上實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的洋金花總甾提取物具有明顯的抗腫瘤活性。
因此，本發(fā)明的洋金花總甾提取物可作為有效組分，通過與藥用輔料按常規(guī)方法制成口服或非口服制劑，用于腫瘤的治療。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取洋金花100克，每次加入1升95％乙醇回流提取1小時(shí)，提取4次，合并提取液，揮去溶劑，得到洋金花提取物，該提取物用50％的乙醇溶解，用石油醚萃取此溶液4次，將非石油醚層用水稀釋1倍，混勻后通過D101大孔吸附性樹脂，以水洗脫水溶性物質(zhì)，以25％的乙醇洗脫非甾類物質(zhì)，再以95％的乙醇洗脫，收集95％的乙醇洗脫液，揮去乙醇得濃縮液，以乙酸乙酯萃取濃縮液3次，合并乙酸乙酯層，以PH13的氫氧化鈉水溶液洗滌乙酸乙酯層3次，以水洗滌有機(jī)相3次，以PH1的鹽酸水溶液洗滌乙酸乙酯層3次，以水洗滌乙酸乙酯層至中性，將乙酸乙酯層蒸干后得到洋金花總甾提取物0.39克，含甾體51.69％。
實(shí)施例2洋金花25克，每次加入200毫升50％乙醇回流提取0.5小時(shí)，提取3次，合并提取液，揮去乙醇，得到水溶液，再以乙酸乙酯萃取水溶液3次，合并乙酸乙酯層，以PH13的堿水洗滌乙酸乙酯層4次，以水洗滌有機(jī)相3次，以PH1的鹽酸水溶液洗滌乙酸乙酯層3次，以水洗滌乙酸乙酯層至中性，將乙酸乙酯層濃縮至10毫升，與氧化鋁混合，靜置后過濾，用95乙醇洗滌活性炭至無色，收集乙醇洗脫液蒸干，得到洋金花總甾提取物0.09克，含甾體40.68％。
實(shí)施例3取洋金花20克，每次加入200毫升85％乙醇回流提取2小時(shí)，提取3次，合并提取液，揮去溶劑，得到粗提物。該粗提物以200毫升PH11的堿水溶解，以乙酸乙酯萃取堿水溶液5次，合并乙酸乙酯層，以PH11的堿水洗滌乙酸乙酯層3次，以水洗滌有機(jī)相3次，以PH3的鹽酸水溶液洗滌乙酸乙酯層3次，以水洗滌乙酸乙酯層至中性，將乙酸乙酯層蒸干，得到洋金花總甾提取物0.5克，含甾體48.86％。
實(shí)施例4實(shí)施例1、2所得的總甾部位經(jīng)，以石油醚-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，用HF254硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流出物合并后分別經(jīng)低壓硅膠柱(300-400目)層析純化，得到以下8個(gè)化合物。經(jīng)分析，這8個(gè)化合物分別為魏察曼陀羅素B、魏察曼陀羅素G、?；衔?至8的結(jié)構(gòu)式如下

權(quán)利要求
1.一種洋金花總甾提取物，其特征在于該提取物包括至少一種下列化合物豆甾-4-烯-3，6-二醇、豆甾-5，28-二烯-3，24-二醇、麥角甾-5，25-二烯-3，24-二醇、魏察曼陀羅素B、魏察曼陀羅素G、枸杞物質(zhì)B、12-去氧魏察曼陀羅內(nèi)酯和withatatulin，并且該提取物中甾體類成分的含量為10-80％。
2.按權(quán)利要求1所述的洋金花總甾提取物，其特征在于該提取物中甾體類成分的含量為50-75％。
3.按權(quán)利要求1所述的洋金花總甾提取物，其特征在于該洋金花總甾提取物通過以下方法制備得到①提取稱取洋金花生藥，加入3-50倍重量的溶劑，溶劑為水、低級(jí)醇、丙酮或乙酸乙酯，或它們中的2種或2種以上混合溶劑；然后采用冷浸、超聲波、滲漉或加溫方法提取1-5次，合并提取液，除去有機(jī)溶劑，得到洋金花提取物；②樹脂分離向洋金花提取物中加入含水醇，最終調(diào)節(jié)成含醇量為0％-30％的溶液，用石油醚萃取此溶液0-6次，將非石油醚層溶液通過吸附性樹脂，以水洗脫水溶性物質(zhì)，以5-35％的乙醇洗脫非甾類物質(zhì)，再以35-95％的乙醇洗脫并收集洗脫液，得到含有甾類物質(zhì)的餾分，揮去乙醇得濃縮；③精制以正丁醇或乙酸乙酯萃取濃縮液1-6次，合并有機(jī)相，以pH8-14的堿水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相1-6次，以pH1-6的酸水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相至中性，回收有機(jī)溶劑后得到洋金花總甾提取物。
4.按權(quán)利要求1所述的洋金花總甾提取物，其特征在于該提取物通過以下方法制備得到①提取稱取洋金花生藥，加入3-50倍重量溶劑水、低級(jí)醇、丙酮或乙酸乙酯或它們的多種混合溶劑，采用冷浸、超聲波、滲漉或加溫方法提取1-5次，合并提取液，除去溶劑，得到洋金花提取物；②萃取洋金花提取物以pH8-14的堿水溶解，以石油醚萃取此堿水溶液0-6次，棄去石油醚層，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取堿水溶液1-6次，合并有機(jī)相，以pH8-14的堿水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相1-6次，以pH1-6的酸水洗滌有機(jī)相1-6次，以水洗滌有機(jī)相至中性，揮去有機(jī)相得到洋金花總甾提取物。
5.按權(quán)利要求3所述的洋金花總甾提取物制備方法，其特征在于該提取物的制備方法步驟③的精制為，將洋金花總甾提取物用有機(jī)溶劑溶解并與氧化鋁或活性炭混合，靜置10-100分鐘，過濾，用有機(jī)溶劑洗滌氧化鋁或活性炭，該有機(jī)溶劑為低級(jí)醇、含水低級(jí)醇、丙酮或乙酸乙酯或它們的2種或2種以上混合溶劑，揮去溶劑，得到洋金花總甾提取物的精制品。
6.按權(quán)利要求3所述的洋金花總甾提取物制備方法，其特征在于該提取物的制備方法步驟②所用吸附樹脂為非極性或弱極性大孔吸附樹脂D101、AB-8或HPD100。
7.一種按權(quán)利要求1所述的洋金花總甾提取物在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種洋金花總甾提取物及其制備方法，本發(fā)明以洋金花為原料，采用含水或不含水的有機(jī)溶劑為提取溶媒，常規(guī)方法提取，通過大孔樹脂或溶劑萃取方法分離得到洋金花總甾提取物；該提取物是以魏察曼陀羅素B、G等甾體類化合物為主的有效部位，甾體類成分含量10％－80％，特別是50－75％。該提取物能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，可用于抗腫瘤藥物的制備。
文檔編號(hào)C07J75/00GK1935215SQ20061011710
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者王曉川, 吳威巍, 王作鵬 申請(qǐng)人:卡南吉醫(yī)藥科技(上海)有限公司