專利名稱：原位雜交技術(shù)優(yōu)化及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)屬于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷 酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子 的特點(diǎn)，應(yīng)帶有標(biāo)記的(有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性 物質(zhì))DAN或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸。(RNA或DNA)片段進(jìn) 行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DAN的存 在與定位；用原位雜交術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有 很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。目前原位雜交技術(shù)還存在假陽性、表達(dá)不夠穩(wěn)定等一些問題。只能通過尋找到適 合的參數(shù)和反應(yīng)過程才能夠得到穩(wěn)定的結(jié)果。本發(fā)明通過長期的實(shí)驗(yàn)得到滿足條件的反應(yīng) 條件，具有低假陽性、重復(fù)性高等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是優(yōu)化原位雜交技術(shù)，提高實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的靈敏度和準(zhǔn)確度，進(jìn)而為細(xì) 胞生物學(xué)和分子生物學(xué)提供可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。原位雜交實(shí)驗(yàn)優(yōu)步驟如下1.雜交引物合成1)200叫雙鏈0嫩(1“1)和7. 5ng隨機(jī)引物(1 μ 1)混合后置于印pendorf管內(nèi)， 水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘；2)與此同時(shí)，盡快在一置于冰浴中的0. 5ml印pendorf管內(nèi)混合下列化合物· 20mmol/L DTT 1 μ 1·未標(biāo)記的dNTP溶液1 μ 1· IOX隨機(jī)標(biāo)記緩沖液1 μ 1· [α-32P]dATP(比活性> 3000Ci/mmol ;10μ Ci/μ 1)3μ 1· ddH20 1 μ 13)將步驟(1)印pendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。4)加入5單位(約1 μ DKlenow片段，充分混合，在微型離心機(jī)中以12000g離心 1-2秒，使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3-16小時(shí)。5)在反應(yīng)液中加入10μ 1緩沖液A后，將放射性標(biāo)記的探針保存在-20°C下備用。 同時(shí)計(jì)算放射比活性。2.固定、后固定和脫水實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌流固定后，再將其置于 4%多聚甲醛溶液中后固定7個(gè)小時(shí)4°C后固定，隨后將其置于30%蔗糖溶液直至實(shí)驗(yàn)材料 沉底；
3.切片標(biāo)本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避 免mRNA降解，又能保持良好的組織形態(tài)；4.預(yù)雜交1)每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60°C水浴5分鐘，避免振蕩。
2)用等體積的HYB+取代HYB-。3) 60°C水浴，預(yù)雜交4小時(shí)以上。5.雜交1)吸去預(yù)雜交的HYB+，加上IOOul已加入探針的HYB+溶液(探針濃度約為Ing/ ul)；2)60°C 溫浴過夜；3)將探針回收，放于-20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)；4)加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60°C，放置30分鐘，重復(fù)一次；5)置換 2XSSCTlml，60°C，放置 15 分鐘；6)置換 0. 2XSSCTlml，60°C，放置 30 分鐘，重復(fù)一次；7)用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)；8)室溫下加Iml 1:2: 7溶液，時(shí)間為一小時(shí)；9)按1 3000的比例在1 2 7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C冰箱過夜；10)用Iml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然 后用ImlMABT置換，25分鐘，再用ImlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，最后用ImlMABT溶液置 換，25分鐘；11)用Iml ImM左旋米唑的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘；12)將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate (底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室 溫下顯色；13)每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開始顯色；14)將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定， 拍照；15) 4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制1. PBS NaCl 8gKCl 0. 2gNa2HPO4 1. 44gKH2PO4 0. 24gDEPC H2O ILHCl 調(diào) PH 值至 7· 4抽濾，滅菌2. 4%多聚甲醛PBS IL
加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。-20°C保存3. PBST PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0. 1 % ；4. 20XSSC Na3Citrate 2H20 88. 2gNaCl 175. 5gDEPC H20 至 1L抽濾，滅菌5. SSCT SSC加上Tween-20使其終濃度為0. 1 %6. HYB-甲酰胺20XSSC儲(chǔ)液DEPC水=2 1 1配制加入Tween-20使其終濃度為0. 1 %，-20c保存7. HYB+ HYB-20mlyeast RNA 10mgheparin lmg。-20°C 保存。8. MAB maleic acid 11. 6gNaCl 8. 8g用固體 NaOH(約 7g)調(diào)至 Ph = 7. 54°C 保存9. MABTMAB加上Tween-20使其終濃度為0. 1 %10. 10% blocking reagent blocking reagent 8gMAB 72ml11. 1 2 7 溶液滅活羊血清10%BM blocking reagent MABT = 1:2:7用時(shí)現(xiàn)配12. Staining buffer Tris 12. lgpH9. 5Mgcl2 6H20 10. 2g,13. Nacl 5. 85gTween-20 lml,用之前加1M的左旋咪唑儲(chǔ)液，使之終濃度為ImM。
權(quán)利要求
一種優(yōu)化的原位雜交方法，其特征在于通過增加實(shí)驗(yàn)材料的后固定和脫水等實(shí)驗(yàn)步驟，以及在雜交引物合成、固定、后固定和脫水、切片、預(yù)雜交、雜交反應(yīng)步驟中應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)，提高了原位雜交的靈敏度和降低了假陽性的出現(xiàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的原位雜交方法，所述預(yù)雜交的步驟為1)每個(gè)管中置換成大約300ulHYB-溶液，60°C水浴5分鐘，避免振蕩。2)用等體積的HYB+取代HYB-。3)60°C水浴，預(yù)雜交4小時(shí)以上。
3.如權(quán)利要求1所述的優(yōu)化的原位雜交方法，所述固定、后固定和脫水的步驟為實(shí)驗(yàn) 材料經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌流固定后，再將其置于4%多聚甲醛溶液中后固定7個(gè)小時(shí)4°C 后固定，隨后將其置于30%蔗糖溶液直至實(shí)驗(yàn)材料沉底。
全文摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化后的原位雜交技術(shù)以及在生物研究中的應(yīng)用，屬于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。由于傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)存在著不穩(wěn)定性、可重復(fù)性差以及假陽性等缺點(diǎn)。本發(fā)明根據(jù)傳統(tǒng)的原位雜交實(shí)驗(yàn)的原理和技術(shù)為藍(lán)本，通過長期對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件的準(zhǔn)確觀察研究，提出了優(yōu)化方案首先對(duì)原位雜交實(shí)驗(yàn)中所需的引物設(shè)計(jì)提出了新的參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)；其次，在原位雜交實(shí)驗(yàn)中，固定、后固定與切片、預(yù)雜交、以及原位雜交等實(shí)驗(yàn)流程中，提出了創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)流程和反應(yīng)參數(shù)。本發(fā)明拓展了傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)，為分子生物學(xué)和基因組學(xué)的研究提供了一個(gè)更可行、更準(zhǔn)確的方案。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101805781SQ200910008920
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者呂麗娟, 席超, 王丹, 王燕偉 申請(qǐng)人:王燕偉;王丹;席超;呂麗娟