本發(fā)明涉及一種化合物及其在治療白內(nèi)障中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：晶狀體是眼球屈光系統(tǒng)的重要組成部分，也是唯一具有調(diào)節(jié)能力的屈光間質(zhì)，晶狀體由晶體囊、晶體上皮、晶體纖維和懸韌帶組成。如果晶狀體由于各種原因造成其部分或全部混濁，則發(fā)生白內(nèi)障。白內(nèi)障會(huì)導(dǎo)致單眼或者雙眼的視力降低。通常白內(nèi)障發(fā)展緩慢，癥狀主要包括視力模糊、暈光、夜視能力降低，嚴(yán)重會(huì)致盲。視力的降低會(huì)嚴(yán)重的影響人們的日常生活，比如開車、閱讀，視力的降低也會(huì)導(dǎo)致心理疾病的產(chǎn)生。白內(nèi)障多發(fā)于40歲以上的人群，隨著且隨年齡增長(zhǎng)而增多，與多因素相關(guān)，如與老年人代謝緩慢，發(fā)生退行性病變有關(guān)，也有人認(rèn)為與日光長(zhǎng)期照射，內(nèi)分泌紊亂，代謝障礙等因素有關(guān)。外傷、藥物、放射性物質(zhì)、并發(fā)癥等也會(huì)引起后天性白內(nèi)障，另外，有一些先天性的白內(nèi)障患者，多在出生前后即已存在，有內(nèi)生性與外生性兩類，內(nèi)生性者與胎兒發(fā)育障礙有關(guān)，外生性者是母體或胎兒的全身病變對(duì)晶狀體造成損害所致。國(guó)際公認(rèn)的快速有效治療白內(nèi)障方法是手術(shù)治療，通過手術(shù)將患者渾濁的晶狀體取出，然后植入人工晶體。但總體而言手術(shù)治療費(fèi)用較高，對(duì)患者而言是很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)、人口老齡化的出現(xiàn)，這一難題更為突出，因此尋找有效、安全、廉價(jià)的藥物治療白內(nèi)障具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。晶狀體內(nèi)90％的蛋白是由晶狀體蛋白組成。其中α-、β-和γ-晶狀體蛋白是晶狀體內(nèi)最主要的可溶性蛋白。其中，α-晶狀體蛋白是由兩個(gè)亞基組成的二聚體，屬于小熱休克蛋白家族，它可以在不依賴atp的情況下有效的結(jié)合損傷的或者未能正確折疊的蛋白質(zhì)從而阻止這些蛋白的聚集。從白內(nèi)障患者的晶狀體中可以分離得到的很多不同種類的蛋白，其中有很多是以高分子量的蛋白聚集體形式存在。這些蛋白聚集體導(dǎo)致了整個(gè)白內(nèi)障晶狀體的渾濁遮光性。因此需要提供一種可以結(jié)合晶狀體蛋白的藥物以治療白內(nèi)障。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新具有新穎結(jié)構(gòu)的小分子化合物，該小分子化合物在抑制晶狀體細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集方面具有更好的活性，并且對(duì)正常晶狀體細(xì)胞沒有毒副作用。本發(fā)明首先提供式ⅰ所示化合物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽，式ⅰ中，環(huán)a為六元環(huán)或七元環(huán)，當(dāng)環(huán)a為六元環(huán)時(shí)，x不存在，當(dāng)環(huán)a為七元環(huán)時(shí)，x表示o或nh；3號(hào)碳原子與r1之間為單鍵或雙鍵，當(dāng)為單鍵時(shí)，r1選自如下基團(tuán)中任一種：當(dāng)為雙鍵時(shí)，r1選自如下基團(tuán)中任一種：7號(hào)碳原子、8號(hào)碳原子、9號(hào)碳原子和11號(hào)碳原子相鄰碳原子之間為單鍵或雙鍵；當(dāng)8號(hào)碳原子與9號(hào)碳原子之間為單鍵時(shí)，8號(hào)碳原子與9號(hào)碳原子之間存在環(huán)氧結(jié)構(gòu)或7號(hào)碳原子與8號(hào)碳原子之間為雙鍵或9號(hào)原子與11號(hào)碳原子之間為雙鍵；當(dāng)7號(hào)碳原子與8號(hào)碳原子之間為單鍵時(shí)，r2為h或2個(gè)r2形成羰基；當(dāng)7號(hào)碳原子與8號(hào)碳原子之間為雙鍵時(shí)，7號(hào)碳原子上連接一個(gè)r2，r2為h；當(dāng)9號(hào)碳原子與11號(hào)碳原子之間為單鍵時(shí)，r3為h或2個(gè)r3形成羰基；當(dāng)9號(hào)碳原子與11號(hào)碳原子之間為雙鍵時(shí)，11號(hào)碳原子上連接一個(gè)r3，r3為h；r4選自如下基團(tuán)中任一種：其中，r5和r6均為碳原子數(shù)為1-4的烷基；x”和x”’均選自f、cl、br和i；n為1或2。所述化合物的結(jié)構(gòu)式進(jìn)一步如式ⅱ所示，式ⅱ中，r1、r2、r3、r4和n的定義同式ⅰ中。所述化合物的結(jié)構(gòu)式具體如式ⅲ所示，式ⅲ中，r’4選自如下基團(tuán)中任一種：式ⅲ所示化合物具體如式ⅲ-1、式ⅲ-2、式ⅲ-3、式ⅲ-4、式ⅲ-5、式ⅲ-6、式ⅲ-7、式ⅲ-8或式ⅲ-9所示：所述化合物的結(jié)構(gòu)式具體如式ⅳ所示，式ⅳ中，r’1與碳原子之間為單鍵或雙鍵；當(dāng)為單鍵時(shí)，r’1選自如下基團(tuán)中任一種：當(dāng)為雙鍵時(shí)，r’1選自如下基團(tuán)中任一種：r”4選自如下基團(tuán)中任一種：式ⅳ所示化合物具體如式ⅳ-1、式ⅳ-2、式ⅳ-3、式ⅳ-4、式ⅳ-5、式ⅳ-6、式ⅳ-7、式ⅳ-8、式ⅳ-9、式ⅳ-10、式ⅳ-11、式ⅳ-12或式ⅳ-13所示：所述化合物的結(jié)構(gòu)式具體如式ⅴ所示，式ⅴ中，r”1與碳原子之間為單鍵或雙鍵；當(dāng)為單鍵時(shí)，r”1為-oh；當(dāng)為雙鍵時(shí)，r”1為式ⅴ所示化合物具體如式ⅴ-1或式ⅴ-2所示：所述化合物的結(jié)構(gòu)式具體如式ⅵ所示，所述化合物的結(jié)構(gòu)式進(jìn)一步如式ⅶ所示，式ⅶ中，x表示o或nh。式ⅶ所示化合物具體如式ⅶ-1或式ⅶ-2所示：本發(fā)明化合物可根據(jù)現(xiàn)有的常規(guī)方法進(jìn)行制備，如采用氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)和/或縮合反應(yīng)等常規(guī)反應(yīng)進(jìn)行。本發(fā)明所提供的化合物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽可用于治療白內(nèi)障。本發(fā)明提供的化合物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽可用于阻止、緩解或者逆轉(zhuǎn)晶狀體蛋白在細(xì)胞內(nèi)的聚集；在晶狀體細(xì)胞中，90％以上的蛋白組分是晶狀體蛋白(crystallin，cry)，包括α-、β-和γ-cry三個(gè)家族，而晶狀體蛋白發(fā)生突變后，會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的蛋白聚集，導(dǎo)致白內(nèi)障疾病，本發(fā)明將選取α-cry家族突變體αa-y118d、αb-r120g、β-cry家族突變體βb2-v187e、γ-cry家族突變體γc-g129c和γd-w43r為白內(nèi)障疾病的研究模型來檢測(cè)本發(fā)明化合物的效果?；钚猿煞譃楸景l(fā)明提供的化合物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽的治療白內(nèi)障的藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的具有新穎結(jié)構(gòu)的小分子，與現(xiàn)有的小分子(如c29，science,350,674)相比，在抑制細(xì)胞內(nèi)晶狀體蛋白突變導(dǎo)致的蛋白聚集具有更好的活性，且提高藥物的可被機(jī)體吸收性，并且對(duì)正常晶狀體細(xì)胞沒有毒副作用。附圖說明圖1為晶狀體蛋白突變體αbr120g在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊形成聚集小體的示意圖。圖2為本發(fā)明化合物對(duì)多種晶狀體蛋白突變體形成聚集體的效應(yīng)。圖3為本發(fā)明式ⅲ-6所示化合物對(duì)晶狀體蛋白突變體αbr120g聚集的半效應(yīng)濃度。圖4為本發(fā)明式ⅲ-6所示化合物細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、式ⅲ-1所示化合物的制備羊毛甾醇(50％，購(gòu)于tci，100mg)溶于二氯甲烷(30ml)，在冰浴下，m-cpba(間氯過氧苯甲酸)(85％，28mg)和nahco3(14mg)間隔3h分兩批加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，無水碳酸鈉干燥，然后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1，體積比)，得式ⅲ-1所示化合物(45mg)和式ⅲ-1’所示化合物(40mg)。式ⅲ-1’所示化合物：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.23-3.21(m,1h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.5,79.1,50.7,50.6,49.9,44.6,39.7,39.0,37.2,36.6,35.7,31.1,31.0,29.9,28.4,28.1,28.0,26.7,24.4,24.3,23.0,22.7,21.2,19.3,18.9,18.4,15.9,15.6.式ⅲ-1所示化合物：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.21(d,j＝8.0hz,1h),2.69-2.67(m,1h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.6,134.4,79.0,77.5,77.2,76.8,65.0,64.9,58.5,58.2,50.51,50.48,50.4,49.9,44.6,39.0,37.1,36.4,36.3,35.7,32.9,32.7,31.10.31.08,30.9,28.4,28.3,28.1,28.0,26.6,26.0,25.7,25.06,25.05,24.4,21.1,19.3,18.9,18.79,18.76,18.7.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例2、式ⅲ-2所示化合物的制備高碘酸鈉(135mg)加入到35ml的乙醚中，攪拌的條件下，式ⅲ-1所示化合物(283mg)加入到上述反應(yīng)液中，室溫下攪拌15min，水加入到反應(yīng)液中，有機(jī)層采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝15：1，體積比)，得式ⅲ-2所示化合物(120mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)9.76(s,1h),3.24-3.21(m,1h),2.46-2.35(m,2h),0.6(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)203.4,134.6,134.4,79.1,77.5,77.2,76.9,53.6,50.5,50.4,50.0,44.7,41.3,39.0,37.2,36.2,35.7,31.1,30.9,28.4,28.3,28.1,28.0,26.6,24.4,21.1,19.3,18.5,18.4,15.9,15.6.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例3、式ⅲ-3所示化合物的制備羊毛甾醇(50％，購(gòu)于tci，220mg)溶于thf/h2o(20ml/5ml)，nbs(54mg)加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)液在室溫下攪拌2h。反應(yīng)液加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得式ⅲ-3所示化合物(110mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.13-3.94(m,1h),3.25-3.21(m,1h),0.69(s,3h).經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例4、式ⅲ-4所示化合物的制備將40mg式ⅲ-2所示化合物，25mgnaoac，14mgnh2oh·hcl溶于5ml1,4-二氧六環(huán)-水(v/v，2：1)中，置于室溫下攪拌12h。tlc檢測(cè)其反應(yīng)完全，將反應(yīng)產(chǎn)物用飽和食鹽水洗滌，乙酸乙酯萃取。分離有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干。采用硅膠柱(v/v，乙酸乙酯：石油醚＝1：5)分離純化，得到式ⅲ-4所示化合物17mg。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.24(dd,j＝11.6hz,j＝4.4hz),0.88(s,3h),0.81(s,3h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)153.1,134.6,134.5,79.2,50.6,50.5,50.4,50.0,44.7,39.1,37.2,36.5,36.3,35.8,33.1,32.6,31.1,31.0,29.9,28.4,28.3,28.1,28.0,26.7,24.4,21.2,19.3,18.54,18.48,18.4,15.9,15.6.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例5、式ⅲ-5所示化合物的制備將40mg式ⅲ-2所示化合物，3ml二乙胺溶于二氯乙烷中攪拌1h后，于0℃下緩慢加入42mgnabh(oac)3?；謴?fù)至室溫并繼續(xù)攪拌12h。加入少許酸猝滅反應(yīng)后，用飽和碳酸氫鈉洗滌，乙酸乙酯萃取。分離有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干。采用硅膠柱(v/v，二氯甲烷：甲醇＝20:1)分離純化，得到式ⅲ-5所示化合物40mg。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.21(dd,j＝11.2hz,j＝3.6hz,1h),2.27-2.55(m,4h),0.79(s,3h),0.67(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.54.134.48,79.0,53.5,50.53,50.48,49.9,46.9,44.6,39.0,37.1,36.5,35.7,34.2,31.1,31.0,28.3,28.1,28.0,26.6,24.4,23.4,21.1,19.3,18.9,18.4,15.9,15.6,11.5.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例6、式ⅲ-6所示化合物的制備式ⅲ-3所示化合物(80mg)溶于無水thf(10ml)中，lialh4(38mg)加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)液加熱回流2h。冷卻到室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得式ⅲ-6所示化合物(40mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.25-3.22(m,1h),2.03-1.89(m,5h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.58,134.56,79.1,71.3,50.7,50.6,50.0,44.7,44.6,39.0,37.2,36.9,36.6,35.8,31.2,31.0,29.5,29.4,28.4,28.1,28.0,26.7,24.4,21.3,21.2,19.3,18.8,18.4,15.9,15.6.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例7、式ⅲ-7所示化合物的制備將50mg式ⅲ-2所示化合物溶于無水5mlthf中。加入4ml4m異丙基溴化鎂的四氫呋喃溶液。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后，加水終止反應(yīng)，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得式ⅲ-7所示化合物17mg。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.33-3.32(m,1h),3.23(dd,j＝11.6hz,j＝4.8hz,1h),0.81(s,3h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.54,134.51,79.1,50.6,50.5,44.6,39.0,37.2,35.7,31.1,31.0,28.1,28.0,27.0,26.6,24.4,22.8,21.1,19.3,19.2,19.0,18.4,16.8,15.9,15.6,14.3.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例8、式ⅲ-8所示化合物的制備式ⅲ-6所示化合物(50mg)于二氯甲烷(30ml)，在冰浴下，m-cpba(85％，28mg)和nahco3(14mg)間隔3h分兩批加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，無水碳酸鈉干燥，然后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得式ⅴ-1所示化合物(45mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.21-3.19(m,1h),0.76-0.75(m,6h)13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)78.6,71.2,70.8,68.3,49.0,48.5,44.5,43.7,41.9,38.6,38.0,36.7,36.4,33.0,29.42,29.36,28.6,28.4,27.3,27.0,23.6,21.6,21.2,20.1,19.1,17.1,16.6,16.4,15.2.將30mg式ⅴ-1所示化合物溶于3mlthf中，加入100μl40％的氫氟酸溶液，室溫下攪拌4天。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后用飽和碳酸氫鈉溶液洗，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：3)分離得到27mg式ⅲ-8所示化合物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.47(s,br,1h),5.32(s,br,1h),3.24(dd,j＝11.2hz,j＝4.4hz,1h),0.56(s,3h)13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)146.0,142.8,120.3,116.5,79.1,71.2,51.2,50.5,49.2,44.5,43.9,38.8,38.0,37.5,36.8,36.4,35.8,31.6,29.5,29.4,28.3,28.1,27.9,25.7,23.1,22.9,21.3,18.6,15.9,15.8.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例9、式ⅲ-9所示化合物的制備式ⅲ-6所示化合物(44mg)溶于無水二氯甲烷中，冰浴條件下下，20μldast加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)1h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得式ⅲ-9所示化合物(10mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.23(dd,j＝11.6hz,j＝4.4hz,1h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)150.5,140.8,122.1,116.4,96.9,95.3,59.1,50.4,50.35,45.5,44.8,42.1,41.9,37.2,36.7,36.6,36.3,30.5,29.8,29.6,28.2,27.0,26.9,26.8,26.6,24.5,24.0,23.3,23.2,22.9,20.9,18.9,16.0,15.9.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例10、式ⅳ-1所示化合物的制備式ⅲ-1所示化合物(80mg)，醋酸酐(300ul)，dmap(2mg)，吡啶(1ml)和二氯甲烷(10ml)加入到反應(yīng)瓶中。室溫?cái)嚢?h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯20：1)，得式ⅳ-1所示化合物(80mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.51-4.47(m,1h),2.68(t,j＝6.4hz,1h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)171.2,134.5,134.4,81.0,77.5,77.2,76.8,65.1,64.9,58.5,58.3,50.6,50.5,50.4,49.9,44.6,37.9,37.0,36.5,36.3,35.4,32.9,32.7,31.07,31.05,30.9,28.4,28.3,28.0,26.5,26.1,25.7,25.09,25.07,24.4,24.3,21.5,21.1,19.3,18.9,18.8,18.7,18.2,16.7.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例11、式ⅳ-2所示化合物的制備羊毛甾醇(80mg)、醋酸酐(300ul)、dmap(2mg)、吡啶(1ml)和二氯甲烷(10ml)加入到反應(yīng)瓶中。室溫?cái)嚢?h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯20：1)，得式ⅳ-2所示化合物(80mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.12-5.08(m,1h),4.52-4.48(m,1h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)171.0,134.7,134.5,131.0,125.4,81.1,77.5,77.2,76.9,50.7,50.6,50.0,44.7,38.0,37.1,36.5,36.4,35.5,31.2,31.0,28.4,28.1,26.6,25.8,25.1,24.4,24.37,21.4,21.2,19.3,18.8,18.3,17.8,16.7,15.9.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例12、式ⅳ-3所示化合物的制備式iv-1(500mg)溶解到異丙醇中，水(5ml)和次磷酸(0.9ml，50％水溶液)加入到上述溶液中，反應(yīng)液加熱回流3小時(shí)，用水稀釋，過濾得白色固體。產(chǎn)品用硅膠柱分離(二氯甲烷：乙酸乙酯2：1)，得式ⅳ-3所示化合物(450mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.51-4.47(m,1h),3.36-3.27(m,1h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)171.2,134.6,134.4,81.1,79.8,78.9,73.4,73.3,50.7,50.6,49.9,44.6,37.9,37.0,36.9,36.4,35.4,33.7,33.2,31.1,30.9,28.8,28.5,28.4,28.3,28.0,26.7,26.5,24.4,24.3,23.4,23.3,21.5,21.1,19.3,19.0,18.7,18.2,16.7,15.9.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例13、式ⅳ-4所示化合物的制備羊毛甾醇(100mg)，pcc(100mg)和naoac(10mg)溶解到二氯甲烷中，室溫?cái)嚢?h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯20：1)，得式ⅳ-4所示化合物(90mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)5.11-5.08(m,1h),2.62-2.54(m,1h),2.43-2.37(m,1h),0.71(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)218.0,135.5,133.2,131.1,125.3,51.3,50.5,50.0,47.5,44.6,37.0,36.44,36.37,36.2,34.7,31.1,31.0,28.3,26.5,26.3,25.9,25.0,24.4,21.4,21.2,19.6,18.8,18.75,17.8,16.0.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例14、式ⅳ-5所示化合物的制備式ⅳ-4所示化合物(100mg)，meonh2·hcl(56mg)，naoac(150mg)溶于乙醇(10ml)，反應(yīng)液60攝氏度加熱攪拌3h。反應(yīng)液冷卻到室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1，體積比)，得式ⅳ-5所示化合物(95mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)9.11(s,br,1h),3.13(d,j＝3.6hz,1h),0.90(d,j＝6hz,3h),0.85(s,3h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)167.2,134.9,133.9,71.3,51.5,50.6,50.0,44.6,44.5,40.5,37.3,36.8,36.6,35.8,31.1,31.0,29.5,29.3,28.3,27.0,26.5,24.4,23.1,21.3,21.2,19.1,18.9,18.8,17.7,16.0.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例15、式ⅳ-6所示化合物的制備式ⅳ-4所示化合物(100mg)，honh2·hcl(48mg)，naoac(150mg)溶于乙醇(10ml)，反應(yīng)液60攝氏度加熱攪拌3h。反應(yīng)液冷卻到室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯10：1)，得式1所示化合物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)9.14(s,1h),5.10(s,1h),3.14-3.10(m,1h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)167.2,135.0,134.0,131.0,125.4,51.5,50.5,50.0,44.6,40.5,37.3,36.5,36.4,35.8,31.1,31.0,28.3,27.1,26.5,25.9,25.1,24.4,23.2,21.2,19.1,18.9,18.8,17.8,17.7,16.0式1所示化合物(50mg)溶于無水乙醚中，lialh4(50mg)加入到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)3h。慢慢加入水來終止反應(yīng)。用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(二氯甲烷：甲醇10：1)，得式ⅳ-6所示化合物(20mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.25(s,2h),5.10(m,1h),2.90(d,j＝10.0hz,1h),0.68(s,3h).經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例16、式ⅳ-7所示化合物的制備式ⅲ-6所示化合物(100mg)，pcc(100mg)和naoac(10mg)溶解到二氯甲烷中，室溫?cái)嚢?h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯20：1)，得式ⅳ-7所示化合物(90mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)2.56-2.40(m,2h),0.88(s,6h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)217.9,135.47,133.28,71.17,51.4,50.6,50.0,47.5,44.6,44.5,37.0,36.9,36.6,36.2,34.7,31.1,31.0,29.5,29.4,28.3,26.5,26.3,24.4,21.4,21.2,19.6,18.8,16.0.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例17、式ⅳ-8所示化合物的制備式ⅳ-7所示化合物(100mg)，honh2·hcl(48mg)，naoac(150mg)溶于乙醇(10ml)，反應(yīng)液60攝氏度加熱攪拌3h。反應(yīng)液冷卻到室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1，體積比)，得式ⅳ-8所示化合物(95mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)9.11(s,br,1h),3.14-3.10(m,1h),0.91-0.89(m,6h),0.85(s,3h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)167.2,134.9,133.9,71.3,51.5,50.6,50.0,44.6,44.5,40.5,37.3,36.8,36.6,35.8,31.1,31.0,29.5,29.3,28.3,27.0,26.5,24.4,23.2,21.3,21.2,19.1,18.9,18.8,17.7,15.9.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例18、式ⅳ-9所示化合物的制備將40mg式ⅲ-6所示化合物溶于4ml吡啶中，加入12mg丁二酸酐和11mgdmap。置于80℃下攪拌3h。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后用10％的鹽酸洗去吡啶，并用乙酸乙酯萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1，體積比)分離得到31mg式ⅳ-9所示化合物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)4.52(dd,j＝11.6hz,j＝4.8hz,1h),2.69-2.63(m,4h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)172.0,170.7,134.6,134.3,81.6,71.4,60.6,50.6,49.9,44.6,44.5,38.0,37.0,36.8,36.6,35.3,31.1,30.9,29.5,29.4,29.3,29.1,28.5,28.4,28.0,26.5,24.4,24.2,21.3.21.2,21.1,19.3,18.8,18.2,16.7.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例19、式ⅳ-10所示化合物的制備式1所示化合物(50mg)溶于無水乙醚中，lialh4(50mg)加入到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)3h。慢慢加入水來終止反應(yīng)。用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(二氯甲烷：甲醇：三乙胺＝10：1：0.1，體積比)，得式ⅳ-11所示化合物(20mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)2.68(s,1h),2.46-2.43(m,1h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.6,134.2,70.1,68.4,59.7,51.1,50.9,50.5,49.7,44.3,43.9,38.3,37.04,36.97,36.9,36.7,36.4,35.8,35.6,31.0,30.9,30.5,27.9,27.7,27.0,26.3,25.4,25.2,23.3,20.69,20.65,18.4,18.13,18.07.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例20、式ⅳ-11所示化合物的制備式ⅳ-7所示化合物(100mg)、meonh2·hcl(56mg)、naoac(150mg)溶于乙醇(10ml)，反應(yīng)液60攝氏度加熱攪拌3h。反應(yīng)液冷卻到室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯10：1)，得式ⅳ-12所示化合物(95mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.81(s,3h),3.00(d,j＝14.4hz,1h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)166.2,134.9,134.0,77.5,77.2,76.8,71.3,61.2,51.6,50.7,50.0,44.62,44.56,40.2,37.2,36.9,36.6,35.8,31.1,31.0,29.5,29.4,28.4,27.2,26.5,24.4,23.4,21.3,21.2,19.1,18.8,18.3,16.0.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例21、式ⅳ-12和式ⅳ-13所示化合物的制備式ⅲ-6所示化合物(90mg)溶于無水thf(10ml)中，nah(5個(gè)當(dāng)量)和碘甲烷(5個(gè)當(dāng)量)加入到反應(yīng)液中。室溫?cái)嚢?2h。反應(yīng)完畢后，逐滴加入水來終止反應(yīng)。二氯甲烷加入到反應(yīng)液中，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝30：1)得式ⅳ-13所示化合物(30mg)和式ⅳ-14所示化合物(30mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.36(s,3h),3.69-3.65(m,1h),0.69(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.7,134.5,88.8,77.5,77.2,76.8,74.8,57.7,51.1,50.7,50.0,49.2,44.6,40.5,39.0,37.2,37.0,36.6,35.6,31.2,31.0,28.4,28.1,26.6,25.2,24.4,22.8,21.2,20.7,19.3,18.9,18.3,16.3,15.9.1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.37(s,3h),3.17(s,3h),2.69-2.65(m,1h),0.68(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)134.7,134.5,88.8,71.3,57.7,51.1,50.7,50.0,44.7,44.6,39.0,37.2,36.9,36.6,35.7,31.2,31.0,29.5,29.4,28.4,28.1,26.6,24.4,22.8,21.3,21.2,19.3,18.8,18.3,16.3,15.9.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例22、式ⅴ-1所示化合物的制備式ⅲ-6所示化合物(50mg)溶于二氯甲烷(30ml)，在冰浴下，m-cpba(85％，28mg)和nahco3(14mg)間隔3h分兩批加入到上述溶液中，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，無水碳酸鈉干燥，然后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得式ⅴ-1所示化合物(45mg)1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.21-3.19(m,1h),0.76-0.75(m,6h)13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)78.6,71.2,70.8,68.3,49.0,48.5,44.5,43.7,41.9,38.6,38.0,36.7,36.4,33.0,29.42,29.36,28.6,28.4,27.3,27.0,23.6,21.6,21.2,20.1,19.1,17.1,16.6,16.4,15.2.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例23、式ⅴ-2所示化合物的制備將37mg式ⅴ-1所示化合物溶于3ml二氯甲烷，加入37mgpcc和4mgnaoac，室溫下攪拌2h。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后水洗，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離。將分離產(chǎn)物溶于乙醇，加入12mg鹽酸羥胺和20mg醋酸鈉。60℃攪拌2h。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后水洗，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去大部分溶劑后，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱(乙酸乙酯：石油醚＝5：1，體積比)分離得到21mg式ⅴ-2所示化合物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.14-3.10(m,1h),1.00(d,j＝6hz,3h),0.85(s,3h),0.70(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)166.4,71.3,70.7,68.3,49.0,48.5,44.5,43.7,43.1,40.0,38.1,36.7,36.4,32.9,32.1,29.44,29.38,28.6,27.6,26.9,23.9,22.8,21.7,21.2,20.1,19.1,17.4,17.2,17.0,16.4.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例24、式ⅵ所示化合物的制備5h(30mg)、rucl3·3h2o(1mg)和tbhp(indecane，5-6m)加入到2ml的環(huán)己烷中。室溫反應(yīng)6h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，體積比)，得到的化合物溶于10％koh的乙醇溶液中，回流3h，冷卻至室溫，加水稀釋，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯＝3：1，體積比，得式ⅵ所示化合物c(10mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)3.29-3.25(m,1h),2.89(d,j＝14.0hz,1h),2.75(d,j＝14.0hz,1h),2.60(d,j＝14.0hz,1h),2.50-2.44(m,2h),0.80(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)202.6,202.4,151.9,150.8,77.8,71.2,51.8,50.3,49.3,49.1,47.5,44.4,39.9,39.0,36.6,36.3,34.2,32.3,29.5,29.4,28.0,27.8,27.5,26.0,21.1,18.7,17.7,17.0,15.6.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例25、式ⅶ-1所示化合物的制備式ⅳ-8所示化合物(50mg)溶于二氯甲烷/三氟乙酸(1ml/1ml)的混合溶劑中，室溫反應(yīng)2h。加水稀釋，用二氯甲烷萃取。飽和碳酸氫鈉洗滌。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯30：1)，得式ⅶ-1所示化合物5f(20mg)。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.72(s,1h),3.12(d,j＝15.2hz,1h),2.19-2.10(m,1h),0.72(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)167.3,135.0,134.0,89.5,51.5,50.6,50.0,44.6,40.9,40.5,37.3,36.43,36.38,35.8,31.1,31.0,28.3,27.1,26.5,25.8,25.7,24.4,23.2,21.2,20.6,19.1,18.9,18.7,17.7,16.0.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。實(shí)施例26、式ⅶ-2所示化合物的制備將66mg式ⅳ-7所示化合物溶于5ml二氯甲烷中，加入80mgm-cpba(純度大于80％)和24mgnahco3。室溫下攪拌12h。tlc檢測(cè)反應(yīng)完成后水洗，用二氯甲烷萃取。所得有機(jī)相采用無水硫酸鈉干燥，然后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，所得產(chǎn)品采用硅膠柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，體積比)分離得到53mg式ⅶ-2所示化合物。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)2.27(dd,j＝12.2hz,j＝3.4hz,1h),0.87(s,6h),0.74(s,3h)；13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ(ppm)175.0,85.9,71.5,71.2,69.8,49.3,48.4,44.4,44.1,43.4,40.5,36.6,36.3,33.1,32.4,32.3,31.8,29.4,29.3,28.5,26.9,25.6,24.9,22.0,21.6,21.2,20.1,19.1,19.0,16.5.經(jīng)表征，所制備的化合物結(jié)構(gòu)正確。下述實(shí)施例27-28所用的部分試驗(yàn)材料的來源如下：本測(cè)試?yán)玫降牟糠謱?shí)驗(yàn)材料來源：高純度羊毛甾醇(l5768)、膽固醇(c3045)、二甲基亞砜(d8418)、多聚甲醛、tritonx-100和np-40(nonidetp40)購(gòu)買自sigma公司。dapi-fluoromount-g熒光封片劑(0100-20)購(gòu)買自southernbiotech(sba)。anti-p62抗體(ab56416)購(gòu)買自abcam公司。羊毛甾醇粗品購(gòu)買自tci(c0427)，純度>50.0％(gc)。細(xì)胞培養(yǎng)基、抗生素、轉(zhuǎn)染試劑lipofectaminetm2000均購(gòu)買自invitrogen公司。cellcountingkit-8(ck04-500)購(gòu)買自日本同仁化學(xué)。其他未注明具體來源的化學(xué)試劑均為分析純。晶狀體蛋白αa-y118d、αb-r120g、βb2-v187e、γc-g129c和γd-w43r突變體為本研究組克隆構(gòu)建，具體過程如下：將dna分子1插入pegfp-n1載體(clontech)的xhoⅰ和bamhⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒1。dna分子1：將序列表的序列1所示的dna分子的第354位核苷酸由t突變?yōu)間(相應(yīng)的第118位氨基酸由y突變?yōu)閐)得到的dna分子。序列表的序列1所示的dna分子為cry-αa的開放閱讀框。將dna分子2插入pegfp-n1載體(clontech)的xhoⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒2。dna分子2：將序列表的序列2所示的dna分子的第360位核苷酸由a突變?yōu)間(相應(yīng)的第120位氨基酸由r突變?yōu)間)得到的dna分子。序列表的序列2所示的dna分子為cry-αb的開放閱讀框。將dna分子3插入pegfp-n1載體(clontech)的xhoⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒3。dna分子3：將序列表的序列3所示的dna分子的第562位核苷酸由t突變?yōu)閍(相應(yīng)的第187位氨基酸由v突變?yōu)閑)得到的dna分子。序列表的序列3所示的dna分子為cry-βb2的開放閱讀框。將dna分子4插入pegfp-n1載體(clontech)的xhoⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒4。dna分子4：將序列表的序列4所示的dna分子的第387位核苷酸由g突變?yōu)閠(相應(yīng)的第129位氨基酸由g突變?yōu)閏)得到的dna分子。序列表的序列3所示的dna分子為cry-γc的開放閱讀框。將dna分子5插入pegfp-n1載體(clontech)的xhoⅰ和hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒5。dna分子5：將序列表的序列5所示的dna分子的第129位核苷酸由t突變?yōu)閏(相應(yīng)的第43位氨基酸由w突變?yōu)閞)得到的dna分子。序列表的序列3所示的dna分子為cry-γd的開放閱讀框。hela(ccl-2tm)，人類晶狀體上皮細(xì)胞hle-b-3(crl-11421tm)均購(gòu)買自atcc細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)條件按atcc公司所建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明測(cè)試?yán)形醋⒚骶唧w條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例27、本發(fā)明化合物對(duì)晶狀體蛋白突變體在細(xì)胞內(nèi)聚集的影響本實(shí)施例用以下方法來測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)晶狀體蛋白αa-y118d、αb-r120g、βb2-v187e、γc-g129c和γd-w43r突變體在hela細(xì)胞內(nèi)聚集情況的影響。測(cè)試中以溶劑dmso為空白對(duì)照，lanosterol(羊毛甾醇)為陽性對(duì)照，cholesterol(膽固醇)為陰性對(duì)照，并測(cè)試了現(xiàn)有化合物c29，作為本發(fā)明化合物的對(duì)照。具體方法如下：(1)以晶狀體蛋白αb-r120g突變體為研究模型研究本發(fā)明化合物的性能晶狀體蛋白αb-r120g突變體在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成顯微鏡下可見的聚集小體，如圖1所示，其形成聚集小體的形態(tài)均一，聚集比例穩(wěn)定，是研究化學(xué)藥物緩解蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的理想模型。因此，本發(fā)明首先采用晶狀體蛋白αb-r120g突變體為研究模型篩選有效的化合物。具體實(shí)驗(yàn)方案如下：將狀態(tài)良好的hela細(xì)胞接種到預(yù)先已鋪好細(xì)胞爬片的12孔板中，細(xì)胞密度40％～50％；培養(yǎng)24h左右，細(xì)胞密度80％左右，即可以進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體操作按照invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑lipofectaminetm2000所建議方案進(jìn)行；轉(zhuǎn)染4h后，換成dmem新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16h，這時(shí)晶狀體蛋白αb-r120g突變體在細(xì)胞內(nèi)已大量表達(dá)，形成一定比例的聚集小體；將細(xì)胞培養(yǎng)基換做opti-mem，并加入本發(fā)明化合物，至終濃度為4um；培養(yǎng)4h后，換成dmem新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)4h；進(jìn)行免疫熒光標(biāo)片的制備：pbs洗細(xì)胞爬片3遍，4％多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30分鐘，pbs洗細(xì)胞爬片3遍，0.4％tritonx-100室溫孵育細(xì)胞爬片15分鐘，pbs洗細(xì)胞爬片3遍，4％山羊血清室溫封閉40分鐘，p62抗體室溫孵育1小時(shí)，pbs洗細(xì)胞爬片3遍，相應(yīng)來源的熒光二抗室溫孵育40分鐘，pbs洗細(xì)胞爬片3遍，用dapi-fluoromount-g熒光封片劑封片，室溫避光放置1小時(shí)左右；應(yīng)用zeiss710三通道顯微鏡進(jìn)行觀察，采取單盲統(tǒng)計(jì)細(xì)胞內(nèi)的聚集情況，分析本發(fā)明化合物的藥效。所有樣品設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次重復(fù)，通過上述方法統(tǒng)計(jì)分析本發(fā)明化合物對(duì)晶狀體蛋白αb-r120g突變體在hela細(xì)胞內(nèi)聚集情況，結(jié)果如表1中所示。表1中數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明化合物對(duì)對(duì)晶狀體蛋白αb-r120g突變體在hela細(xì)胞內(nèi)形成的聚集現(xiàn)象具有緩解作用，尤其是式ⅲ-3所示化合物、式ⅲ-6所示化合物式、ⅲ-8所示化合物；式ⅳ-1所示化合物、式ⅳ-7所示化合物和式ⅳ-12所示化合物對(duì)晶狀體蛋白αb-r120g突變體在hela細(xì)胞內(nèi)形成的聚集現(xiàn)象具有明顯的緩解作用表1本發(fā)明化合物對(duì)晶狀體蛋白αb-r120g突變體在細(xì)胞內(nèi)聚集影響的統(tǒng)計(jì)化合物聚集比例化合物聚集比例化合物聚集比例dmso73.8±4.0式ⅳ-134.2±4.0式ⅴ-144.7±16.1lanosterol47.7±4.9式ⅳ-247.6±10.3式ⅴ-272.2±7.7cholesterol73.7±5.0式ⅳ-361.0±8.9式ⅵ55.5±10.2c2935.9±6.1式ⅳ-467.7±5.7式ⅶ-156.0±7.5式ⅲ‐153.8±7.6式ⅳ-547.3±9.8式ⅶ-243.6±5.9式ⅲ‐246.2±7.7式ⅳ-644.2±8.3式ⅲ-340.2±7.7式ⅳ-741.6±13.4式ⅲ-446.3±6.5式ⅳ-856.6±10.5式ⅲ-565.9±9.0式ⅳ-951.8±9.3式ⅲ-632.2±5.9式ⅳ-1171.6±4.0式ⅲ-748.4±9.3式ⅳ-1140.9±8.2式ⅲ-832.6±3.4式ⅳ-1267.6±3.2式ⅲ-959.0±5.8式ⅳ-1360.6±4.1(2)多種晶狀體蛋白突變體中驗(yàn)證本發(fā)明化合物的有效性。晶狀體內(nèi)的蛋白質(zhì)突變后發(fā)生錯(cuò)誤折疊，大多都會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障疾病。因此，在多種晶狀體蛋白突變體中驗(yàn)證本發(fā)明化合物的藥效是否具有普遍效應(yīng)對(duì)白內(nèi)障疾病的治療具有重要的意義。除αbr120g突變體外，本發(fā)明選用了晶狀體蛋白αa-y118d、βb2-v187e、γc-g129c和γd-w43r突變體對(duì)初步篩選有效的藥物做進(jìn)一步驗(yàn)證。具體方案同藥物篩選的過程。通過進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果表明，本發(fā)明化合物式ⅲ-6和式ⅳ-1在多種晶狀體蛋白突變體形成聚集的細(xì)胞模型中都具有明顯的效果，如圖2所示。(3)初步標(biāo)定本發(fā)明物的藥效本本發(fā)明初步以晶狀體蛋白αb-r120g突變體為研究模型，標(biāo)定本發(fā)明式ⅲ-6所示化合物的半效應(yīng)濃度ec50值，如圖3所示，結(jié)果顯示式ⅲ-6所示化合物的藥效要比天然化合物羊毛甾醇有著數(shù)量級(jí)上的提升，白內(nèi)障疾病的藥物治療具有巨大的潛力。實(shí)施例29、本發(fā)明化合物細(xì)胞毒性的檢測(cè)安全有效的藥物是本發(fā)明的研究原則，本發(fā)明將進(jìn)一步檢測(cè)本發(fā)明式ⅲ-6所示化合物對(duì)細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性。測(cè)試設(shè)立1個(gè)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體的hle-b3細(xì)胞；5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染晶狀體蛋白αa-y118d、αb-r120g、βb2-v187e、γc-g129c和γd-w43r突變體的hle-b3細(xì)胞，模擬不同晶狀體蛋白突變導(dǎo)致的白內(nèi)障疾病。用以下方法檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)不同細(xì)胞株的細(xì)胞毒性：將狀態(tài)良好的hle-b3細(xì)胞接種到12孔板中，細(xì)胞密度40％～50％；培養(yǎng)24h左右，細(xì)胞密度80％左右，即可以進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染晶狀體蛋白αa-y118d、αb-r120g、βb2-v187e、γc-g129c和γd-w43r突變體，及一個(gè)空載對(duì)照組。具體操作按照invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑lipofectaminetm2000所建議方案進(jìn)行；轉(zhuǎn)染4h后，換成dmem新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16h，這時(shí)晶狀體蛋白突變體在細(xì)胞內(nèi)已大量表達(dá)；用0.25％胰酶(edta)消化吹散后，接種到96孔板，每孔2000細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；將細(xì)胞培養(yǎng)基換做opti-mem，并加入本發(fā)明化合物1g，設(shè)定兩個(gè)濃度梯度，終濃度為5um或50nm，孵育12小時(shí)；加入10μlckk-8，孵育1小時(shí)，450nm測(cè)吸收值。所有樣品設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次重復(fù)，通過上述方法統(tǒng)計(jì)分析本發(fā)明式ⅲ-6所示化合物對(duì)正常晶狀體上皮細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染各種晶狀體蛋白突變體的細(xì)胞株均不存在細(xì)胞毒性，反而在一定程度上提高了細(xì)胞活力，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)前第1頁(yè)12