本發(fā)明涉及試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其是豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因sybrgreeni熒光定量pcr診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

致病性大腸桿菌是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌，容易引起人和動物不同病型疾病，廣泛存在于生活環(huán)境中，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，而且還嚴(yán)重威脅著人類健康。目前，治療致病性大腸桿菌病菌，主要采用的是抗生素，抗生素的大量濫用，也使得大腸桿菌的耐藥菌株逐漸增多。尤其是近年來氟苯尼考作為廣譜抗菌藥被大量濫用，大腸桿菌對氟苯尼考耐藥性日益嚴(yán)重。

為此，也有研究者對大腸桿菌耐藥性以及氟苯尼考耐藥基因、機制以及同源性等進(jìn)行了研究與分析，如李穎等《大腸桿菌耐藥性及氟苯尼考耐藥基因flor的研究》，曾蕓等《大腸桿菌o157∶h7對氟苯尼考耐藥機制的初步研究》，劉靜等《保定地區(qū)不同動物源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因flor的同源性分析》等等，但是，現(xiàn)有技術(shù)中，并未存在對大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因提供快速準(zhǔn)確診斷的pcr診斷試劑盒，使得對大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的診斷和檢測依然存在著操作繁雜、敏感性低，費時費力等缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因sybrgreeni熒光定量pcr診斷試劑盒。

具體是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：

豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因sybrgreeni熒光定量pcr診斷試劑盒，包括40μl混合引物、250μlpremixextaq、20μlroxreferencedye、100μldl2000、500μlrnasefreedh2o、20μl陽性對照、20μl陰性對照；其中，混合引物包括上游引物和下游引物，上游引物為5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物為5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`。

所述的陰性對照為超純水。

所述的陽性對照為pmd-18t-flor陽性質(zhì)粒。

所述的試劑盒，在-20℃下保存≤12個月。

所述的混合引物，濃度為10μmol/l。

具體本發(fā)明創(chuàng)造在研究過程中，是通過如下試驗進(jìn)行的：

一、材料與方法

1、材料

1.1實驗菌株

大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株；

以上菌株均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所獸用中草藥研究室保存。

1.2主要試劑以及儀器

2×taqpcrmastermix、goldview、1xtae、dl2000、dh5α、pmd-18t、細(xì)菌的dna快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；sybrgreeni熒光定量pcr酶(roxreferencedye)、rnasefreedh2o等購自寶生物(大連)工程有限公司；熒光定量pcr儀為eppendorfmastercyclereprealplex4實時熒光定量pcr儀。

2、實驗方法

2.1引物設(shè)計

根據(jù)genbank中flor基因設(shè)計1對特異性引物，用于擴增目的的基因片段，引物序列為：上游引物：

5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物:5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`，該引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.2dna提取

將大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株中的dna提取參照細(xì)菌dna快速提取試劑盒說明書進(jìn)行，將提取的dna在-20℃保存。

2.3pmd-18t-flor陽性標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

2.3.1熒光定量pcr擴增

pcr擴增在25μl體系中進(jìn)行，上下游引物各1μl(10μmol/l)、2×taqpcrmastermix12.5μl、roxreferencedye0.5μl、模板1μl，加rnasefreedh2o至25μl，反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min；取5μlpcr擴增產(chǎn)物于15g/l瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

2.3.2pmd-18t-flor陽性標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

將擴增的pcr產(chǎn)物，與pmd-18-克隆載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞dh5α，重組質(zhì)粒命名為pmd-18t-flor，同時送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將重組質(zhì)粒的濃度和純度進(jìn)行測定后，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋。

2.3.3熒光定量pcr擴增條件優(yōu)化

熒光定量pcr條件，包括引物濃度(5、10、20μmol/l)，退火溫度(50℃、55℃、60℃)，roxreferencedye的用量(0.5μl、1μl)進(jìn)行優(yōu)化以確定熒光定量pcr最佳條件，同時，以rnasefreedh2o作為空白對照，在25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行。熒光定量pcr反應(yīng)程序為：94℃10s；94℃5s、(50℃、55℃、60℃)退火10s、72℃10s，40個循環(huán)。取5μlpcr擴增產(chǎn)物于15g/l瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

2.3.4熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將重組質(zhì)粒的濃度和純度進(jìn)行測定后，計算dna拷貝數(shù)，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋。以優(yōu)化好的的條件進(jìn)行擴增，每個稀釋倍數(shù)3個重復(fù)，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4熒光定量pcr敏感性試驗

將重組質(zhì)粒計算dna拷貝數(shù)后，10倍稀釋后分別進(jìn)行熒光定量pcr，每個稀釋倍數(shù)3個重復(fù)，以確定熒光定量pcr敏感性。

2.5熒光定量pcr特異性試驗

以大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株dna進(jìn)行熒光定量pcr，每個樣品3個重復(fù)，以確定熒光定量pcr特異性。

2.6熒光定量pcr重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的熒光定量pcr方法重復(fù)檢測大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株樣品3次，以建立的熒光定量pcr重復(fù)的穩(wěn)定性。

2.7試劑盒組裝與保存期限檢測

2.7.1試劑盒組成

應(yīng)用建立的sybrgreeni熒光定量pcr方法組裝成試劑盒，包括：dl2000、premixextaq、roxreferencedye、混合引物、rnasefreedh2o、陽性對照、陰性對照。

2.7.2保存期限檢測

將試劑盒保存于4℃和-20℃，同時3個月、6個月、12個月，對陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，觀察試劑盒的穩(wěn)定性。

2.8熒光定量pcr試劑盒對臨床樣品進(jìn)行相關(guān)性分析

對貴州省幾個生豬養(yǎng)殖場分離得到的156株致病性大腸桿菌，采用傳統(tǒng)的藥敏試驗和試劑盒進(jìn)行氟苯尼考耐藥性分析，分析大腸桿菌氟苯尼考耐藥表型和耐藥基因的相關(guān)性。

二、試驗結(jié)果

1、熒光定量pcr擴增產(chǎn)物的鑒定

對大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株dna進(jìn)行pcr擴增，擴增出148bp目的片段，無非特異性擴增，見圖1。將pcr產(chǎn)物測序結(jié)果與genbank中的flor基因序列比對，相似度為98.4％～100％。

2、熒光定量pcr條件

在25μl反應(yīng)體系中(引物2μl、premixextaq12.5μl、roxreferencedye0.5μl、模板1μl，超純水補齊25μl)最佳的熒光定量pcr條件為：引物濃度10μmol/l、退火溫度55℃能出現(xiàn)最高的熒光值、最小的ct值，且熔解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性擴增峰。

3、熒光定量pcr反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷貝/μl，4種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴增反應(yīng)，每個濃度重復(fù)3次，從而建立熒光定量pcr反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為ct＝-3.670×lgcopies+22.59(r2＝0.999)，見圖2。

4.熒光定量pcr熔解曲線分析

在sybrgreeni熒光定量pcr反應(yīng)程序完成后，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析擴增產(chǎn)物的溶解溫度tm為88.8℃～89.2℃，沒有引物二聚體和非特異性擴增峰出現(xiàn)，見圖3。

5.熒光定量pcr敏感性試驗

以1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷貝/μl，6種不同濃度重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量pcr擴增，每個濃度重復(fù)3次，結(jié)果其靈敏度為1.0×10¹拷貝/μl，見圖4。

6.熒光定量pcr特異性試驗

大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株、大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株dna進(jìn)行熒光定量pcr，以研究建立的熒光定量pcr診斷方法的特異性，結(jié)果大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株為陽性，而大腸桿菌磺胺類耐藥菌株、大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株dna為陰性，見圖5。

7.重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的方法重復(fù)檢測大腸桿菌flor基因陽性菌株3次，結(jié)果擴增曲線重復(fù)性較好。

8.臨床細(xì)菌的耐藥性與耐藥基因的檢測

應(yīng)用建立的方法，對2015年～2017年貴州省貴陽市、大方縣、安順市、甕安縣等生豬規(guī)?；B(yǎng)殖場分離鑒定的156株大腸桿菌進(jìn)行傳統(tǒng)的氟苯尼考藥敏試驗，同時應(yīng)用試劑盒對156株大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)的氟苯尼考藥敏試驗共檢測出88株耐藥表型菌株，試劑盒檢測這88株表型耐藥菌株有85株flor基因陽性，而藥敏試驗陰性的68株大腸桿菌，試劑盒檢測有6株flor基因陽性。耐藥表型和耐藥基因檢出率符合率為96.7％(88/91)。

9.試劑盒保存試驗結(jié)果

將試劑盒保存在4℃、-20℃分別于3月、6月、12月，對大腸桿菌flor基因陽性菌株進(jìn)行檢測，4℃保存6月、12月標(biāo)準(zhǔn)陽性品拷貝數(shù)分別降低10倍、1000倍；-20℃保存3月、6月對標(biāo)準(zhǔn)陽性品拷貝數(shù)無影響，保存12月標(biāo)準(zhǔn)陽性品拷貝數(shù)降低10倍。

氟苯尼考是20世紀(jì)80年代研制獸醫(yī)專用抗生素，具有抗菌譜廣、吸收快等特點，可以廣泛用于治療畜禽養(yǎng)殖中的細(xì)菌性疾病，在生豬養(yǎng)殖場中廣泛用于治療仔豬腹瀉、豬喘氣病、傳染性胸膜肺炎等，尤其是作為仔豬腹瀉的預(yù)防保健藥。本研究中分離的156株致病性大腸桿菌就有88株表型耐藥，耐藥率達(dá)到56.4％(88/156)，表明生豬養(yǎng)殖場中大腸桿菌對氟苯尼考耐藥也越來越嚴(yán)重，可這能和養(yǎng)殖場使用氟苯尼考作為保健藥，以及治療中大量濫用有關(guān)。

flor基因作為大腸桿菌的外排泵基因，通過flor基因編碼的外排泵蛋白將體內(nèi)的氟苯尼考泵出體外，以降低細(xì)菌內(nèi)氟苯尼考的濃度，從而抑制氟苯尼考抑菌的作用，同時flor基因是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移，可造成耐藥性廣泛傳播。本研究根據(jù)genbank中豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥的flor基因序列，建立豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因熒光定量pcr診斷方法，以此研制成診斷試劑盒對大腸桿菌磺胺類耐藥菌株，β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株均為陰性，靈敏度可達(dá)1.0×10¹拷貝/μl，和傳統(tǒng)的藥敏試驗符合率達(dá)96.7％(88/91)，耐藥表型與耐藥基因型檢出率呈正相關(guān)，表明試劑盒可用于大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因的調(diào)查。

本研究中試劑盒檢測這88株表型耐藥菌株只有85株flor基因陽性，這可能與大腸桿菌對氟苯尼考存在其他耐藥機制有關(guān)。同時，藥敏試驗陰性的68株大腸桿菌，試劑盒檢測有6株flor基因陽性，這可能與耐藥基因本身出現(xiàn)個別基因變異或缺失引起外排泵功能減弱或喪失有關(guān)。

附圖說明

圖1為flor基因pcr擴增結(jié)果：

m：dl2000；1：flor基因pcr產(chǎn)物；2：陰性對照；

圖2為sybrgreeni熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為sybrgreeni熒光定量pcr熔解曲線；

圖4為sybrgreeni熒光定量pcr敏感性試驗中，熒光值與循環(huán)數(shù)的關(guān)系曲線；

1：重組質(zhì)粒dna1.0×10⁵拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果、2：重組質(zhì)粒dna1.0×10⁴拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果、3：重組質(zhì)粒dna1.0×10³拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果、4：重組質(zhì)粒dna1.0×10²拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果、5：重組質(zhì)粒dna1.0×10¹拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果、6：重組質(zhì)粒dna1.0×10⁰拷貝/μl稀釋的sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果。

圖5為sybrgreeni熒光定量pcr特異性試驗中，熒光值與循環(huán)數(shù)的關(guān)系曲線；

1：大腸桿菌氟苯尼考耐藥菌株sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果；2：大腸桿菌磺胺類耐藥菌株；3：大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類耐藥菌株；4：大腸桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株sybrgreeni熒光定量pcr結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實施方式來對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的限定，但要求保護的范圍不僅局限于所作的描述。

實施例

豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因sybrgreeni熒光定量pcr診斷試劑盒，包括40μl混合引物、250μlpremixextaq、20μlroxreferencedye、100μldl2000、500μlrnasefreedh2o、20μl陽性對照、20μl陰性對照；其中，混合引物包括上游引物和下游引物，上游引物為5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物為5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`。

在某些實施例中，陰性對照為超純水。陽性對照為pmd-18t-flor。

在某些實施例中，選取將本發(fā)明創(chuàng)造的試劑盒，在-20℃下保存≤6個月。

在某些實施例中，對于混合引物，濃度選取為10μmol/l。對于混合引物中，上游引物與下游引物的用量是相等的。