本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別重樓品種的試劑盒及鑒別方法。

背景技術(shù)：

重樓parisl.為百合科(liliaceae)多年生草本植物，《中國(guó)植物志》英文版中記載重樓屬植物全世界約有40多個(gè)種及變種，主要分布在亞歐大陸的熱帶及溫帶地區(qū)，我國(guó)有22個(gè)種，主要分布在云南、貴州、四川等西南地區(qū)。重樓屬植物經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著，在我國(guó)民間具有悠久的藥用歷史，最早以“蚤休”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，“治驚風(fēng)，搖頭弄舌，熱氣在腹中，癲疾，癰瘡陰蝕，下三蟲，去毒蛇”，其基源為重樓屬多種植物。

重樓作為多基源藥材，藥用重樓的基源一直比較混亂，由于重樓屬不同種植物的根莖形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)極近似，各品種特征性狀交叉重疊，界限模糊不清，給重樓藥用植物鑒定帶來困難。鑒于重樓屬不同種在藥用成分甾體皂甙的種類、含量等方面存在顯著的差異，療效也有很大差異，不同品種的重樓混用將給中醫(yī)產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量控制帶來極大隱患。

四川地區(qū)分布的重樓品種也正是如此，其中，華重樓(parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch).hara)是四川省的廣布種，并被收載于2015年版中國(guó)藥典作為重樓藥材的正品基源植物之一，另外，球藥隔重樓(parisfargesii)和黑籽重樓(p.thibetica)也被認(rèn)為有顯著的藥用價(jià)值而被收載與2014版《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》。但考察發(fā)現(xiàn)，作為重樓藥材的人工栽培品種還包括多葉重樓(p.polyphyllavar.polyphylla)、五指蓮(p.axialis)、平伐重樓(p.vaniotii)，狹葉重樓(p.mairei)、毛重樓(p.mairei)、長(zhǎng)藥隔重樓(p.polyphyllavar.pseudothibetia)等混雜栽培種，品種十分混亂。因此，對(duì)重樓植物進(jìn)行準(zhǔn)確快速的鑒定迫在眉睫。

由于遺傳基因具有相對(duì)穩(wěn)定性，不宜受到環(huán)境的影響發(fā)生改變，且不受植物生長(zhǎng)時(shí)期，生長(zhǎng)部位的影響，因此近年來廣泛使用分子生物學(xué)手段進(jìn)行中藥材鑒定。已有的報(bào)道中，研究者們均是通過dna條形碼序列對(duì)重樓屬品種進(jìn)行鑒定(見朱英杰，方海南重樓屬dna條形碼篩選與鑒定方法的研究[d].西南交通大學(xué).2010；姜藜等，基于its全序列分析的重樓常見混偽品鑒定研究[j].中國(guó)新藥雜志,2013,22(20):2439～2444；方海蘭等，基于dna條形碼的中藥材種子種苗鑒定研究—以重樓為例[j].中藥材材,2016,35(5):986～990)，需要在pcr反應(yīng)后進(jìn)行產(chǎn)物回收測(cè)序等步驟，不僅操作繁瑣費(fèi)時(shí)，而且測(cè)序成本高，不利于推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別重樓品種的試劑盒及其鑒別方法。

本發(fā)明提供了一種鑒別重樓品種的試劑盒，它包含1-3對(duì)引物，引物對(duì)選自：seqidno：1～2所示的引物對(duì)1，seqidno：3～4所示的引物對(duì)2，seqidno：5～6所示的引物對(duì)3。

h-f(seqidno：1)：gcgcccgatgtcattcga

h-r(seqidno：2)：tttcaacccacaggcgtagtcc

qyg-f(seqidno：3)：ggaacgagtatgtgaatgtgacccat

qyg-r(seqidno：4)：ctacgttcttcatcgatacgggtt

hz-f(seqidno：5)：taggcgtggcacggcgt

hz-r(seqidno：6)：caacactttcgaccaacggga

本發(fā)明提供了一種快速鑒別重樓品種的方法，步驟如下：

a、提取樣本dna：提取待檢樣本的dna；

b、基因擴(kuò)增：用上述試劑盒對(duì)待檢樣本的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

c、結(jié)果檢測(cè)：對(duì)dna擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

其中，所述重樓品種為華重樓、黑籽重樓、球藥隔重樓和/或長(zhǎng)藥隔重樓。

其中，步驟a中，所述待檢樣本為華重樓、黑籽重樓、球藥隔重樓、長(zhǎng)藥隔重樓、多葉重樓、五指蓮、平伐重樓、狹葉重樓、毛重樓、南重樓。

其中，步驟b中，所述pcr擴(kuò)增的條件為：

95℃預(yù)變性30s；

94℃變性30s，64～66℃退火30s，72℃延伸20s；27～29個(gè)循環(huán)；

72℃延伸1min；

優(yōu)選地，所述退火的溫度為66℃，循環(huán)的次數(shù)為28次。

其中，步驟b中，所述pcr擴(kuò)增的體系為：

總體積為25μl時(shí)：

10×taqbuffer2.5ul，dntp0.5ul，模板30～50ng，

seqidno：1～6引物的用量分別為1μm、1μm、0.5μm、0.5μm、75nm、50nm，其余為ddh2o；

優(yōu)選地，模板用量為30ng。

其中，步驟c中，所述檢測(cè)采用的方法為凝膠電泳。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒在鑒別重樓各品種中的用途。

其中，所述重樓品種為華重樓、黑籽重樓、球藥隔重樓和/或長(zhǎng)藥隔重樓。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒在鑒別華重樓、黑籽重樓、球藥隔重樓及其混偽品中的用途；

其中，所述混偽品為長(zhǎng)藥隔重樓、多葉重樓、五指蓮、平伐重樓、狹葉重樓、毛重樓、南重樓。

本發(fā)明提供的試劑盒和方法，可以準(zhǔn)確、有效的鑒別川產(chǎn)重樓藥材基源植物華重樓、球藥隔重樓、黑籽重樓與其他同屬近緣易混種，還可以鑒別長(zhǎng)藥隔重樓品種；實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)反應(yīng)管中一次性檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的目的，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，高效快速，成本低，為重樓屬藥材的鑒別及利用提供可靠依據(jù)，應(yīng)用前景良好。

(有益效果部分層層遞進(jìn))

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為重樓不同部位提取效率結(jié)果圖(a)及通用引物its-4/its-l對(duì)樣品模板擴(kuò)增的結(jié)果圖(b)；

其中，h.華重樓；qyg.球藥隔重樓；hz.黑籽重樓；cgy.長(zhǎng)藥隔重樓；wzl.五指蓮重樓；pf.平伐重樓；dy1,多葉重樓1；dy2.多葉重樓2；dy3.多葉重樓3；dy4.多葉重樓4；dy5.多葉重樓5；xy1狹葉重樓1；xy2.狹葉重樓2；m.毛重樓；n.南重樓。

圖2為引物濃度考察電泳圖；

圖3為華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓及其常見混雜栽培種多重pcr鑒別電泳圖；其中，nc.陰性對(duì)照；h.華重樓；qyg.球藥隔重樓；hz.黑籽重樓；cgy.長(zhǎng)藥隔重樓；wzl.五指蓮重樓；pf.平伐重樓；dy1,多葉重樓1；dy2.多葉重樓2；dy3.多葉重樓3；dy4.多葉重樓4；dy5.多葉重樓5；xy1狹葉重樓1；xy2.狹葉重樓2；m.毛重樓；n.南重樓。

具體實(shí)施方式

下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1本發(fā)明區(qū)分重樓品種的方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.藥材

本次實(shí)驗(yàn)采集來自16個(gè)產(chǎn)地的華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓極其常見混雜栽培種共計(jì)62份，其中包括華重樓9份，黑籽重樓7份，球藥隔重樓11份，多葉重樓5份，毛重樓3份，狹葉重樓4份，平伐重樓5份，五指蓮重樓7份，長(zhǎng)藥隔重樓5份，南重樓2份。實(shí)驗(yàn)材料樣本數(shù)及采集地見表1。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)尹鴻翔副教授鑒定。剩余樣品保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

2.試劑

瓊脂糖，goldviewi型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；easytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer，dntpsmixture(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；植物組dna提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)，α-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。

3.儀器

legendmicro21r離心機(jī)(美國(guó)thermo)；bsa124s分析天平(sartorius科學(xué)儀器有限公司)；mk-10干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；pcr儀(杭州博日科技有限公司)；ddy-12電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；激光成像儀typhoon7000(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科技部)。

表1實(shí)驗(yàn)樣品信息

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.dna基因組提取

葉片樣品硅膠干燥，取20mg，用植物組dna提取試劑盒進(jìn)行dna提取。根莖樣品75℃烘干，打粉，過3號(hào)篩，取20mg粉末,按照植物組dna提取試劑盒說明書進(jìn)行改進(jìn)，加蛋白酶的同時(shí)添加20μl的75％α-高聚淀粉酶；

種子取1粒，烘干，磨成細(xì)粉，照植物組dna提取試劑盒說明書進(jìn)行改進(jìn)，加蛋白酶的同時(shí)添加30μl的75％α-高聚淀粉酶；由于種子較小，過柱純化后加入50μl洗脫獲得dna。

dna提取物用通用引物its-4/its-l進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物取7.5μl，采用2％的瓊脂糖凝膠，在電壓150～180v下電泳5min，在凝膠成像儀下觀察，驗(yàn)證提取質(zhì)量。通用引物序列及pcr擴(kuò)增方法見表2。

實(shí)驗(yàn)樣品用變色硅膠干燥，密封袋密封存放于-20℃冰箱。

2.its測(cè)序及特異性引物設(shè)計(jì)及篩選

對(duì)提取的重樓樣品dna模板用通用引物its-4/its-l進(jìn)行its序列擴(kuò)增，每個(gè)樣品平行擴(kuò)增3次，擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用megalign軟件進(jìn)行序列校對(duì)并分析，找出具有穩(wěn)定差異的snp位點(diǎn)，用pirmerpermier5.0軟件在華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓的特有snp位點(diǎn)區(qū)域分別設(shè)計(jì)特異性引物，并用設(shè)計(jì)的引物對(duì)重樓樣品dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，篩選出特異性好，能夠準(zhǔn)確區(qū)分三個(gè)法定品種并能有效鑒別其他常見偽品的3對(duì)引物。分別命名為h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r。

引物序列由擎科梓熙生物科技有限公司合成。

2.3pcr反應(yīng)

用篩選后的3對(duì)特異性引物進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物采用2％的瓊脂糖凝膠，在電壓150～180v下電泳7min，在凝膠成像儀下觀察。

3對(duì)特異性引物序列及pcr擴(kuò)增方法見表2。

表2引物及pcr反應(yīng)條件

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.重樓不同部位提取dna及通用引物its-4/its-l對(duì)樣品模板擴(kuò)增的結(jié)果

對(duì)重樓的根莖，葉及種子進(jìn)行了dna提取并用通用引物its-4/its-l進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示重樓的根莖，葉及種子都有明顯的條帶，表明該提取方法效果良好。通用引物its-4/its-l對(duì)樣品模板擴(kuò)增的結(jié)果表明模板dna的質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.多重pcr鑒別不同重樓品種

用已經(jīng)確立的dna提取方法、多重pcr體系及反應(yīng)條件對(duì)收集的重樓品種進(jìn)行鑒別，結(jié)果見圖3。

可見，華重樓有兩條長(zhǎng)度不等，明暗相似的條帶，球藥隔重樓有一條在marker250bp和100bp之間的條帶，黑籽重樓有一條在500bp和250bp之間的條帶，長(zhǎng)藥隔重樓有一條亮帶和兩條大小不同的暗帶，可以與上述三個(gè)重樓有明顯區(qū)分，其余重樓樣品均沒有條帶。

因此，本發(fā)明方法可準(zhǔn)確有效鑒別華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓極其常見混雜栽培種。

以下通過試驗(yàn)例具體說明本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)例1本發(fā)明pcr引物的篩選

1、特異性引物的設(shè)計(jì)

用pirmerpermier5.0軟件在華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓的特有snp位點(diǎn)區(qū)域分別設(shè)計(jì)特異性引物，并用設(shè)計(jì)的引物對(duì)重樓樣品dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的各引物見表3。

表3設(shè)計(jì)的各引物序列

2、pcr擴(kuò)增

pcr反應(yīng)體系及擴(kuò)增結(jié)果見表4-13。

pcr擴(kuò)增條件：94℃30sx℃30s72℃20s28cycle72℃后延伸2min。其中，x為退火溫度，具體見下述各表格中溫度。

表4初步驗(yàn)證引物的特異性

表5qyg-f1/qyg-r1、hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1引物組合的鑒別結(jié)果

表6qyg-f1/qyg-r2、hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1引物組合的鑒別結(jié)果

表7hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表8hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表9hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表10h-f1/h-r1與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表11h-f1/h-r1、qyg-f2/qyg-r7與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表12h-f1/h-r1、hz-f3/hz-r3與其它不同引物組合的鑒別結(jié)果

表13兩種引物組合的鑒別結(jié)果

可見，僅在h-f2/h-r2，qyg-f2/qyg-r8，hz-f3/hz-r3組合時(shí)，能夠通過pcr擴(kuò)增準(zhǔn)確區(qū)分三個(gè)法定品種(華重樓、球藥隔重樓和黑籽重樓)并能有效鑒別其他常見偽品，其它引物組合均不能有效區(qū)分。因此，選擇該引物組合，并將其分別命名為h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r。

試驗(yàn)例2本發(fā)明pcr引物濃度及反應(yīng)條件的優(yōu)化

一、實(shí)驗(yàn)方法

用特異性引物h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件根據(jù)引物的tm和擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度初步定為95℃解鏈30s；94℃變性30s；64℃退火30s；72℃延伸20s；循環(huán)28次；72℃后延伸1min。在該條件下對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化后的pcr體系下對(duì)pcr擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。

本發(fā)明對(duì)引物濃度、pcr循環(huán)數(shù)、退火溫度，模板量四個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化

①h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r三組引物濃度組合：

0.25μm/0.25μm，0.25μm/0.25μm，0.125μm/0.125μm；

0.5μm/0.5μm，0.5μm/0.5μm，0.25μm/0.25μm；

0.5μm/0.5μm，0.5μm/0.5μm，0.125μm/0.125μm；

1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，0.125μm/0.125μm；

1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，75nm/50nm；。

②退火溫度：58，59，60，62，64，65，66，67。

③循環(huán)數(shù)：26，27，28，29，30。

④模板量：10ng，20ng，30ng,40ng,50ng。

取7.5μl擴(kuò)增產(chǎn)物采用2％的瓊脂糖凝膠，在電壓150～180v下電泳7min，在凝膠成像儀下觀察。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、引物濃度優(yōu)化

結(jié)果見圖2。

可見，當(dāng)加入的三種引物濃度組合為1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，75nm/50nm時(shí)，華重樓有兩條明顯的長(zhǎng)度分別為86bp和271bp的條帶，球藥隔重樓有一條長(zhǎng)度為121bp的條帶，黑籽重樓有一條長(zhǎng)度為339bp的條帶，可準(zhǔn)確鑒別重樓品種。

而其它濃度組合下，要么條帶亮度太弱，要么引物用量較高，綜合考慮節(jié)約引物用量和條帶亮度及條帶特異性，選擇本發(fā)明的引物濃度組合。

2、不同退火溫度、循環(huán)數(shù)、模板量的擴(kuò)增結(jié)果見表14。

可見，退火溫度在58℃～62℃時(shí)各重樓品種存在無法鑒別的非特異性擴(kuò)增，退火溫度在64℃～66℃時(shí)華重樓，球藥隔重樓及黑籽重樓都有鑒別條帶，而其它重樓均無條帶。為了保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，選擇退火溫度為66℃。

pcr循環(huán)數(shù)在27～30時(shí)，三種川產(chǎn)重樓藥材基源植物(華重樓、球藥隔重樓、黑籽重樓)都能擴(kuò)增出鑒別條帶，其中，循環(huán)數(shù)在28～29時(shí)，三種重樓藥材的鑒別條帶較亮，循環(huán)數(shù)在30時(shí)，有非特異性擴(kuò)增。

為了保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，選擇循環(huán)數(shù)為28個(gè)循環(huán)。

模板量在30ng～50ng時(shí)，三種重樓藥材都能擴(kuò)增出條帶，其他重樓除了長(zhǎng)藥隔有三條明顯可以與三種重樓藥材相區(qū)別的條帶外，都沒有非特異性擴(kuò)增。

因此，多重pcr的反應(yīng)體系選擇：

25μl體系中：10×taqbuffer2.5ul；dntp0.5ul；h-f/h-r各1μm；qyg-f/qyg-r各0.5μm；hz-f75nm；hz-r50nm；模板1ul(≈30ng)；其余為ddh2o。

多重pcr的反應(yīng)條件選擇：

95℃解鏈30s；94℃變性30s；66℃退火30s；72℃延伸20s；循環(huán)28次；72℃后延伸1min。

表14pcr條件優(yōu)化

注：“+”.一條亮帶；“δ”。一條暗帶；“－”.無條帶。

綜上，本發(fā)明提供的試劑盒和方法，可以準(zhǔn)確、有效的鑒別川產(chǎn)重樓藥材基源植物華重樓，球藥隔重樓，黑籽重樓與其他同屬近緣易混種，還可以鑒別長(zhǎng)藥隔重樓，實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)反應(yīng)管中一次性檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的目的，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，高效快速，成本低，為重樓屬藥材的鑒別及利用提供可靠依據(jù)，應(yīng)用前景良好。

sequencelisting

<110>成都中醫(yī)藥大學(xué)

<120>一種快速鑒別重樓品種的試劑盒

<130>gy041-17p1191

<160>26

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>h-f引物

<400>1

gcgcccgatgtcattcga18

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>h-r引物

<400>2

tttcaacccacaggcgtagtcc22

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>qyg-f引物

<400>3

ggaacgagtatgtgaatgtgacccat26

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>qyg-r引物

<400>4

ctacgttcttcatcgatacgggtt24

<210>5

<211>17

<212>dna

<213>hz-f引物

<400>5

taggcgtggcacggcgt17

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>hz-r引物

<400>6

caacactttcgaccaacggga21

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>its上游引物

<400>7

tcctccgcttattgatatgc20

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>its下游引物

<400>8

tcgtaacaaggtttccgtaggtc23

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>hz-f1引物

<400>9

catcccactcttcaacctaccgtgt25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>hz-f2引物

<400>10

catcccactcttcaacctaccgtct25

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>hz-f4引物

<400>11

taggcgtggcacggagt17

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>hz-r1引物

<400>12

ctcggtgccaactactcccgtt22

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>hz-r2引物

<400>13

ctcggtgccaactactcccgat22

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>hz-r4引物

<400>14

caacactttcgaccaacggaa21

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>hz-r5引物

<400>15

tcccactcttcaacctaccgtgt23

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>qyg-f1引物

<400>16

agggttcgtcccgaagccaag21

<210>17

<211>26

<212>dna

<213>qyg-f3引物

<400>17

ggaacgagtatgtgaatgtgaccctt26

<210>18

<211>26

<212>dna

<213>qyg-r1引物

<400>18

ctacatcggctaatgacaatgggtca26

<210>19

<211>26

<212>dna

<213>qyg-r2引物

<400>19

ctacatcggctaatgacaatgggtga26

<210>20

<211>26

<212>dna

<213>qyg-r3引物

<400>20

ttactctgcgaaacataagaccacta26

<210>21

<211>26

<212>dna

<213>qyg-r4引物

<400>21

ttactctgcgaaacataagaccacaa26

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>qyg-r5引物

<400>22

gcccccgagcctttagaggt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>qyg-r6引物

<400>23

gcccccgagcctttagagat20

<210>24

<211>24

<212>dna

<213>qyg-r7引物

<400>24

ctacgttcttcatcgatacgggat24

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>h-f1引物

<400>25

gctaggcaacgcgtacagcat21

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>h-r1引物

<400>26

gcgaactacgcctgtgggat20