本發(fā)明屬于生物工程領域，尤其涉及一種鴨源性成分pcr檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法。

背景技術：

隨著生活水平的不斷提高，人們對食品質(zhì)量安全的重視程度也相應提高。一些不法分子為牟取暴利，低價購入不明動物源的劣質(zhì)肉用以制作肉制品，或使用香精等制作假冒肉制品，嚴重擾亂肉制品市場，損害消費者正當權(quán)益，帶來極大的安全隱患。因此，加強肉制品檢測，準確檢測出食品中相應動物源成分的含量，是防治劣質(zhì)肉制品流入市場的關鍵措施。

熒光定量聚合酶鏈式反應(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction，fq-pcr)方法是聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)技術的一種，是公認的目前核酸檢測的最常用定量檢測方法。實時熒光定量pcr技術在pcr反應體系中加入能特異標記pcr產(chǎn)物的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對樣品進行定量分析，實現(xiàn)了pcr技術由定性到定量的飛躍。

使用fq-pcr技術對樣品進行檢測時需要陽性參考物質(zhì)作為對照，以保證實驗結(jié)果的可靠性。因此，陽性參考物質(zhì)的質(zhì)量與實驗結(jié)果的準確性密切相關。現(xiàn)階段，對于動物源性成分的檢測過程中所用的陽性參考物質(zhì)通常是動物基因組dna。其中，鴨成分檢測過程中，提取鴨基因組dna過程復雜，制備非常不方便。由于鴨基因組dna的穩(wěn)定性不能滿足長期貯存及經(jīng)常性使用的需要，因此，每次進行鴨成分檢測時，都需要重新制備鴨基因組dna作為陽性參考物質(zhì)，影響鴨成分測量的穩(wěn)定性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了鴨源性成分pcr檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法，以解決pcr檢測過程中陽性參考物質(zhì)制備復雜、儲存困難的問題。

第一方面，本發(fā)明提供了一種鴨源性成分pcr檢測用陽性標準分子，為能夠自主復制的質(zhì)粒分子，所述質(zhì)粒分子中包含鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種用以制備第一方面所述陽性標準分子的制備方法，包括以下步驟：

（1）分別設計鴨18srrna基因序列的擴增引物18s-f、18s-r和鴨線粒體基因序列的擴增引物anas-f、anas-r；

鴨18srrna基因序列的擴增引物18s-f、18s-r為：

18s-f：5'-gcgtcgacagcctgagaaacggctacc-3'，

18s-r：5'-aactgcagtgctggcaccagacttgc-3'；

鴨線粒體基因序列的擴增引物anas-f、anas-r為：

anas-f：5'-ccatgaagccccattctca-3'，

anas-r：5'-ccggtggcaacaaagaaagt-3'；

（2）以鴨基因組為模板基因組，用鴨18srrna基因序列的擴增引物和鴨線粒體基因序列的擴增引物，進行pcr擴增，得到鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列；

（3）將鴨18srrna基因序列和鴨線粒體序列分別連接至pmd18-t載體，得到鴨18srrna重組子和鴨線粒體重組子；

（4）將鴨18srrna重組子和鴨線粒體重組子通過限制性內(nèi)切酶酶切并拼接，得到陽性標準分子。

可選地，所述限制性內(nèi)切酶為sali酶和psti酶。

可選地，步驟（2）中，pcr擴增的反應體系為10um上游引物1μl，10um下游引物1μl，模板基因組3μl，taq酶12.5μl，加ddh2o調(diào)整反應體系的體積為25μl；所述pcr擴增的反應條件為94℃變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40次循環(huán)，得到pcr產(chǎn)物；

將pcr產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目的產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化，得到pcr純化產(chǎn)物，即為鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列。

可選地，步驟（3）中，將鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列分別與pmd18-t載體進行連接，4℃下過夜連接，得到鴨18srrna重組子18s-pmd18-t和鴨線粒體重組子anas-pmd18-t。

可選地，步驟（4）中，將鴨18srrna重組子和鴨線粒體重組子分別用sali酶和psti酶進行雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收片段連接，4度過夜連接，搖床均勻混勻2小時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行凝膠電泳分離，回收大分子質(zhì)粒條帶進行重組克隆質(zhì)粒篩選回收，得到重組克隆；將重組克隆通過常規(guī)pcr驗證、sali和psti的酶切驗證及酶切產(chǎn)物測序驗證，得到的質(zhì)粒分子18s-anas-pmd18-t即為陽性標準分子。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種用以檢測第一方面所述陽性標準分子特異性的檢測方法，具體地，利用特異性檢測引物和探針，以陽性標準分子為模板進行實時熒光pcr反應，特異性檢測引物和探針包括以下兩組：

鴨18srrna基因序列的特異性檢測引物18s-f、18s-r和探針18s-p：

18s-f：5'-gcgtcgacagcctgagaaacggctacc-3'，

18s-r：5'-aactgcagtgctggcaccagacttgc-3'，

18s-p：5'-tgcgcgcctgctgccttcct-3'；

鴨線粒體基因序列的特異性檢測引物anas-f、anas-r和探針anas-p：

anas-f：5'-ccatgaagccccattctca-3'，

anas-r：5'-ccggtggcaacaaagaaagt-3'，

anas-p：5'-tcgccgacagcgtctacggct-3'。

可選地，探針的5'端修飾有熒光報告基團，3'端修飾有熒光淬滅基團。

本發(fā)明制備得到的鴨源性成分pcr檢測用陽性標準分子，具有制備過程簡單、可長時間保存、特異性強以及靈敏度高的優(yōu)勢，該陽性標準分子不需要依賴標準鴨材料的供應，可以替代鴨基因組dna用于鴨成分的pcr定性、定量測量及分析，保證實驗檢測結(jié)果的可靠性，解決了食品監(jiān)管工作中缺乏陽性對照的難題。

應當理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本發(fā)明。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領域普通技術人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明制備的陽性標準分子的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為鴨18srrna基因組序列實時熒光pcr擴增曲線對比圖；

圖3為鴨線粒體基因組序列實時熒光pcr擴增曲線對比圖；

圖4為本發(fā)明制備的陽性標準分子的靈敏度檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例一

1、dna提取：采用qiagendneasybloodandtissuekit提取鴨肉基因組dna，用分光光度計檢測dna純度和濃度。測定od260/od280值均為1.8-1.9左右，濃度在10ng/μl以上，說明dna純度較高，濃度適中，符合pcr擴增要求。

2、引物及特異性探針設計：對genebank中搜索鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列，根據(jù)獲得的鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列，利用primer5.0設計兩對pcr引物，分別用于擴增鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列，設計兩種特異性探針，用以檢測最終制備的陽性標準分子是否構(gòu)建成功。探針的5'端修飾有熒光報告基團，3'端修飾有熒光淬滅基團。引物和探針如下表所示：

表1用于擴增（特異性檢測）18srrna基因序列和線粒體基因序列的引物及探針

3、鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列的克隆

以鴨基因組為模板基因組，利用表1中的引物對18s-r和18s-p進行pcr擴增，得到鴨18srrna基因序列。以鴨基因組為模板基因組，利用表1中的引物對anas-f和anas-r進行pcr擴增，得到鴨線粒體基因序列。具體地，pcr擴增的反應體系為10um上游引物1μl，10um下游引物1μl，模板基因組3μl，taq酶12.5μl，加ddh2o調(diào)整反應體系的體積為25μl；所述pcr擴增的反應條件為94℃變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40次循環(huán)，得到pcr產(chǎn)物；將pcr產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目的產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化，得到pcr純化產(chǎn)物，即為鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列。

將鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列分別與pmd18-t載體進行連接，4℃下過夜連接，得到鴨18srrna重組子18s-pmd18-t和鴨線粒體重組子anas-pmd18-t。

4、陽性標準分子的構(gòu)建

將鴨18srrna重組子和鴨線粒體重組子分別用sali酶和psti酶進行雙酶切，37℃水浴2小時，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收片段連接，4度過夜連接，搖床均勻混勻2小時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行凝膠電泳分離，回收大分子質(zhì)粒條帶進行重組克隆質(zhì)粒篩選回收，得到重組克??；將重組克隆通過常規(guī)pcr驗證、sali和psti的酶切驗證及酶切產(chǎn)物測序驗證，得到的質(zhì)粒分子18s-anas-pmd18-t即為陽性標準分子。18s-anas-pmd18-t的具體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實施例二

1、陽性標準分子的構(gòu)建結(jié)果

以實施例一制備的18s-anas-pmd18-t為模板，分別用表1中的引物和探針對其進行pcr擴增，并測序驗證后發(fā)現(xiàn)擴增序列與預期片段一致。結(jié)果表明構(gòu)建的陽性標準分子包含鴨18srrna基因序列和鴨線粒體基因序列，即陽性標準分子構(gòu)建成功。

2、陽性標準分子的特異性檢測結(jié)果

以表1中的引物和探針對鴨基因組、陰性樣本和陽性標準分子進行實時熒光pcr擴增，擴增曲線結(jié)果如圖2和圖3所示，其中，圖2為鴨18srrna基因組序列實時熒光pcr擴增曲線對比圖，圖3為鴨線粒體基因組序列實時熒光pcr擴增曲線對比圖。結(jié)合圖2和圖3可以看出，針對鴨18srrna和鴨線粒體基因序列所設計的引物和探針，不論對鴨基因組還是本發(fā)明的陽性標準分子都能檢測出陽性信號。鴨18srrna基因檢出的ct值為鴨基因組15個循環(huán)，陽性標準分子11個循環(huán)，而陰性樣本則沒有信號；鴨線粒體基因檢出的ct值為鴨基因組15個循環(huán)，陽性標準分子21個循環(huán)，而陰性對照則沒有信號。說明本發(fā)明制備的陽性標準分子能被特異性的探針檢測到，具有很好的特異性。

3、陽性標準分子的靈敏度檢測結(jié)果

對陽性標準分子進行十倍梯度稀釋（10^-1至10^-7），采用表1中的探針進行實時熒光pcr檢測，反應體系及反應條件同特異性檢測相同，每個反應重復6次。建立標準曲線，根據(jù)檢測擴增效率和相關系數(shù)分析陽性標準分子的均勻性。結(jié)果如圖4所示，表明最低檢測值均為達到10^-7稀釋度，說明本發(fā)明制備的陽性標準分子靈敏度較高。

4、陽性標準分子的穩(wěn)定性檢測結(jié)果

一般短期穩(wěn)定性研究4-8周，長期穩(wěn)定性進行6個月或1年。按iso導則35，關于穩(wěn)定性評價的方法對標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進行評價。

將制備的陽性標準分子置于室溫25℃條件下，放置兩個月，進行實時熒光pcr檢測，對獲得的ct值進行統(tǒng)計分析陽性標準分子的穩(wěn)定性。對每次實時熒光pcr檢測每個反應6個重復的ct值平均值進行相對標準偏差分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明室溫條件下陽性標準分子儲存1周后才開始出現(xiàn)顯著性差異，而這種顯著性差異在陽性標準分子儲存超過一月后消失。因此推斷本發(fā)明制備的陽性標準分子熱穩(wěn)定性較好，不易降解，但隨著時間延長，整個基因組也表現(xiàn)出不穩(wěn)定，一個月以后陽性標準分子開始產(chǎn)生明顯變化。

表2陽性標準分子的穩(wěn)定性檢測結(jié)果

本領域技術人員在考慮說明書及實踐這里發(fā)明的公開后，將容易想到本發(fā)明的其它實施方案。本發(fā)明旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應性變化，這些變型、用途或者適應性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術領域中的公知常識或慣用技術手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神權(quán)利要求指出。應當理解的是，本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限制。

核苷酸序列表

<110>山東省食品藥品檢驗研究院

<120>鴨源性成分pcr檢測用陽性標準分子、制備及檢測方法

<160>6

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

gcgtcgacagcctgagaaacggctacc27

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

aactgcagtgctggcaccagacttgc26

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>3

ccatgaagccccattctca19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>4

ccggtggcaacaaagaaagt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

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<223>

<400>5

tgcgcgcctgctgccttcct20

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<212>dna

<213>人工合成

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tcgccgacagcgtctacggct21