本發(fā)明涉及一種番茄開花時間性狀的調控連鎖標記及其應用。
背景技術：
：番茄作為一種深受歡迎的蔬菜，在世界范圍內廣泛種植。因此番茄的產量、質量等性狀吸引了全世界許多人進行研究。開花時間的早晚對于番茄有著極其重要的意義，番茄的開花標志著從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變，是影響番茄生育期的一個重要性狀。目前栽培番茄多為日中性植物，一般多在7-8片葉時出現(xiàn)第一穗花(始花節(jié)位)，但是醋栗番茄和部分櫻桃番茄在秋季會出現(xiàn)開花時間變晚的表型。長日照是影響這一表型的主要因素。目前番茄開花時間性狀缺乏有效的調控連鎖標記，不能準確地判斷番茄開花時間表型與基因型的關系。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種番茄開花時間性狀的調控連鎖標記及其應用。本發(fā)明提供了一種特異引物對，由引物l和引物r組成；所述引物l為如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；(a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；所述引物r為如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；(a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子。所述特異引物對的用途為如下(b1)-(b6)中的至少一種：(b1)鑒定或輔助鑒定番茄開花時間性狀；(b2)篩選或輔助篩選具有開花時間性狀甲的番茄；(b3)篩選或輔助篩選具有開花時間性狀乙的番茄；(b4)制備用于鑒定或輔助鑒定番茄開花時間性狀的試劑盒；(b5)制備用于篩選或輔助篩選具有開花時間性狀甲的番茄的試劑盒；(b6)制備用于篩選或輔助篩選具有開花時間性狀乙的番茄的試劑盒。所述開花時間性狀甲為如下(c1)-(c5)中的至少一種：(c1)開花時間不受日照條件影響；(c2)開花時間不受長日照條件影響；(c3)開花時間不受季節(jié)影響；(c4)短日照條件下和長日照條件下始花節(jié)位均為4-9；(c5)春季和秋季始花節(jié)位均為4-9。所述開花時間性狀乙為如下(d1)-(d7)中的至少一種：(d1)開花時間受日照條件影響；(d2)開花時間受長日照條件影響；(d3)開花時間受季節(jié)影響；(d4)秋季開花時間比春季開花時間延遲；(d5)長日照條件開花時間比短日照條件開花時間延遲；(d6)短日照條件下始花節(jié)位為4-9，長日照條件下始花節(jié)位為10-17；(d7)春季始花節(jié)位為4-9，秋季始花節(jié)位為10-17。本發(fā)明還保護含有所述特異引物對的試劑盒；所述試劑盒的應用為如下(e1)-(e3)中的至少一種：(e1)鑒定或輔助鑒定番茄開花時間性狀；(e2)篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀甲的番茄；(e3)篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀乙的番茄。本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將所述特異引物對中的各條引物進行獨立包裝的步驟。本發(fā)明還保護一種鑒定或輔助鑒定番茄開花時間性狀的方法(方法甲)，包括如下步驟：以待測番茄的基因組dna為模板，采用所述特異引物對進行pcr擴增，如果pcr擴增產物中具有113-133bp的dna片段、待測番茄為或候選為具有所述開花時間性狀甲的番茄，如果pcr擴增產物中具有165-185bp的dna片段，待測番茄為或候選為具有所述開花時間性狀乙的番茄。所述113-133bp的dna片段具體可為123bp的dna片段。所述123bp的dna片段具體可如序列表的序列3所示。所述165-185bp的dna片段具體可為175bp的dna片段。所述175bp的dna片段具體可如序列表的序列4所示。所述pcr擴增的反應體系具體可為：2×taqmix10μl，模板dna30ng，引物l10μm，引物r10μm，ddh2o補足至20μl。所述pcr擴展的反應程序具體可為：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃20s，40個循環(huán)；72℃5min。本發(fā)明還保護一種鑒定或輔助鑒定番茄開花時間性狀的方法(方法乙)，包括如下步驟：檢測待測番茄基因組dna中是否含有特異dna片段甲和特異dna片段乙，如果所述基因組dna中含有特異dna片段甲且不含有特異dna片段乙、待測番茄為或候選為具有所述開花時間性狀甲的番茄，如果所述基因組dna中含有特異dna片段乙且不含有特異dna片段甲、待測番茄為或候選為具有所述開花時間性狀乙的番茄。所述特異dna片段甲為序列表的序列3所示的dna分子。所述特異dna片段乙為序列表的序列4所示的dna分子。本發(fā)明還保護一種篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀甲的番茄的方法(方法丙)，包括如下步驟：(f1)按照所述方法甲或所述方法乙鑒定待測番茄開花時間性狀；(f2)基于步驟(f1)的結果篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀甲的番茄。本發(fā)明還保護一種篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀乙的番茄(方法丁)，包括如下步驟：(g1)按照所述方法甲或所述方法乙鑒定待測番茄開花時間性狀；(g2)基于步驟(g1)的結果篩選或輔助篩選具有所述開花時間性狀乙的番茄。本發(fā)明還保護所述特意引物對或以上任一所述方法在番茄育種中的應用。本發(fā)明還保護番茄育種方法，為方法a或方法b。所述方法a包括如下步驟：將所述方法丙篩選得到的所述具有開花時間性狀甲的番茄作為育種材料。所述方法b包括如下步驟：將所述方法丁篩選得到的所述具有開花時間性狀乙的番茄作為育種材料。以上任一所述長日照具體為日照長度大于等于12小時。以上任一所述短日照具體為日照長度小于12小時。以上任一所述待測番茄可為野生醋栗番茄、櫻桃番茄或大果栽培番茄。以上任一所述待測番茄具體可為番茄solanumlycopersicummoneymaker或番茄solanumlycopersicumvar.cerasiforme。所述野生醋栗番茄具體可為tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)代碼為la0373、la1589、la0442、la1375、la1269、la1924、la1582、la0411、la1584、la0400或la2660的野生醋栗番茄。所述櫻桃番茄具體可為tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)代碼為cr070、la1204、la1482、la1457、cr240、la3136、ea03539、ea02979、v710276或ea00915的櫻桃番茄。所述大果栽培番茄具體可為tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)代碼為la4024、ea03673或v710167的大果栽培番茄。本發(fā)明開發(fā)了一種用于檢測番茄開花時間性狀的引物標記，并建立了利用該標記檢測番茄開花時間性狀的特異性檢測方法。本發(fā)明建立的方法具有極高的特異性，可以對番茄開花時間性狀進行快速檢測。本發(fā)明提供的引物對和方法可對于番茄的品種選育具有重大的應用價值。附圖說明圖1為不同品種番茄pcr檢測結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。番茄solanumlycopersicummoneymaker：tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)，代碼：la2706。番茄solanumlycopersicumvar.cerasiforme：tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)，代碼：la1310。表2中的番茄均可從tomatogeneticsresourcecenter(tgrc)獲得。始花節(jié)位：植株在長至第x片葉時出現(xiàn)第一穗花，則始花節(jié)位為x，x為自然數(shù)。實施例1、連鎖標記的發(fā)現(xiàn)通過對各番茄品種的樣品進行研究，發(fā)現(xiàn)在番茄5號染色體中存在一個插入/缺失位點，長度為52bp，與番茄開花時間性狀緊密連鎖。針對發(fā)現(xiàn)的插入/缺失設計得到標記引物對，引物對信息如表1所示。表1引物對信息引物名稱引物序列(5′-3′)lcggtggtcgtcgcctataaa(序列表的序列1)rgcaatttagctgagtgactatcaa(序列表的序列2)實施例2、檢測方法的建立待測番茄：solanumlycopersicummoneymaker、solanumlycopersicumvar.cerasiforme、表2中的番茄。表2實驗番茄品種1、提取待測番茄的基因組dna。2、以步驟1得到的基因組dna為模板，采用實施例1的引物l和引物r進行pcr擴增，得到擴增產物。pcr反應體系：2×taqmix10μl，模板dna30ng，引物l10μm，引物r10μm，ddh2o補足至20μl。pcr反應程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃20s，40個循環(huán)；72℃5min。3、將步驟2得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果見圖1。圖1中，泳道1為solanumlycopersicummoneymaker的擴增產物電泳結果，泳道2為solanumlycopersicumvar.cerasiforme擴增產物電泳結果，泳道3-26依次為表2中編號1-24的番茄擴增產物電泳結果。solanumlycopersicummoneymaker以及泳道14、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26對應的番茄均在相同位置顯示一條特異條帶(將其命名為條帶1)，將所述番茄的條帶1回收并進行測序，均如序列表的序列3所示，將這些番茄命名為mm型番茄。solanumlycopersicumvar.cerasiforme以及泳道3、4、5、6、7、9、10、11、12、13對應的番茄均在相同位置顯示一條特異條帶(將其命名為條帶2)，將所述番茄的條帶2回收并進行測序，均如序列表的序列4所示，將這些番茄命名為pp型番茄。4、如待測番茄種子，分別于春季(短日照，日照長度小于12小時)和秋季(長日照，日照長度大于等于12小時)時進行種植。將番茄種子播種于濕潤的濾紙上，室溫黑暗條件下培養(yǎng)至種子萌發(fā)，然后轉移至32孔穴盤中，待四到五片葉時定植到溫室地里，溫室地里白天溫度約為26-28℃，夜間溫度約為18-20℃，使用自然光照，不進行人工補光。對待測番茄始花節(jié)位進行記錄。部分結果如表3所示。表3部分實驗結果經(jīng)過統(tǒng)計，所有mm型番茄和pp型番茄春季(短日照)開花時間(始花節(jié)位)均為4-8，而所有mm型番茄秋季(長日照)開花時間(始花節(jié)位)均為7-9，所有pp型番茄秋季(長日照)開花時間(始花節(jié)位)均為10-17。凡是mm型番茄秋季(長日照)開花時間并不會有太大的改變，而pp型番茄秋季(長日照)則會出現(xiàn)開花時間大大延遲的情況。通過實驗證明，實施例1中的引物標記與番茄開花時間表型緊密連鎖，通過標記可以快速地對番茄開花時間性狀進行檢測。<110>中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所<120>番茄開花時間性狀的調控連鎖標記及其應用<160>4<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1cggtggtcgtcgcctataaa20<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gcaatttagctgagtgactatcaa24<210>3<211>123<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>3cggtggtcgtcgcctataaatcacccccctctcctcggggtgcgatccgttctcgaactc60tgtgtcaatgtcagatgttttgtgtaacggattttttgtttgatagtcactcagctaaat120tgc123<210>4<211>175<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>4cggtggtcgtcgcctataaatcacccccctctcctcggggtgcgatccgttctcgaactc60tgtgtcaatgtcagatgttttgtgtaacggatttttctgtatctatcgttattattacta120tatatcgatatcatatatgagttgattttgtttgatagtcactcagctaaattgc175當前第1頁12