發(fā)明領(lǐng)域：本發(fā)明公開(kāi)一種cpne3基因作為預(yù)測(cè)診療急性心肌梗死標(biāo)記物的用途，涉及外周血急性心肌梗死標(biāo)志物檢測(cè)及其應(yīng)用，屬于疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)評(píng)估，基因診斷和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。發(fā)明背景：心肌梗死是一種以高發(fā)病率和高死亡率為特點(diǎn)的全球性疾病。全球每年超過(guò)300萬(wàn)人新患st段抬高型心肌梗死，超過(guò)400萬(wàn)人新患非st段抬高型心肌梗死。心肌梗死在發(fā)達(dá)國(guó)家中的發(fā)病率較高，在中國(guó)等發(fā)展國(guó)家中的發(fā)病率正呈快速上升趨勢(shì)。流行病學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)相關(guān)研究表明，生活方式因素和遺傳因素共同促進(jìn)了冠脈粥樣硬化發(fā)展和心肌梗死發(fā)生。大多數(shù)mi是由已知致冠脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素（吸煙、血脂異常、高血壓、腹型肥胖、糖尿病等）和易感基因相互作用及其之間相互作用引起。冠心病是一個(gè)復(fù)雜遺傳疾病，現(xiàn)代基因技術(shù)已從大量的基因研究中識(shí)別出冠心病進(jìn)展中重要誘發(fā)基因或易感基因。文獻(xiàn)表明外周血中基因表達(dá)水平可能反應(yīng)了復(fù)雜心血管疾病的變化，是極具意義的檢驗(yàn)心血管疾病的生物標(biāo)志物。發(fā)明人前期進(jìn)行的外周血急性心肌梗死差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：在急性心肌梗死患者和穩(wěn)定型冠心病患者的外周血白細(xì)胞中存在著大量差異表達(dá)的基因。其中，cpne3基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)，并且在現(xiàn)有研究中未見(jiàn)對(duì)cpne3基因與心肌梗死的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明人在前期研究成果的基礎(chǔ)之上，通過(guò)擴(kuò)大樣本量，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證cpne3基因在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中的差異表達(dá)，并分析cpne3基因促進(jìn)穩(wěn)定型冠心病發(fā)展為急性心肌梗死的可能機(jī)制。本發(fā)明提供了一種新的急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用意義和開(kāi)發(fā)價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種cpne3基因作為預(yù)測(cè)診療急性心肌梗死標(biāo)記物的用途，用于急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷，所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)一步的，所述的cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物在急性心肌梗死外周血中低表達(dá)。進(jìn)一步的，所述的cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平熒光定量檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步的，采用熒光定量試劑盒、基因芯片、酶聯(lián)免疫、抗體雜交方法外周血中基因的表達(dá)檢測(cè)方法和相關(guān)的生物制劑。本發(fā)明的目的在于所述急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷制劑檢測(cè)cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步的，包含本cpne3基因和或表達(dá)產(chǎn)物用于急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷的生物制劑。本發(fā)明中熒光定量pcr檢測(cè)中使用的引物對(duì)，其序列如下：上游引物序列：5’tgtagggagaaggaccgtga3’；下游引物序列：5’atggctgaaggtgaaacagg3’。本發(fā)明中熒光定量pcr檢測(cè)體系及反應(yīng)條件：熒光定量pcr反應(yīng)體系：20ul反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無(wú)核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。權(quán)利要求3中所述的熒光定量pcr反應(yīng)條件：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10分鐘；40個(gè)循環(huán)：95℃變性15秒,60℃退火20秒,72℃20延伸秒；溶解曲線和擴(kuò)增曲線95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有樣本至少重復(fù)測(cè)量三次，結(jié)果取均值；根據(jù)cpne3基因在外周血中mrna表達(dá)水平的高低來(lái)預(yù)測(cè)穩(wěn)定型冠心病患者發(fā)生急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的大小。本發(fā)明進(jìn)行的外周血急性心肌梗死差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：在急性心肌梗死病人的外周血白細(xì)胞中存在著大量差異表達(dá)的基因。其中，cpne3基因在急性心肌梗死病人外周血中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。發(fā)明人在前期研究成果的基礎(chǔ)之上，通過(guò)擴(kuò)大樣本量，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證cpne3基因在急性心肌梗死發(fā)病過(guò)程中的差異表達(dá)，并分析cpne3基因促進(jìn)急性心肌梗死發(fā)病的可能機(jī)制。本發(fā)明的積極效果在于：提供了以cpne3基因和或基因的表達(dá)產(chǎn)物一種新的急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷治療靶點(diǎn)，利用cpne3基因及其表達(dá)產(chǎn)物制備急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)標(biāo)記物和診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用意義和開(kāi)發(fā)價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明cpne3基因熒光定量pcr的擴(kuò)增曲線；圖2為本發(fā)明cpne3基因熒光定量pcr特異性引物的溶解曲線；圖3為本發(fā)明cpne3基因mrna表達(dá)水平在急性心梗組和穩(wěn)定冠心病組的比較；圖4為本發(fā)明cpne3在蛋白水平上的表達(dá)水平比較。ami組，樣本編號(hào)為1、2、3；scad組，樣本編號(hào)為4、5、6；圖5為本發(fā)明cpne3在蛋白水平灰度分析在急性心肌梗死組和穩(wěn)定型冠心病組的比較；圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中cpne3基因相對(duì)表達(dá)量的roc曲線。具體實(shí)施方式結(jié)合實(shí)例具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型。實(shí)施例1一、病例的收集選取2014年11月-2016年11月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療并行冠脈造影術(shù)的患者，依據(jù)2012年公布的心肌梗死全球統(tǒng)一定義明確診斷為急性心肌梗死的病人91例為ami組，2013年esc指南公布的穩(wěn)定型冠心病定義診斷為穩(wěn)定型冠心病的病人87例為scad組。并根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)研究對(duì)象的冠狀動(dòng)脈血管病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，分值越高病變?cè)絿?yán)重。二、本發(fā)明排除標(biāo)準(zhǔn)：1.和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（pci）或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（cabg）相關(guān)的心肌梗死；2.mitypeii。繼發(fā)于供血失衡相關(guān)的心梗：如兒茶酚胺水平升高或冠脈痙攣導(dǎo)致的心梗；3.伴有心臟手術(shù)或非心臟手術(shù)的心梗；4.合并多因素或不確定疾病的心肌損傷：嚴(yán)重心力衰竭、應(yīng)激性心肌病、嚴(yán)重肺栓塞或肺動(dòng)脈高壓、敗血癥和危重病人、腎功能衰竭、嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血等；5.患有免疫系統(tǒng)疾病和（或）正在服用激素；6.（活動(dòng)性或潛伏性）結(jié)核感染史或證據(jù)；7.正在患有的、慢性的或復(fù)發(fā)性的傳染性疾病史；8.合并有嚴(yán)重感染性疾病、惡性腫瘤。懷疑或證實(shí)處于免疫缺陷狀態(tài)的患者；9.臨床資料或者冠脈造影資料不全者。詳細(xì)記錄臨床資料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質(zhì)指數(shù)（bmi）、冠心病家族史、吸煙史、冠狀動(dòng)脈造影資料，以及合并其它臨床疾病情況（如高血壓、糖尿?。┑取Ｈ?、急性心肌梗死患者組及對(duì)照組外周血中cpne3基因表達(dá)情況1.1外周血采集、總rna提取及cdna合成留取各研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血4ml，利用血液總rna提取試劑盒（rnasimpletotalrnakit,天根生化科技有限公司，北京），依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)已獲取的外周血進(jìn)行總rna提取，并利用1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(jì)（nanodrop2000）對(duì)rna的質(zhì)量及濃度進(jìn)行檢測(cè)。合格的rna樣本a260/a280值在1.9和2.1之間，且a260/a230值大于2。瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)明亮的28s和18srrna條帶，且28srrna條帶亮度約為18srrna的兩倍。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（toyoborevertraaceqprcrtkit，上海），取總量為1ug合格的總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna樣品保存于-20℃以便下一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr。實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)利用sybr熒光定量試劑盒(sybrpremixextaqtm，takara,大連)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。采用20ul反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)包括:10ulsybrpremixextaqtm，上、下游引物各0.5ul(濃度為10umol/l)，無(wú)核酸酶的雙蒸水8ul，cdna模板1ul。應(yīng)用mx3005p實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)（stratagene）擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃10分鐘；40個(gè)循環(huán)：95℃15秒,60℃20秒,72℃20秒；95℃1分鐘，55℃30秒,95℃30秒。以gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，所有樣本至少重復(fù)測(cè)量三次，結(jié)果取均值。每個(gè)樣本所得循環(huán)閾值（ct）以相對(duì)表達(dá)量2-△ct表示（△ct=目的基因ct-內(nèi)參基因ct），并進(jìn)行比較。急性心肌梗死組對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量以2-△△ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，△△ct=急性心肌跟死組△ct-對(duì)照組△ct。所用pcr引物根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)提供的cpne3基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1表1.rt-pcr引物序列g(shù)enesgenesprimersequence(5’-3’)cpne3fagtcagaccctttatgtgtgttgtrbtggaaaattggggattcaagcaagapdhfaacggatttggtcgtattgggcgrbctcctggaagatggtgatggfa,上游引物；rb,下游引物。四、cpne3基因相對(duì)表達(dá)量與急性心肌梗死患者血脂，血糖等性狀的相關(guān)性分析1.1方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)使用spss26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布使用x±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異比較使用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，不服從正態(tài)分布的使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析描述，組間差異使用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析描述，組間差異使用x2檢驗(yàn)分析；ami相關(guān)危險(xiǎn)因素采用二元logistic回歸分析。cpne3基因相對(duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白i和gensini評(píng)分的相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析；統(tǒng)計(jì)結(jié)果以雙側(cè)p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床資料分析研究對(duì)象的臨床資料分析結(jié)果表明：在年齡、性別、bmi、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及血清甘油三酯水平（tg）、血清總膽固醇水平（tc）、和低密度脂蛋白膽固醇水平（ldl-c）、高密度脂蛋白膽固醇（hdl-c）等方面，兩組未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ami組患者年齡明顯高于scad組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2?；?qū)崟r(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定外周血rna實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果顯示：cpne3基因擴(kuò)增曲線為顯著平滑的“s型”，見(jiàn)圖1。溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高，見(jiàn)圖2。2.3.1cpne3基因mrna水平相對(duì)表達(dá)量在ami組和scad組間比較分析t-pcr所得每個(gè)樣本的δct值均為單個(gè)樣本重復(fù)3次測(cè)量所得均值。結(jié)果顯示，ami組2-△ct為0.020（0.016-0.032），scad組2-△ct為0.029（0.021-0.067），兩組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（z=-4.231，p=0.000）。ami患者外周血中cpne3基因mrna相對(duì)表達(dá)量明顯低于scad患者，且其相對(duì)表達(dá)量為scad組的0.69倍。詳見(jiàn)圖3。外周血cpne3基因蛋白水平表達(dá)結(jié)果分析本研究中以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)患者外周血進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)。westernblot結(jié)果顯示：ami組與scad組在β-actin基因蛋白水平表達(dá)上無(wú)明顯差異，而在cpne3基因蛋白水平表達(dá)上差異顯著，與scad患者相比，ami患者在外周血中prmrt5蛋白水平為低表達(dá)，ami組cpne3蛋白表達(dá)為scad組的0.356倍，詳見(jiàn)圖4?；蛳鄬?duì)表達(dá)量與年齡、血清血脂、血糖等的相關(guān)性分析本組資料表明，cpne3基因的mrna水平表達(dá)量、患者年齡在ami和scad兩組比較均存在差異性。進(jìn)一步分析cpne3基因mrna表達(dá)量與患者年齡、空腹血糖、血清血脂水平是否有關(guān)。將所有納入的研究對(duì)象依據(jù)血脂水平分層標(biāo)準(zhǔn)分為：tc正常組（＜5.18mmol/l）和tc升高組（≧5.18mmol/l）、tg正常組（＜1.76mmol/l）、tg升高組（≧1.76）、ldl-c正常組（＜3.37mmol/l）和ldl-c升高組（≧3.37mmol/l）、hdl-c正常組（≧0.907）、hdl-c降低組（<0.907）。依據(jù)空腹血糖標(biāo)準(zhǔn)水平將所有研究對(duì)象分為：血糖正常組（≤6.0）、血糖升高組（>6）。依據(jù)所有研究對(duì)象以年齡做ami的roc曲線的cutoff值將所有納入的研究對(duì)象分為：高齡組（＞66.5）和低齡組（≤66.5）、每個(gè)研究對(duì)象cpne3基因mrna水平的相對(duì)表達(dá)量以2-△ct表示，分別比較各組間與cpne3基因表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示：cpne3基因mrna表達(dá)量在高齡組與低齡組之間有差異（p=0.008）；cpne3基因mrna表達(dá)量與血清血脂、血糖均無(wú)關(guān)。結(jié)果詳見(jiàn)表3。采用logistic回歸分析cpne3基因mrna水平表達(dá)量及患者年齡與急性心肌梗死的關(guān)系按cpne3基因的相對(duì)表達(dá)量cutoff值將所有研究對(duì)象分為高表達(dá)組（2-△ct>0.013）和低表達(dá)組（2-△ct≤0.013），進(jìn)一步采用逐步二元logistic回歸分析cpne3基因mrna水平表達(dá)量、患者年齡與ami的相關(guān)性。結(jié)果表明：cpne3基因低表達(dá)、患者高齡是ami的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與cpne3高表達(dá)相比，cpne3基因低表達(dá)組ami的風(fēng)險(xiǎn)增加3.845倍，高齡使ami風(fēng)險(xiǎn)增加了2.605倍。詳見(jiàn)表4?；蛳鄬?duì)表達(dá)量在急性心肌梗死診斷中的roc曲線和cutoff值根據(jù)急性心肌梗死組和對(duì)照組各樣本實(shí)時(shí)熒光定量pcr所得cpne3相對(duì)表達(dá)量2-△ct值繪制roc曲線，見(jiàn)圖5。從圖5可知cpne3基因的相對(duì)表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價(jià)值，曲線下面積（auc）為0.684±0.040。，以約登指數(shù)最大值確定的cpne3基因相對(duì)表達(dá)量cutoff值0.024，診斷ami的敏感度為0.690，特異性為0.648，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值68.6%，陰性預(yù)測(cè)值65.2%。基因相對(duì)表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)所有研究對(duì)象冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。分值越高代表冠狀動(dòng)脈狹窄越重。所有研究對(duì)象gensini評(píng)分結(jié)果為25（9.5-52），對(duì)cpne3基因和gensini分值進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，結(jié)果顯示：cpne3基因mrna表達(dá)量與gensini分值呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.200，p=0.018），即cpne3基因mrna的相對(duì)表達(dá)量越低，gensini分值越高，冠狀動(dòng)脈病變則越重?；虻南鄬?duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白i（tni）的相關(guān)性急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測(cè)結(jié)果為0.790（0.138-8.760）ng/ml。血清肌鈣蛋白i（tni）濃度的高低反應(yīng)了急性心肌梗死的范圍的大小。血清tni和cpne3基因相對(duì)表達(dá)量的雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示：外周血中cpne3基因表達(dá)量與血清tni濃度無(wú)關(guān)（rs=-0.144，p=0.364）。即cpne3基因mrna水平表達(dá)量與心肌梗死的范圍無(wú)關(guān)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量與急性心梗患者發(fā)病距采血的時(shí)間的相關(guān)性以急性心肌梗死患者過(guò)去一周內(nèi)初發(fā)的長(zhǎng)時(shí)間（≥20min）靜息痛作為發(fā)病時(shí)間點(diǎn)，急性心肌梗死組患者發(fā)病距采血的時(shí)間即為發(fā)病時(shí)間，結(jié)果為24（11-72）h。cpne3基因相對(duì)表達(dá)量和急性心肌梗死發(fā)病時(shí)間相關(guān)分析結(jié)果顯示：外周血中cpne3基因表達(dá)量與急性心肌梗死發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)（rs=-0.098，p=0.533）。sequencelisting<110>吉林大學(xué)<120><160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>104<212>mrna<213>人（homo）<400>1gtcagaccctttatgtgtgttgtttttgaatacaagtggtcaacagtggtatgaggttga60gcgcacagaaaggattaagaattgcttgaatccccaattttcca104<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2gtcagaccctttatgtgtgttgt23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tggaaaattggggattcaagcaa23當(dāng)前第1頁(yè)12