專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從雞蛋中同時(shí)提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種雞蛋中氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)及代謝物氟苯尼考胺(FFA)同時(shí)提取、凈化的方法。
背景技術(shù)：
在對(duì)食品殘留物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果能同時(shí)對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，那么將大大提高工作效率，但只有同時(shí)能將多種殘留物同時(shí)從樣本中提取出來(lái)，才可能建立起高效的檢測(cè)方法。氯霉素類(lèi)藥物主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等，以其廣譜、高效等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人醫(yī)與獸醫(yī)。然而由于其不同的毒性作用在世界范圍內(nèi)被廣泛監(jiān)測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有許多報(bào)道，提取劑一般為乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)雞蛋中該四種藥物同時(shí)提取的方法未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯乙腈氨水(49 49 2，V/V)作為提取劑，飽和正己烷去脂和凈化，提取效率較高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)不能同時(shí)從雞蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種同時(shí)提取、凈化這幾種藥物的方法，該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種同時(shí)從雞蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法，該方法具體是將雞蛋制成勻漿后，加入氘代氯霉素d5-CAP內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入濃度為30%的乙腈溶液混勻，再用體積比49 49 2的乙酸乙酯乙腈氨水提取，再經(jīng)飽和正己烷脫脂，提取液重復(fù)提取一次，最后用氮吹儀吹干。上機(jī)前殘?jiān)胠.OmL 10%乙腈分兩次漩渦振蕩溶解，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中；12100Xg離心15分鐘，上清液經(jīng)0. 22 ii m濾膜過(guò)濾，濾液供高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)測(cè)定。采用本發(fā)明方法能將雞蛋中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺同時(shí)提取出來(lái)，且經(jīng)凈化、濃縮步驟得到的濃縮液可以供HPLC-MS/MS檢測(cè)用。本發(fā)明比較了不同提取劑、提取劑不同體積比對(duì)回收率的影響，最終選擇堿性乙酸乙酯作為提取劑，且堿性乙酸乙酯(乙酸乙酯乙腈氨水)體積比為49 : 49 : 2。因?yàn)镕FA是弱堿性藥物，在pH較高的環(huán)境下有較高的溶解性。堿性乙酸乙酯可有效提取四種藥物，回收率也較高，且不影響其它三種藥物的提取。乙腈可有效去除部分蛋白質(zhì)，減少內(nèi)源性雜質(zhì)，有利于樣品凈化，在此體積比下，CAP,TAP,FF和FFA的平均回收率能達(dá)90. 84%以上。本發(fā)明采用正己烷(用純乙腈飽和)去脂，凈化效果良好。最終篩選出了雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺殘留的最佳前處理方法。該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高，平均回收率均在90. 84%以上，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均分別低于5. 10%和11. 30%，達(dá)到或超出歐盟殘留測(cè)定要求。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所涉及的試劑的百分濃度，除特別說(shuō)明外均指質(zhì)量百分濃度。I、實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)、給藥和樣品采集隨機(jī)選取28周齡京海黃雞產(chǎn)蛋雞25只，體重I. 78±0. 22kg，作為空白對(duì)照組，單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)前預(yù)飼I周，飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料(自制于江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司飼料廠)，自由飲水。連續(xù)5d飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料,于每天17:30 18:00收集雞蛋，雞蛋樣品保存在低溫蛋庫(kù)中。2、本發(fā)明提取、萃取、及凈化步驟 (I)用勻漿機(jī)將雞蛋制成勻漿；(2)準(zhǔn)確稱(chēng)取5. Og雞蛋勻漿樣品，放于50mL具塞離心管中，加入d5_CAP內(nèi)標(biāo)溶液IOOu L ；(3)加入lmL30%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；(4)加入IOmL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49 : 49 : 2，V/V)，漩渦振蕩混勻lmin,再用超聲波振蕩萃取15min ；(5)8000Xg離心IOmin,上清液轉(zhuǎn)移至20mL玻璃管中；(6)重復(fù)步驟4-5提取I次，合并上清液；(7)在50°C氮吹儀上吹至I 2mL ;(8)加入I. OmL純乙腈溶解,潤(rùn)旋振蕩混勻Imin ；(9)加IOmL飽和正己烷(用純乙腈飽和)脫脂，棄去上層正己烷，下層提取液重復(fù)去脂I次；(10)在50°C氮吹儀吹干；冷凍保存；上機(jī)前用I. OmL 10%乙腈分兩次漩渦振蕩溶解，轉(zhuǎn)移至I. 5mL離心管中；12100 X g離心15分鐘，上清液經(jīng)0. 22 ii m濾膜過(guò)濾，濾液供HPLC-MS/MS測(cè)定。3、回收率的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取5. Og勻漿后的空白雞蛋勻漿液，置50mL聚丙烯離心管中，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液各IOOmL,對(duì)應(yīng)的在空白雞蛋樣品中添加濃度分別為CAP :0. 1,0. 3,0. 6、
3.0 u g kg 1 ；TAP :1. O、25. O、50. O、75. 0 u g kg 1 ；FF :0. 3、50. 0、100. 0、150. 0 u g kg 1 ；FFA 1. 5,50. 0、100. 0,150. Ou g kg'加入 d5-CAP 內(nèi)標(biāo)溶液(250 u g L-1) IOOy L，每個(gè)濃度水平設(shè)置6個(gè)平行，漩渦振蕩混勻，經(jīng)上述樣品提取與凈化后，取IOy L進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜條件如下，離子源電噴霧離子源(ESI);掃描方式正離子掃描(FFA)和負(fù)離子掃描(CAP、TAP、FF和d5-CAP):檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧毛細(xì)管電壓4000V(正離子掃描)、3500V(負(fù)離子掃描);干燥氣溫度30(TC ;干燥氣流速10L mirT1 ；霧化器氣體壓力15psi ;鞘氣溫度250°C;鞘氣流速JL^mirT1 ;二級(jí)碰撞氣氮?dú)?。根?jù)各分析物定量離子(CAP m/z 321. 2/152. 0 ；TAP m/z 354. 1/185. 0 ；FF m/z 356. 1/185. I ；FFA m/z 248. 1/130. I)與同位素內(nèi)標(biāo)離子(d5_CAP m/z 326. 1/157. I)的峰面積比值計(jì)算添加回收率。在此條件下，本發(fā)明方法提取雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果見(jiàn)表I。
表I雞蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率(n = 6)
分析物添加值(膽Ig4)回收率(％) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)
Ol95.68±5.786M
0.3a94.85±6.917.28 PAP
I0.6103.14 士4.554.41
3.0106.63士3.062.87 LO91.26 士8.379J7
25.098.84士8.909.00TAP I
50.0b103.15 士8.738.4675.0108.23士6.756.24
0399.62士 5.85187
50.092.12士3.894.22FF 100.0b 103.75士5.74 5.53
150.0107.84士5.875.44 L5 90.84士8.35 9J9
50.093.14士8.959.61FFA I
100 .Ob102.35±9.349.13
150.093.65±7.678.19注a.最低要求執(zhí)行限量；b.最高殘留限量4、精密度的測(cè)定日內(nèi)精密度測(cè)定將檢測(cè)回收率剩余的樣品按藥物濃度高低分別混合成4份，得至IJ量較多的4種藥物濃度的樣品。在同日內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)HPLC-MS/MS 6次重復(fù)測(cè)定4種藥物濃度的樣品，求得日內(nèi)(批內(nèi))精密度。日間精密度測(cè)定將檢測(cè)回收率剩余的樣品按藥物濃度高低分別混合成4份，得至IJ量較多的4種藥物濃度的樣品。在一周內(nèi)不同日以不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)HPLC-MS/MS6次重復(fù)測(cè)定4種藥物濃度的樣品，求得日間(批間)精密度。結(jié)果如下表2雞蛋中CAP、TAP、FF和FFA的精密度(n = 6)
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)從雞蛋中提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留的方法，是將雞蛋制成勻漿后，加入氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入30%乙腈溶液混勻，再用體積比49 49 2的乙酸乙酯乙腈氨水提取，提取液再經(jīng)飽和正己烷脫脂，提取液重復(fù)提取一次，最后用氮吹儀吹干。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟如下 ①用勻漿機(jī)將雞蛋制成勻漿； ②準(zhǔn)確稱(chēng)取5.Og雞蛋勻漿樣品，放于50mL具塞離心管中，加入250ug* L^d5-CAP內(nèi)標(biāo)溶液100 u L ； ③加入lmL30%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻； ④加入IOmL體積比為49: 49 : 2的乙酸乙酯-乙腈-氨水；漩渦振蕩混勻lmin，再用超聲波振蕩萃取15min ； ⑤8000Xg離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)移至20mL玻璃管中； ⑥重復(fù)步驟4-5提取I次，合并上清液； ⑦在50°C氮吹儀上吹至I 2mL; ⑧加入I.OmL純乙腈溶解,潤(rùn)旋振蕩混勻Imin ； ⑨加IOmL純乙腈飽和飽和正己烷脫脂，棄去上層正己烷，下層提取液重復(fù)去脂I次； ⑩在50°C氮吹儀吹干；冷凍保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種雞蛋中氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)、氟苯尼考(FF)及代謝物氟苯尼考胺(FFA)同時(shí)提取、凈化的方法。該方法是將雞蛋制成勻漿后，加入氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入30％乙腈溶液混勻，再用體積比49∶49∶2的乙酸乙酯∶乙腈∶氨水提取，提取液再經(jīng)飽和正己烷脫脂，提取液重復(fù)提取一次，最后用氮吹儀吹干。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高，平均回收率均在90.84％以上，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均分別低于5.10％和11.30％，達(dá)到或超出歐盟殘留測(cè)定要求。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102645499SQ20121005562
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者孫瑛瑛, 張小杰, 張跟喜, 戴國(guó)俊, 王金玉, 謝愷舟, 謝星, 賈龍飛, 陳國(guó)宏, 陳學(xué)森 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)