本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及小分子rnamirna-146a-5p在評估心肌收縮功能的藥物的制備中的用途、在診斷與心肌收縮功能相關(guān)的疾病的藥物的制備中的用途以及用于所述用途的試劑盒。
背景技術(shù)：
：心力衰竭，簡稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血。心力衰竭并不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是心臟疾病發(fā)展的終末階段。數(shù)據(jù)顯示，超過50歲以后心臟功能開始呈現(xiàn)下降趨勢，主要表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)正常的舒張功能下降，其后隨著年齡的逐漸增大，在同時(shí)合并其他器質(zhì)性心臟疾病，最終發(fā)展為心力衰竭，其一年死亡率為21-30％。根據(jù)2015年中國心血管病報(bào)告，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為44.6％，城市為42.51％。心血管病的疾病負(fù)擔(dān)日漸加重，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。深圳市2015年衛(wèi)生年鑒顯示，心血管疾病作為除腫瘤以外的第二大死因，其中冠心病、心肌梗塞和高血壓心臟病分別排前三位，而這三種疾病的終末期表現(xiàn)均為心力衰竭。只有大約50％的心衰患者被臨床確診，當(dāng)年齡大于70歲，其心衰死亡率高達(dá)90％，心臟衰竭已經(jīng)成為一種老年病。根據(jù)《深圳市部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)2016年前三季度門診住院次均醫(yī)藥費(fèi)用情況表》顯示三甲醫(yī)院住院次均費(fèi)用為14862元(以深圳市人民醫(yī)院為例)，其中，心衰由于其反復(fù)發(fā)作且每次住院治療天數(shù)相較于其他疾病更長，所以給患者及其家屬造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會壓力更大。雖然，目前診斷心衰的公認(rèn)的客觀指標(biāo)為b型利鈉肽和n末端b型利鈉肽原的濃度增高。但是，目前bnp對于各種心血管疾病的診斷仍沒有明確的界值，如對于舒張性心功不全、右心衰竭、老齡患者合并腎功能不全等，還需要個(gè)體化評價(jià)。對于慢性心衰的左室重塑、血管活性肽與bnp的關(guān)系和影響也還有待研究。除此之外，臨床上還會通過臨床指征、心電圖等方法進(jìn)行診斷和評估，然而據(jù)研究，當(dāng)舒張功能開始降低的同時(shí)伴有收縮功能的減弱，但往往被代償肥大的心肌細(xì)胞所掩蓋，造成左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)值正常，會導(dǎo)致臨床診斷率低，確診時(shí)間晚。目前對于衰老心功能的研究主要集中在舒張功能方面，對于早期同時(shí)降低的收縮功能的研究幾乎沒有。所以，尋找能反映心肌收縮力的生物標(biāo)記物，有著及其重要的臨床價(jià)值。外泌體(exosome)，是活細(xì)胞經(jīng)過"內(nèi)吞-融合-外排"等一系列調(diào)控過程而形成的膜性囊泡，來源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體)，直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌體內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及mirna等成分，可以攜帶蛋白，運(yùn)送rna，在細(xì)胞間物質(zhì)和信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。研究表明，來源不同細(xì)胞的外泌體含有源細(xì)胞最關(guān)鍵的功能分子。不同細(xì)胞來源的外泌體所含的蛋白質(zhì)及mirna不同，其生物學(xué)功能也有差異，血液中的外泌體是一種密度很低的固相成分，被認(rèn)為攜帶有豐富的生物標(biāo)志物信息。并且，在人體體液如血清、尿液、組織液等中被外泌體的膜所包裹的rna不會被核酸酶講解，而且不受蛋白，igg等高分豐度蛋白的影響。由于來源于細(xì)胞，外泌體所含的物質(zhì)表征著細(xì)胞中的部分物質(zhì)，也就給檢測細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)與核酸的變化帶來了可能性。目前，可以運(yùn)用組學(xué)手段，通過一定實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方法研究樣品中的蛋白質(zhì)、dna及rna，對比正常個(gè)體的樣品數(shù)據(jù)，找到疾病特異性的的分子標(biāo)志物，為疾病的早期診斷、病因分析、治療靶點(diǎn)、預(yù)后情況等提供重要基礎(chǔ)和依據(jù)。近年來，已經(jīng)有許多疾病，包括某些腫瘤，可以通過對患者血清中的外泌體的檢測，實(shí)現(xiàn)早期診斷，同時(shí)為療效判斷和預(yù)后提供重要依據(jù)。在臨床診斷實(shí)踐中，檢測核酸標(biāo)記物具有靈敏度高、特異性好、可精確定量的特點(diǎn)，很適合作為早期診斷的標(biāo)志物。microrna(mirna)是一類內(nèi)生的、長度約20-24個(gè)核苷酸的小rna，幾個(gè)mirnas也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因?？梢酝ㄟ^幾個(gè)mirnas的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。因此，具保守估計(jì)，約60％～70％的人類蛋白編碼基因受mirna的調(diào)控，單個(gè)mirna分子能夠與數(shù)百個(gè)功能各異的靶mrna相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與了哺乳動(dòng)物幾乎所有的病理和生理活動(dòng)，如個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。根據(jù)mitchell等人2008年的研究，mirna能以一種非常穩(wěn)定的形式存在于人體血漿中，以保護(hù)其免受內(nèi)源性rnase的降解。同時(shí)，chen等通過高通量測序技術(shù)對血清中mirna進(jìn)行了分析，在男、女性健康人血清中分別發(fā)現(xiàn)了100和90種血清mirna，且在惡劣條件(如高溫、極低或極高的ph環(huán)境、多次凍融)下仍能保持穩(wěn)定，而此時(shí)大多數(shù)rna都已降解。此外，對正常人和不同疾病患者血清/血漿中mirna檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mirna廣泛存在于正常人和患者的血清/血漿中，并且隨著生理狀況、疾病種類和病程不同，mirna的表達(dá)譜將發(fā)生特異性變化。如，有大量研究表明，在急性心肌梗死動(dòng)物模型和心肌梗死患者血漿中心肌特異性mirna-133會顯著升高；近年來國內(nèi)有關(guān)研究表明，急性心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞的mirna-1表達(dá)水平明顯升高，并且冠脈病變程度越大，心肌缺血越嚴(yán)重，mirna-1表達(dá)水平越高，mirna-1和心肌梗死后心肌缺血程度存在顯著相關(guān)性。血液中的外泌體被認(rèn)為攜帶有豐富的生物標(biāo)記物信息，來源于不同細(xì)胞的外泌體含有能提示源細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子，因此，體液中的外泌體在臨床診斷中的意義越來越被人們重視。這也提示我們，可以尋找人類心肌收縮力下降時(shí)表達(dá)量有明顯改變的mirna標(biāo)記物，并以此作為生物標(biāo)記物對心肌細(xì)胞的收縮功能進(jìn)行評估。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供評估心肌收縮功能、診斷與心肌收縮功能相關(guān)的疾病的簡單快捷的方法以及相關(guān)藥物。在第一方面，本發(fā)明提供了小分子rnamirna-146a-5p在評估受試者心肌收縮功能的藥物的制備中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內(nèi)的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述藥物用于定量檢測所述小分子rnamirna-146a-5p的表達(dá)量。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述藥物包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設(shè)計(jì)的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉(zhuǎn)錄的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。在第二方面，本發(fā)明提供了小分子rnamirna-146a-5p在診斷受試者心臟衰竭的藥物的制備中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內(nèi)的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述藥物用于定量檢測所述小分子rnamirna-146a-5p的表達(dá)量。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述藥物包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設(shè)計(jì)的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉(zhuǎn)錄的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。在第三方面，本發(fā)明提供了用于評估心肌功能的試劑盒，其中所述試劑盒包含定量檢測mirna-146a-5p的表達(dá)量進(jìn)行的試劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內(nèi)的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述試劑包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設(shè)計(jì)的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉(zhuǎn)錄的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。有益效果：1.相對傳統(tǒng)的心臟功能檢查，如臨床指征、超聲影像和實(shí)驗(yàn)室檢查，本發(fā)明具有取材方便、操作簡單、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，并且能在心臟代償期檢測到心肌收縮功能的下降。本發(fā)明通過對心肌收縮功能個(gè)性化的評估，有望實(shí)現(xiàn)心衰的早診斷早治療，提高心衰診斷率，從而改善心血管疾病或發(fā)生心衰患者的預(yù)后情況。2.本發(fā)明檢測血清/血漿中的穩(wěn)定的mirna，而傳統(tǒng)方法檢測的分子標(biāo)記物是蛋白多肽。在定量檢測方面，mirna的定量精度和靈敏度非常高，使用rt-pcr技術(shù)可以達(dá)到分子身段檢測的能力；傳統(tǒng)方法檢測蛋白多肽的精準(zhǔn)度和靈敏度都較差。3.傳統(tǒng)標(biāo)記物可由多種細(xì)胞分泌，在不同生理病理狀態(tài)下，都有可能發(fā)生改變，需要進(jìn)行其他的檢查；本發(fā)明特異性更強(qiáng)，能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。附圖說明通過以下參照附圖對本發(fā)明實(shí)施例的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將更為清楚，在附圖中：圖1顯示利用qpcr驗(yàn)證心衰病人血液中外泌體來源的mirna-146a-5p的表達(dá)情況；圖2顯示外泌體來源和血液來源的mirna-146a-5p在心衰患者、心臟其他疾病和正常人的表達(dá)情況，其中a：血清來源的mirna-146a-5p；b：外泌體來源的mirna-146a-5p；圖3顯示利用roc曲線分析mirna-199a區(qū)分心功能正常組和心衰組時(shí)的敏感性和特異性。具體實(shí)施方式以下基于實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，但是本發(fā)明并不僅僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1實(shí)時(shí)熒光定pcr(qpcr)驗(yàn)證mirna的差異表達(dá)所述mirna-146a-5p是血液外泌體來源的mirna-146a-5p，其序列為seqidno：1tgagaactgaattccatgggtt基于seqidno：1設(shè)計(jì)了以下用于qpcr(熒光定量)的引物：正向引物seqidno：2ccgatgtgtatcctcagctttg反向引物seqidno：3gacagagatatcccagctgaag。選擇心衰患者組、疾病對照組和正常對照組各50例樣本進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：1.1rna提取1.1.1外泌體的分離與純化(1)全血3000*g離心15min，移去細(xì)胞和細(xì)胞碎片；(2)取上層液體移入離心管，加入適量exoquick試劑，4℃下反應(yīng)30min；優(yōu)選250μl血清中加入63μlexoquick試劑；(3)1500*g離心混合液30min(exosome沉于管下)；(4)吸出上清，離心1500*g5min吸出所有上清(不能震動(dòng)離心管)；(5)用250μlpbs溶解全部沉淀，-80℃保存。1.1.2總rna的提?、偌尤雝rizol，劇烈震蕩1min，室溫保存10min；②加氯仿0.2ml，劇烈震蕩1min，充分混勻，室溫下放置3min-5min；③4℃，12000rpm高速離心15min后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管中,注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積異丙醇，1-2ul糖原，充分顛倒混勻，于-20℃保存6小時(shí)以上(保持離心管豎直狀態(tài))；④4℃，12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液；⑤按1ml/mltrizol的比例加入75％depc冷乙醇洗滌沉淀(-20℃保存)，洗滌沉淀物，充分混合均勻，靜置10min，4℃，12000rpm高速離心10min，棄掉上清液，重復(fù)一遍操作；⑥室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入10uldepc水溶解沉淀；⑦用nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測定rna純度及濃度，凍存于-80℃或直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。1.2反轉(zhuǎn)錄37℃孵育1h。然后反應(yīng)管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特異性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷rna和引物的二級結(jié)構(gòu)。42℃孵育1h。將反轉(zhuǎn)錄好的樣品進(jìn)行10倍稀釋后-20℃?zhèn)溆谩?.3qpcr反應(yīng)采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對定量，結(jié)果如圖1所示，與心臟其他疾病患者相比，mirna-146a-5p在心衰患者血液中的含量低，同rna-sep結(jié)果一致。1.3.1qpcr體系和程序如下：1.3.2跑膠檢驗(yàn)8％page膠的配制：試劑8％page雙蒸水15.46ml30％聚丙烯酰胺4ml50×tae400μl10％aps140μltemed7μl跑膠條件：160v，25-30min凝膠成像：電泳完成后，從電泳槽中取下膠板，輕輕撬開兩塊玻璃板，并小心將page膠剝離，放入凝膠成像儀中，用核酸染料稀釋液(1:1000)涂抹均勻，孵育5min，凝膠成像。拍照、結(jié)果分析1.4結(jié)果圖1.與正常組相比，mirna-146a-5p心衰患者組的外泌體中的含量低，同rna測序的結(jié)果一致(*p<0.05vs正常組)。圖2.與心臟其他疾病組相比，mirna-146a-5p心衰患者組的外泌體和血液中含量均降低，同rna測序的結(jié)果一致(*p<0.05vs正常組；#p<0.05vs疾病對照組)，但是，外泌體的降低幅度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清中的降低程度，說明外泌體可以很好的指示心衰患者的疾病發(fā)生情況。實(shí)施例2：分析mirna對心力衰竭的診斷以上述外泌體來源的mirna-146a-5p為研究對象，將對照組和心衰患者組敏感性和特異性上做比較，以心衰病人為實(shí)驗(yàn)組，心臟其他疾病作為對照組(各組臨床指標(biāo)參見表1)。表1各組臨床指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表*p<0.05vs正常組首先利用exoquic試劑來提取血漿中的外泌體。選用50例心衰血漿樣本，50例心臟其他疾病患者血漿樣本進(jìn)行外泌體提取，然后進(jìn)行外泌體內(nèi)mirna-146a-5pqpcr實(shí)驗(yàn)，求得各標(biāo)本ct值，利用roc曲線分析顯示，mirna-146a-5p在區(qū)分心衰組和非心衰組時(shí)，其auc值為0.897，最佳臨界點(diǎn)時(shí)的敏感性為81％、特異性為86％(見圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外泌體中mirna作為潛在的診斷標(biāo)志物的靈敏性和特異性都好于血漿組。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有各種改動(dòng)和變化。凡在本發(fā)明的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>深圳大學(xué)<120>小分子rnamirna-146a-5p在相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)診斷中的應(yīng)用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人類序列<400>1tgagaactgaattccatgggtt22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2ccgatgtgtatcctcagctttg22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gacagagatatcccagctgaag22當(dāng)前第1頁12