本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種檢測(cè)rs2066853位點(diǎn)基因型的引物組及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌，是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命安全。

最新的研究數(shù)據(jù)表明，全球范圍內(nèi)每年肺癌新發(fā)病例約180萬(wàn)；而在我國(guó)，2015年新發(fā)肺癌患者達(dá)73.3萬(wàn)例。由于肺癌常伴早期轉(zhuǎn)移，70％的肺癌病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，其5年生存率目前的平均水平只有16％。近年來(lái)，肺癌發(fā)病及致死率呈逐年上升趨勢(shì)，儼然成為沉重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。

人群流行病學(xué)及基礎(chǔ)病因?qū)W研究表明，腫瘤是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。其中，煙草暴露被認(rèn)為是肺癌的主要危險(xiǎn)因素之一。估計(jì)到2030年因吸煙導(dǎo)致的肺癌死亡人數(shù)將達(dá)到每年1000多萬(wàn)例。煙草燃燒過(guò)程中可產(chǎn)生上百種致癌物質(zhì)、促癌物，其中包括與肺癌發(fā)生關(guān)系密切的多環(huán)芳烴化合物(pahs)、苯、尼古丁和煙焦油等。煙霧中的多環(huán)芳烴代表物苯并(a)芘(bap)在體內(nèi)代謝，形成活性產(chǎn)物二醇環(huán)氧苯(a)并芘(bpde)，后者與鳥(niǎo)嘌呤形成加和物導(dǎo)致dna損傷，誘發(fā)突變，可增加細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性和肺癌的危險(xiǎn)度。多環(huán)芳烴進(jìn)入細(xì)胞后，首先與芳香烴受體ahr結(jié)合。ahr是配體活化性轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)與多環(huán)芳烴結(jié)合后隨即激活一系列代謝酶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多環(huán)芳烴的代謝活化過(guò)程。ahr是調(diào)控吸煙所誘導(dǎo)的代謝酶及下游調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵樞紐。研究證實(shí)，ahr信號(hào)通路異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。多個(gè)研究顯示，在人類(lèi)多種惡性腫瘤中均有ahr信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的異常改變。因此，對(duì)ahr信號(hào)通路基因深入的研究將為肺癌的基因預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

snp(singlenucleotidepolymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，是人類(lèi)基因組作圖的第三代遺傳標(biāo)記，主要是指一類(lèi)基于單堿基變異引起的dna序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。snp是基因組最廣泛存在的一類(lèi)多態(tài)性標(biāo)記，它以高密度以及二態(tài)性所適宜的快速、大規(guī)模的篩查和易于分型的特點(diǎn)決定了它比其他多態(tài)性標(biāo)志更適合對(duì)復(fù)雜性疾病的研究，其已成為研究基因組多態(tài)性和識(shí)別、定位疾病相關(guān)的一種工具。目前常規(guī)用于疾病易感基因變異的主要檢測(cè)方法包括pcr-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(rflp)和實(shí)時(shí)熒光定量pcr法。rflp法的原理是當(dāng)突變影響到某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)時(shí)，可通過(guò)酶切處理患者的pcr產(chǎn)物繼而電泳檢測(cè)是否有突變。但這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)。而于1996年成功研制snp檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，還實(shí)現(xiàn)了判斷結(jié)果的自動(dòng)性。可利用熒光定量pcr技術(shù)研發(fā)快速檢測(cè)疾病易感性的試劑盒。

人類(lèi)ahr基因位于第7號(hào)染色體7p21.1位置，全長(zhǎng)約47kb，mrna全長(zhǎng)43,800bp，共11個(gè)外顯子，編碼848個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。ahr基因編碼蛋白是ahr信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，它能抑制p53和brca1信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成及炎癥反應(yīng)等過(guò)程。大量的研究顯示，腫瘤發(fā)生過(guò)程中常見(jiàn)ahr基因的異常過(guò)表達(dá)。ahr的異常表達(dá)亦可促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移行為。此外，有研究表明，位于ahr基因序列的snps，可影響ahr基因的表達(dá)或功能而與疾病發(fā)生相關(guān)。

rs2066853是位于第7號(hào)染色體ahr基因編碼區(qū)位置的一個(gè)g>a多態(tài)。其在世界人群的頻率分布，g占0.73，a占0.27左右。中國(guó)人群的分布g占0.62，a占0.37左右。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，g>a的替代可改變ahr基因與轉(zhuǎn)錄因子tbp的結(jié)合，進(jìn)而影響ahr下游靶基因的表達(dá)從而調(diào)控某些疾病。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種檢測(cè)ahr基因編碼區(qū)rs2066853位點(diǎn)基因型的引物組；該引物組特異性高，擴(kuò)增效率高，可準(zhǔn)確鑒別rs2066853snp位點(diǎn)的基因型。

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)ahr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)rs2066853基因型的引物組。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)rs2066853位點(diǎn)基因型的方法。

本發(fā)明的再一目的目是提供一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供ahr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)rs2066853在個(gè)體肺癌易感性評(píng)估中的應(yīng)用或在作為個(gè)體肺癌易感性評(píng)估的靶點(diǎn)方面的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)大規(guī)模的人群肺癌病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，ahr基因編碼區(qū)域的g>a多態(tài)與肺癌發(fā)生相關(guān)，并且呈基因劑量-反應(yīng)關(guān)系，即使在調(diào)整年齡、性別、吸煙、腫瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關(guān)性仍然存在。

具體地，所述應(yīng)用為首先提取樣本基因組dna，再通過(guò)snp基因分型技術(shù)測(cè)定rs2066853位點(diǎn)的基因型，若rs2066853位點(diǎn)為a，則樣本為肺癌易感性。

優(yōu)選地，所述snp基因分型技術(shù)為taqman-mgb探針?lè)ā?/p>

一種檢測(cè)ahr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)rs2066853基因型的引物組，所述引物組包括一對(duì)特異性引物及兩條野生型和突變型熒光探針，其序列依次如seqidno：1～4所示。

特異性引物f：5’-cccagggctctttcaagatagtaa-3’(seqidno：1)

特異性引物r：5’-tcaacctcaccagaaaaatcatttc-3’(seqidno：2)

野生型熒光探針：fam-ttgaagacatcagacac-mgb(seqidno：3)

突變型熒光探針：hex-attttgaagacatcaaac-mgb(seqidno：4)

本發(fā)明的rs2066853位點(diǎn)g>a多態(tài)與肺癌發(fā)生相關(guān)，因此所述rs2066853位點(diǎn)基因型的檢測(cè)引物在在肺癌易感性檢測(cè)和/或在制備肺癌易感性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

一種ahr基因編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)rs2066853基因型的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定rs2066853位點(diǎn)的基因型。

優(yōu)選地，步驟s2所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：dna模板2μl，10μm特異性引物各0.25μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl，共10μl。

優(yōu)選地，步驟s2所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選地，所述熒光定量pcr檢測(cè)儀器為abi7900ht型熒光定量pcr儀，其自帶軟件sds(sequencedetectionsystems)v2.3判讀基因型，自動(dòng)分析結(jié)果。

此外，所述檢測(cè)方法在肺癌易感性檢測(cè)和/或在制備肺癌易感性檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

具體地，所述應(yīng)用為利用上述的rs2066853基因型的檢測(cè)方法對(duì)樣本的rs2066853進(jìn)行基因型檢測(cè)，若rs2066853位點(diǎn)為a，則樣本為肺癌易感型。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含上述檢測(cè)rs20668531位點(diǎn)基因型的引物組。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包含有熒光定量pcr所需試劑。

更優(yōu)選地，所述熒光定量pcr所需試劑為taqdna聚合酶，dntp混合液，mgcl2溶液，熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液和去離子水。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還包含有樣本基因組dna提取所需試劑。

更優(yōu)選地，所述試劑盒中還包含有硅膠吸附法提取基因組dna所需耗材。

作為一種優(yōu)選地可實(shí)施方式，本發(fā)明所述肺癌易感性檢測(cè)試劑盒的使用方法如下：

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定rs2066853位點(diǎn)的基因型。

s3.若rs2066853位點(diǎn)的基因型為a，則樣本為肺癌易感型。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：dna模板2μl，10μm特異性引物各0.25μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl，共10μl。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的rs2066853位點(diǎn)基因型檢測(cè)引物特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高。所述檢測(cè)方法可檢測(cè)人群rs2066853位點(diǎn)基因型，評(píng)估攜帶不同基因型的人群肺癌發(fā)生的易感性；檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行、高效，可用于肺癌高危人群的疾病預(yù)防指導(dǎo)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明肺癌易感性檢測(cè)流程圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例各引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖。a位組別1引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖；b為組別2引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖；c為組別3引物組的pcr擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1ahr基因編碼區(qū)rs2066853位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

1、引物設(shè)計(jì)

本實(shí)施通過(guò)比對(duì)ahr基因編碼區(qū)序列，根據(jù)ahr基因上的rs2066853snp位點(diǎn)的上下游序列，設(shè)計(jì)了如下表1所示的擴(kuò)增引物及taqman-mgb探針。

表1

2、熒光定量pcr檢測(cè)

(1)將步驟1設(shè)計(jì)的3對(duì)引物，按照以下熒光定量pcr反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)?？傮w積為10μl，包括dna模板(20ng/μl)2μl，10μm特異性引物對(duì)(兩條)各0.25μl，5μm特異性探針對(duì)(兩條)各0.1μl，(5unit/μl)taqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl2溶液0.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl。

(2)在abi7900ht型熒光定量pcr儀是進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在abi7900ht型熒光定量pcr儀讀取熒光量。

(3)采用abi7900ht型熒光定量pcr儀自帶軟件sds(sequencedetectionsystems)v2.3判讀基因型。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，組別1的引物和探針設(shè)計(jì)良好，能擴(kuò)增出pcr目的產(chǎn)物，可讀取熒光信號(hào)值。而組別2和3的引物探針擴(kuò)增不出目的片段，無(wú)熒光信號(hào)。

實(shí)施例2rs2066853位點(diǎn)檢測(cè)方法在肺癌易感性檢測(cè)中的應(yīng)用

1、dna的提取

對(duì)被檢測(cè)者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)生活飲食習(xí)慣問(wèn)卷表。常規(guī)方法抽取被檢測(cè)者edta抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標(biāo)本的基因組dna。

2、基因分型檢測(cè)

使用實(shí)施例1的檢測(cè)方法，對(duì)被檢測(cè)者dna的ahr基因編碼區(qū)rs2066853多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定該位點(diǎn)的基因型。

3、指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺癌

通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者基因型的分析，出具基因分型檢測(cè)報(bào)告和對(duì)被檢測(cè)者個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告?；蚍中蜋z測(cè)報(bào)告詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者肺癌易感程度的高低以及患病概率大小。個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告以被檢測(cè)者的基因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果，評(píng)估被檢測(cè)這肺癌遺傳易感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)制定出針對(duì)被檢測(cè)者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，包括在飲食習(xí)慣、生活方式生活的改進(jìn)建議等，并為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。

4、結(jié)果

本發(fā)明通過(guò)病例-對(duì)照研究分析ahr基因rs2066853g>a位點(diǎn)與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2066853g>a位點(diǎn)與肺癌發(fā)病密切相關(guān)。表2為此次研究中肺癌和正常對(duì)照人群的基本資料，結(jié)果顯示吸煙、吸煙量和飲酒在病例組和對(duì)照組中的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他因素如年齡、性別、腫瘤家族史等變量在兩組間無(wú)顯著性差異。表3結(jié)果顯示，與gg野生型基因型相比，攜帶ag或aa變異基因型的個(gè)體發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。表明rs2066853g>a位點(diǎn)是肺癌發(fā)病的遺傳易感標(biāo)記物。

表2肺癌和對(duì)照人口學(xué)特征及主要因素的分布

p^a值是雙側(cè)的χ²檢驗(yàn)。

表3rs2066853g>a位點(diǎn)的基因型頻率分布及與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

^a對(duì)照組中，所選取位點(diǎn)的基因型頻率均符合hardy-weinberg平衡(p均>0.05)；^b在logistic回歸模型中的校正因素包括年齡、性別、吸煙、飲酒和家族癌癥史。

實(shí)施例3肺癌易感性檢測(cè)試劑盒

1、一種肺癌易感性檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含以下組分：rs2066853位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物，突變型和野生型熒光探針，taqdna聚合酶，dntp混合液，mgcl2溶液，熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液和去離子水；

引物序列如下：

特異性引物f：5’-cccagggctctttcaagatagtaa-3’(seqidno：1)

特異性引物r：5’-tcaacctcaccagaaaaatcatttc-3’(seqidno：2)

野生型熒光探針：fam-ttgaagacatcagacac-mgb(seqidno：3)

突變型熒光探針：hex-attttgaagacatcaaac-mgb(seqidno：4)

2、所述試劑盒的使用方法

s1.提取待測(cè)樣本dna；

s2.以步驟s1所述dna為模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，確定rs2066853位點(diǎn)的基因型。

s3.若rs2066853位點(diǎn)的基因型為a，則樣本為肺癌易感型。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：dna模板2μl，10μm特異性引物各0.25μl，5μm熒光探針各0.1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.03μl，20mmdntp混合液0.1μl，25mmmgcl20.5μl，5×熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2.37μl，去離子水4.3μl，共10μl。

所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為：50℃2min，95℃10min；92℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)。

sequencelisting

<110>廣州醫(yī)科大學(xué)

<120>一種檢測(cè)rs2066853位點(diǎn)基因型的引物組及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cccagggctctttcaagatagtaa24

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcaacctcaccagaaaaatcatttc25

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttgaagacatcagacac17

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

attttgaagacatcaaac18