本發(fā)明屬于原位雜交技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞熒光原位雜交方法。

背景技術(shù)：

熒光原位雜交技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末，是利用堿基互補配對的原則在染色體、間期細胞核和dna纖維上進行dna序列定位的一種有效手段，能對惡性腫瘤、神經(jīng)呆滯及畸形病癥中發(fā)生的部分染色體微小的畸變進行識別并進行定位。盡管傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)已經(jīng)有了很大的進步，但是檢查這些染色體和基因變化還是受到限制。染色體光譜雖然是全面分析這些情況的一個有效工具，但由于其樣品制備的難度以及識別平衡的主觀性太大等缺點，因而仍有一定的局限性。隨著熒光原位雜交技術(shù)的不斷改進和提高，其檢測分辨率和靈敏性都得到了顯著提高，目前，原位雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用在基因物理定位、染色體識別、物理圖譜的構(gòu)建、親緣關(guān)系研究和轉(zhuǎn)基因檢測等方面，在現(xiàn)代分子細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域有著舉足輕重的作用。

胚胎干細胞(embryonicstemcell，es細胞)是具有全向分化和無限增殖能力的一群細胞，一般是從囊胚的內(nèi)胚團(icm)或原始生殖細胞中分離培養(yǎng)而來。自從1981年首次從小鼠的囊胚中分離出可以連續(xù)培養(yǎng)的es細胞以來，es細胞的研究與應(yīng)用得到很大的關(guān)注，在細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的研究過程中也發(fā)揮越來越大的作用。采用熒光原位雜交的方法可以更清晰對特定染色體的差異分析，基因位點的堿基差異可更加清晰、簡潔、直觀的呈現(xiàn)出來。因此，摸索針對es細胞有效的fish方案對于es細胞的分子遺傳學(xué)方面的研究有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種染色結(jié)果更清晰、直觀、準(zhǔn)確的細胞熒光原位雜交方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：細胞熒光原位雜交方法，包括預(yù)處理和雜交，預(yù)處理采用75％的低滲液進行低滲處理；雜交之前進行魚精dna的預(yù)雜交試驗，預(yù)雜交時間為1-2h。

雜交中加入探針后的雜交液置于75℃水浴變性10min，變性好的雜交液37℃孵育12-16h。

細胞為小鼠es細胞、人ht29細胞、人ips細胞。

預(yù)處理包括以下操作：將體外培養(yǎng)的細胞用胰酶消化，1000r水平離心5min棄上層培養(yǎng)基，將所獲得的細胞用75％的0.075％kcl的低滲液(即75％的0.075％kcl，25％的pbs，)進行低滲處理；將進行過低滲處理的細胞用固定液進行兩次固定；固定后的細胞，1000r水平離心4.5min，棄上清，輕輕彈起細胞涂到防脫載玻片上；將涂好的細胞片置于37℃過夜老化。

預(yù)雜交包括以下操作：將老化過夜的細胞常溫70％、95％、100％的梯度酒精脫水，自然晾干；將晾干的玻片置于75℃的變性液中進行變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％、95％、100％的梯度酒精中3min、1min、1min，自然晾干；將預(yù)雜交液魚精dna置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；將變性好的預(yù)雜交液按每張玻片10μl左右滴加到變性好的玻片上，37℃孵育1h。

雜交包括以下操作：將預(yù)雜交后的玻片分別置于常溫放置的70％、95％、100％的梯度酒精中漂洗各5min，自然晾干；將配置好的探針置于75℃水浴變性探針10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min左右；將探針按比例加入雜交液中，按照每張玻片滴加10μl左右的雜交液37℃孵育12-16h。

上述細胞熒光原位雜交方法還有雜交后漂洗和染色步驟。

雜交后漂洗和染色包括以下操作：將雜交后的玻片置于50％的甲酰胺(即50％的甲酰胺，50％的2xssc)45℃洗滌2*5min，2xssc(即稀釋20xssc得2xssc，20xssc配制：在800ml水中溶解175.3gnacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/lnaoh溶解調(diào)節(jié)ph值至7.0，加水定容至1l)，45℃洗滌玻片2*5min，自然晾干；將晾干的玻片用hoechst-antifade置于暗處染色10min左右，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察。

針對現(xiàn)有熒光原位雜交技術(shù)存在的問題，發(fā)明人建立了一種細胞熒光原位雜交方法，包括預(yù)處理和雜交，預(yù)處理采用75％的低滲液進行低滲處理；雜交之前進行魚精dna的預(yù)雜交試驗，預(yù)雜交時間為1-2h。實際使用表明，該法能夠得到更為清晰、直觀、準(zhǔn)確的染色結(jié)果，實現(xiàn)了快速有效地對小鼠es細胞進行熒光原位雜交，也適用于人ips細胞染色體核型判斷，和人21三體綜合征的細胞核型進行分析，同時也為其他種類的細胞進行fish染色提供了一種參考。因此，應(yīng)用本發(fā)明在細胞原位顯示特異的dna或rna分子，為染色體或者基因完整性分析奠定了重要基礎(chǔ)。

與傳統(tǒng)的熒光原位雜交技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點和優(yōu)勢：

<1>通過75％的低滲液對細胞進行低滲處理，使細胞吸水膨脹，后期染色時，細胞處于一個層面，可以得到較為完整、清晰地染色結(jié)果。

<2>優(yōu)選了75℃*10min作為玻片和探針變性的時間，12-16h為探針孵育時間，精確控制時間和溫度對于細胞中dna的完全變性和對探針中dna的完全變性起到了很好的作用。

<3>在探針雜交之前進行了一個魚精dna的預(yù)雜交試驗，通過預(yù)雜交封閉了一些非特異性位點，降低了染色過程中的非特異性染色，降低了噪點，可以獲得較為準(zhǔn)確的染色結(jié)果，這一發(fā)現(xiàn)也為其他相關(guān)染色的相關(guān)實驗提供一種借鑒。

附圖說明

圖1是小鼠es細胞未進行低滲處理x染色體紅色點探針fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，bx染色體紅色熒光標(biāo)記點探針染色。

圖2是人的ht29細胞未進行低滲處理21號染色體綠色點探針fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，b人21號染色體綠色熒光標(biāo)記點探針染色。

圖3是小鼠es細胞未進行預(yù)雜交x染色體紅色點探針fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，b小鼠x染色體紅色熒光標(biāo)記點探針染色。

圖4是小鼠es細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后x染色體紅色點探針fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，bx染色體紅色熒光標(biāo)記點探針染色。

圖5是小鼠es細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后xy染色體探針共染fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，by染色體綠色熒光標(biāo)記全染色體點探針染色，cx染色體紅色熒光標(biāo)記點探針染色。

圖6是人的21三體綜合征患者ips細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后21號染色體綠色點探針fish染色的示意圖(100x)，圖中：ahoechst染色，b人21號染色體綠色熒光標(biāo)記點探針染色。

具體實施方式

實施例1小鼠es細胞未進行低滲處理x染色體紅色點探針fish染色方法

首先，將體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的es細胞先用0.05％的胰酶進行消化，4500r水平離心10min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液4℃固定1.5h；將固定好的細胞4500r離心10min，根據(jù)細胞量的多少棄上清，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜后的細胞常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃的變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中進行變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；將預(yù)雜交液(魚精dna)每張玻片大約10μl置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的預(yù)雜交液每張玻片10μl滴加到玻片上，蓋上蓋玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

將預(yù)雜交后的玻片分別置于常溫放置的70％，95％，100％的梯度酒精漂洗各5min，自然晾干；同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl人的x染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述過夜雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min左右，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例2人的ht29細胞未進行低滲處理21號染色體綠色點探針fish染色方法

首先，將體外培養(yǎng)的人的ht29細胞先用0.05％的胰酶進行消化，將消化好的細胞4500r水平離心10min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入甲醇∶冰醋酸＝3∶1的固定液4℃固定1.5h；將固定好的細胞4500r離心10min，根據(jù)細胞量的多少棄上清，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜后的細胞常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃的變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中進行變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；將預(yù)雜交液(魚精dna)每張玻片大約10μl置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的預(yù)雜交液每張玻片10μl滴加到玻片上，蓋上蓋玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

將預(yù)雜交后的玻片分別置于常溫放置的70％，95％，100％的梯度酒精漂洗各5min，自然晾干；同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl人的7號染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min左右，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例3小鼠es細胞未進行預(yù)雜交x染色體紅色點探針fish染色的方法

首先，將體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的小鼠es細胞用0.05％的胰酶進行消化，將消化好的細胞1000r水平離心5min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入75％的0.075％kcl的低滲液使細胞逐漸吸水膨脹，同時一邊旋轉(zhuǎn)離心管，直到細胞懸液看起來完全澄清，然后置于37℃水浴處理10min，加入幾滴固定液進行預(yù)固定，1000r離心5min；棄去多余上清，輕彈管壁，使細胞重懸，緩緩加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，4℃放置半小時對細胞進行第一次固定；1000r離心5min，去除上清；輕輕彈起細胞，緩緩加入固定液，一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，對細胞進行第二次固定；1000r離心5min，棄去多余固定液，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜后鋪有es細胞的玻片常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；

同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl的x染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例4小鼠es細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后x染色體紅色點探針fish染色方法

首先，將體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的小鼠es細胞用0.05％的胰酶進行消化，將消化好的細胞1000r水平離心5min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入75％的0.075％kcl的低滲液使細胞逐漸吸水膨脹，同時一邊旋轉(zhuǎn)離心管，直到細胞懸液看起來完全澄清，然后置于37℃水浴處理10min，加入幾滴固定液進行預(yù)固定，1000r離心5min；棄去多余上清，輕彈管壁，使細胞重懸，緩緩加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，4℃放置半小時對細胞進行第一次固定；1000r離心5min，去除上清；輕輕彈起細胞，緩緩加入固定液，一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，對細胞進行第二次固定；1000r離心5min，棄去多余固定液，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜后鋪有es細胞的玻片常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；將預(yù)雜交液(魚精dna)每張玻片大約配制10μl的量，置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的預(yù)雜交液每張玻片10μl滴加到玻片上，蓋上蓋玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

將預(yù)雜交處理后的玻片分別置于常溫放置的70％，95％，100％的梯度酒精各5min，自然晾干；同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl的x染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例5小鼠es細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后xy染色體探針共染fish染色方法

首先，將體外無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的小鼠es細胞用0.05％的胰酶進行消化，將消化好的細胞1000r水平離心5min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入75％的0.075％kcl的低滲液使細胞逐漸吸水膨脹，同時一邊旋轉(zhuǎn)離心管，直到細胞懸液看起來完全澄清，然后置于37℃水浴處理10min，加入幾滴固定液進行預(yù)固定，1000r離心5min；棄去多余上清，輕彈管壁，使細胞重懸，緩緩加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，4℃放置半小時對細胞進行第一次固定；1000r離心5min，去除上清；輕輕彈起細胞，緩緩加入固定液，一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，對細胞進行第二次固定；1000r離心5min，棄去多余固定液，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜后鋪有es細胞的玻片常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；將預(yù)雜交液(魚精dna)每張玻片大約配制10μl的量置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的預(yù)雜交液每張玻片10μl滴加到玻片上，蓋上蓋玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

將預(yù)雜交處理后的玻片分別置于常溫放置的70％，95％，100％的梯度酒精各5min，自然晾干；同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl的x染色體探針和0.1μl的y染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例6人的21三體綜合征患者ips細胞進行低滲和預(yù)雜交處理后21號染色體綠色點探針fish染色方法

首先，將體外培養(yǎng)的人的21三體綜合征患者ips細胞用酶進行消化，將消化好的細胞1000r水平離心5min，去除培養(yǎng)基，用手指輕彈管壁，使細胞重新懸浮，加入75％的0.075％kcl的低滲液使細胞逐漸吸水膨脹，同時一邊旋轉(zhuǎn)離心管，直到細胞懸液看起來完全澄清，然后置于37℃水浴處理10min，加入幾滴固定液進行預(yù)固定，1000r離心5min；棄去多余上清，輕彈管壁，使細胞重懸，緩緩加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，4℃放置半小時對細胞進行第一次固定；1000r離心5min，去除上清；輕輕彈起細胞，緩緩加入固定液，一邊加一邊輕輕轉(zhuǎn)動管壁，直到細胞澄清，對細胞進行第二次固定；1000r離心5min，棄去多余固定液，輕輕彈起管壁，使細胞重懸，將重懸好的細胞鋪到防脫載玻片上，并進行標(biāo)記，將標(biāo)記好的玻片置于37℃烘箱過夜老化。

將老化過夜鋪有人的21三體綜合征患者ips細胞的玻片常溫下置于梯度酒精脫水(70％，95％，100％)，自然晾干，將晾干的玻片置于75℃變性液(70％甲酰胺，20％水，10％-20xssc)中變性10min，然后立即置于-20℃預(yù)冷的70％，95％，100％的梯度酒精中3min，1min，1min，自然晾干；將預(yù)雜交液(魚精dna)每張玻片大約配制10μl的量置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的預(yù)雜交液每張玻片10μl滴加到玻片上，蓋上蓋玻片并置于暗盒中，37℃孵育1h；

將預(yù)雜交處理后的玻片分別置于常溫放置的70％，95％，100％的梯度酒精各5min，自然晾干；同時在避光條件下按照探針配制的比例，在6μl雜交液中加入1μl人的21號染色體探針，充分混勻后，把配制好的雜交液置于75℃水浴變性10min，然后立即置于冰水混合物中放置5min；將變性好的雜交液每張7μl滴加到玻片上，蓋好蓋玻片，置于暗盒內(nèi)，37℃孵育12-16h；

提前在水浴鍋中預(yù)熱甲酰胺∶2xssc＝1∶1兩缸，2xssc兩缸；將上述雜交后的玻片輕輕揭去蓋玻片，然后置于甲酰胺∶2xssc＝1∶1的漂洗液中洗滌兩次各五分鐘，2xssc洗滌玻片兩次各五分鐘，自然晾干；然后配制hoechst工作液，并加入等體積的抗熒光淬滅劑，每張玻片大約滴加10μlhoechst-antifade到玻片上置于暗處染色10min，蓋上蓋玻片，指甲油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

實施例1至6的結(jié)果如圖1-6所示，將實施例1、實施例2的染色結(jié)果與實施例4進行對比發(fā)現(xiàn)，沒有經(jīng)過低滲處理而直接進行后期fish染色會造成染色效果不均勻，不利于對陽性染色體進行計數(shù)和完整性分析。出現(xiàn)這種情況的原因在于，細胞未經(jīng)過低滲處理，直接進行貼片，導(dǎo)致很多細胞的細胞核不在同一個焦平面，普通顯微鏡觀察拍照的時候不能進行多個層面的掃描，會影響對染色特核型的判斷，而經(jīng)過低滲這一處理后就能明顯的改善這一現(xiàn)象，獲得更清晰直觀的結(jié)果。而作為es細胞，和實施例4中的一致，用75％的低滲液處理得到的染色效果是比較好的。

將實施例3和實施例4的染色結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，如果對低滲處理后的玻片不進行預(yù)雜交處理，會有很多的非特異性染色的出現(xiàn)，影響觀察結(jié)果。如果在探針雜交之前用魚精dna進行1-2h的預(yù)雜交能很明顯的改善這種情況，獲得較為特異、清晰的染色結(jié)果。

對于很多較為難得或者需要對照染色的樣本，可能需要兩個或者多個探針共染的情況，如圖5所示，應(yīng)用本發(fā)明進行兩個探針共染也能得到很好的染色結(jié)果。

如圖6所示，發(fā)明人對人的21三體綜合征患者的ips細胞中21號染色體進行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過小鼠es細胞探索的fish方案同樣適用于人的ips細胞，這為21三體綜合征的醫(yī)學(xué)診斷也提供了一種更加簡單可靠的方法。