本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種低成本的pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

檢測(cè)pml/rara融合基因是診斷急性早幼粒細(xì)胞白血病(apl)最特異最敏感的方法之一，也是apl治療方案選擇、療效分析預(yù)后分析等最可靠的指標(biāo)。目前核型分析、pcr法和fish法是常見的幾種檢測(cè)方式。fish具有安全、快速、靈敏度高及同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)。

熒光原位雜交是一種在20世紀(jì)80年代放射性原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子遺傳技術(shù)，以熒光素標(biāo)記取代放射性同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。目前fish常用的檢測(cè)探針主要是通過(guò)對(duì)特定人類基因組bac克隆進(jìn)行缺口平移法或隨機(jī)引物法標(biāo)記，再經(jīng)cot-1dna封閉后用于原位雜交實(shí)驗(yàn)，但此方法包含大量的重復(fù)序列即使經(jīng)過(guò)cot-1dna封閉但雜交結(jié)果仍具有較高的背景，并且此種方法標(biāo)記的探針通常需要12-16h(過(guò)夜)來(lái)完成雜交實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且此種方需要大量(通常是探針濃度的50～100倍)昂貴的cot-1dna來(lái)進(jìn)行重復(fù)序列封阻，這大大的增加了探針的制備成本。此外近年來(lái)一種不含重復(fù)序列的快速熒光原位雜交探針的制備方法也被建立起來(lái)(1h完成雜交實(shí)驗(yàn))，但此種方法需要設(shè)計(jì)大量引物或者構(gòu)建大量載體來(lái)實(shí)現(xiàn)探針的制備，并且探針的制備過(guò)程仍采用缺口平移或隨機(jī)引物等傳統(tǒng)方法，導(dǎo)致批次間的不穩(wěn)定；此外此種制備方法仍然需要依賴于人類基因組序列或者bac克隆序列，原料來(lái)源具有一定局限性，并且整個(gè)制備過(guò)程繁瑣，制備成本和不可控因素大大增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種低成本的pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針及其制備方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種低成本的pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)從ucscgenomebrowser下載pml和rara基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列，其中pml探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1574089693～74634008，rara探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1738059674～38977709；

(2)將步驟(1)獲得的pml基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入oligoarray軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)、探針篩選，然后將篩選出的探針導(dǎo)出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到一系列帶有標(biāo)簽序列的pml探針序列；

(3)將步驟(1)獲得的rara基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入oligoarray軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)、探針篩選，然后將篩選出的探針導(dǎo)出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到一系列帶有標(biāo)簽序列的rara探針序列；

(4)使用dna合成儀對(duì)步驟(2)所得帶有標(biāo)簽序列的pml探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到pml探針庫(kù)；同理，使用dna合成儀對(duì)步驟(3)所得帶有標(biāo)簽系列的rara探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到rara探針庫(kù)；

(5)分別合成5’端帶有綠色熒光基團(tuán)的m13通用引物和5’端帶有橘紅色熒光基團(tuán)的m13通用引物，使用5’端帶有綠色熒光基團(tuán)的m13通用引物對(duì)pml探針庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)，使用5’端帶有橘紅的熒光基團(tuán)的m13通用引物對(duì)rara探針庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)；

(6)步驟(5)所得pml探針庫(kù)的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)純化、稀釋后得到熒光標(biāo)記的pml探針庫(kù)，步驟(5)所得rara探針庫(kù)的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)純化、稀釋后得到熒光標(biāo)記的rara探針庫(kù)，所述熒光標(biāo)記的pml探針庫(kù)和熒光標(biāo)記的rara探針庫(kù)構(gòu)成了pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針。

上述方案中，步驟(2)和步驟(3)中所述探針篩選的條件為：探針長(zhǎng)度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探針間最小間隔5bp。

上述方案中，步驟(2)和步驟(3)中所述標(biāo)簽序列的堿基序列如下所示：

5’端標(biāo)簽序列為：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)

3’端標(biāo)簽序列為：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)。

上述方案中，步驟(5)中所述通用引物序列為：

m13-ftgtaaaacgacggccagt；

m13-rcaggaaacagctatgacc。

上述方案中，步驟(5)所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系如下：

上述方案中，步驟(5)所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的pcr反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

包含上述制備方法制備所得pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針的試劑盒。

上述試劑盒在制備檢測(cè)pml/rara融合基因試產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方式包括如下步驟：

(1)樣本處理：將外周血細(xì)胞滴片樣本放入盛有2×ssc的容器中，微波爐高火加熱處理3min直至液體沸騰，然后再中低火繼續(xù)加熱處理10min，處理完成后立即將玻片置于-20℃預(yù)冷的梯度酒精中脫水晾干，備用；

(2)pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針雜交混合物的制備：將熒光標(biāo)記的pml探針庫(kù)、熒光標(biāo)記的rara探針庫(kù)和雜交緩沖液按照1:1:9的體積比混合；

(3)探針樣本共変性：每例樣本使用10μl步驟(2)混合所得pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針雜交混合物，使用22×22mm蓋玻片蓋片，使用橡皮膠封片，封片后將玻片置于雜交儀中90℃變性1min，37℃雜交15～30min；

(4)雜交后洗滌：待雜交完成后揭去蓋玻片，將玻片置于60℃預(yù)熱的洗液中洗滌去除未結(jié)合探針；

(5)復(fù)染及鏡檢：將晾干的玻片滴加10μl抗淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。

上述方案中，步驟(2)中所述雜交緩沖液的組分為：10wt％去離子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mlrnasea、0.6m氯化鈉、10mm檸檬酸緩沖液。

上述方案中，步驟(3)中所述洗液含0.3m氯化鈉、0.03m檸檬酸鈉和0.1％tween-20。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)相比于傳統(tǒng)的bac克隆fish，本發(fā)明所述制備方法完全不依賴bac克隆，且不含有重復(fù)序列，不需要昂貴的cot-1dna進(jìn)行封閉，大大降低了雜交背景和制備成本。

(2)相比于近年來(lái)建立的不含重復(fù)序列的快速熒光原位雜交探針的制備方法，本發(fā)明所述制備方法中，探針的篩選主要依賴程序完成，并且使用的是更為穩(wěn)定的pcr法擴(kuò)增和標(biāo)記探針，探針標(biāo)記率更高更均一，僅在探針5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記所以不影響探針的雜交配對(duì)反應(yīng)；此外本發(fā)明不采用容易受環(huán)境或操作手法影響的缺口平移反應(yīng)和隨機(jī)引物反應(yīng)來(lái)標(biāo)記探針，所標(biāo)記的探針長(zhǎng)短一致，增加了批次間的穩(wěn)定性；

(3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化探針設(shè)計(jì)配合特定的雜交緩沖液以及獨(dú)特的檢測(cè)方法，本發(fā)明可在15-30min內(nèi)完成雜交實(shí)驗(yàn)，這比現(xiàn)有技術(shù)中最快需要1h來(lái)完成雜交實(shí)驗(yàn)所耗費(fèi)的時(shí)間相比，降低了50％以上。

(4)本發(fā)明所述的探針具有極高的信噪比，并且具有很高的特異性和樣本檢出率。

附圖說(shuō)明

圖1為探針制備示意圖。

圖2為探針與靶基因結(jié)合示意圖。

圖3為chunks.pl程序使用代碼圖。

圖4為去除重復(fù)序列后pml基因部分探針序列圖。

圖5為本發(fā)明pml/rara探針的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖6為本發(fā)明pml/rara探針與雅培探針不同雜交時(shí)間結(jié)果對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針的制備

本實(shí)施例所述pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針的制備過(guò)程示意圖如圖1所示，具體包括如下步驟：

(1)從ucscgenomebrowser下載pml和rara基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列，其中pml探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1574089693～74634008，rara探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1738059674～38977709；所獲取的序列保存為fasta格式，基因組中重復(fù)序列區(qū)域替換為n；

(2)將步驟(1)獲得的pml基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代碼圖見圖3)分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入oligoarray軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)、探針篩選，探針篩選的條件為：探針長(zhǎng)度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探針間最小間隔5bp；然后將篩選出的探針導(dǎo)出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到帶有標(biāo)簽的一系列pml探針序列(圖4所示為pml基因探針池，由于序列過(guò)多不一一展示)；標(biāo)簽序列的堿基序列如下：5’端標(biāo)簽序列為：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)，3’端標(biāo)簽序列為：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)；

(3)將步驟(1)獲得的rara基因探針?biāo)采w區(qū)域的基因組非重復(fù)序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代碼圖見圖3)分割成1kb大小的區(qū)塊；將分割后的區(qū)塊批量導(dǎo)入oligoarray軟件進(jìn)行探針設(shè)計(jì)、探針篩選，探針篩選的條件為：探針長(zhǎng)度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探針間最小間隔5bp；然后將篩選出的探針導(dǎo)出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標(biāo)簽序列，得到帶有標(biāo)簽的一系列rara探針序列；標(biāo)簽序列的堿基序列同步驟(2)；

(4)使用dna合成儀對(duì)步驟(2)所得帶有標(biāo)簽序列的pml探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到pml探針庫(kù)，所述pml探針庫(kù)包含1863條帶有標(biāo)簽序列的pml探針；同理，使用dna合成儀對(duì)步驟(3)所得帶有標(biāo)簽序列的rara探針序列進(jìn)行化學(xué)合成，將化學(xué)合成的探針進(jìn)行混合，制備得到rara探針庫(kù)，所述rara探針庫(kù)包含1511條帶有標(biāo)簽序列的rara探針；

(5)分別合成5’端帶有綠色熒光基團(tuán)和橘紅色熒光基團(tuán)的m13通用引物，通用引物序列為：m13-ftgtaaaacgacggccagt，m13-rcaggaaacagctatgacc；使用5’端帶有綠色熒光基團(tuán)的m13通用引物對(duì)pml探針庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)；使用5’端帶有橘紅的熒光基團(tuán)的m13通用引物對(duì)rara探針庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)；所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系如下：

所述擴(kuò)增標(biāo)記反應(yīng)的pcr反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min；

(6)使用乙醇醋酸鈉法分別對(duì)步驟(5)所得pml探針庫(kù)的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物和rara探針庫(kù)的擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后再經(jīng)稀釋得到：濃度為20ng/μl的熒光標(biāo)記的pml探針庫(kù)和濃度為20ng/μl的熒光標(biāo)記的rara探針庫(kù)。

實(shí)施例2pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針的檢測(cè)方法

本實(shí)施例所述pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針在用于檢測(cè)pml/rara融合基因的試劑盒中的應(yīng)用，具體包括如下步驟：

(1)樣本處理：將外周血細(xì)胞滴片樣本放入盛有2×ssc的容器中，微波爐高火加熱處理3min直至液體沸騰，然后再中低火繼續(xù)加熱處理10min，處理完成后立即將玻片置于-20℃預(yù)冷的梯度酒精中脫水晾干，備用；

(2)pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針雜交混合物的制備：將實(shí)施例1制備所得濃度為20ng/μl的熒光標(biāo)記的pml探針庫(kù)、濃度為20ng/μl的熒光標(biāo)記的rara探針庫(kù)和雜交緩沖液按照1:1:9的體積比混合；所述雜交緩沖液的組分為：10wt％去離子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mlrnasea、0.6m氯化鈉、10mm檸檬酸緩沖液；

(3)探針樣本共変性：每例樣本使用10μl步驟(2)混合所得pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針雜交混合物，使用22×22mm蓋玻片蓋片，使用橡皮膠封片，封片后將玻片置于雜交儀中90℃變性1min，37℃雜交15min～30min；

(4)雜交后洗滌：待雜交完成后揭去蓋玻片，將玻片置于60℃預(yù)熱的洗液(含0.3m氯化鈉、0.03m檸檬酸鈉和0.1％tween-20)中洗滌去除未結(jié)合探針；

(5)復(fù)染及鏡檢：將晾干的玻片滴加10μl抗淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。

注意事項(xiàng)：步驟(2)～步驟(4)需避光操作，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

采用實(shí)施例1制備的pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針及實(shí)施例2所述檢測(cè)方法，設(shè)置雜交的時(shí)間梯度為10min、15min、30min、1h、16h；同時(shí)使用雅培公司pml/rara探針嚴(yán)格按照其提供的說(shuō)明書進(jìn)行樣本處理及雜交操作，同樣設(shè)置雜交10min、15min、30min、1h、16h時(shí)間梯度，作為對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，從圖6看出：本發(fā)明所制備的pml/rara融合基因快速檢測(cè)探針在雜交時(shí)間為15min時(shí)就有較好的雜交信號(hào)強(qiáng)度，雜交時(shí)間為30min及以上時(shí)均具有強(qiáng)烈雜交信號(hào)；雅培公司雅培公司pml/rara探針僅在雜交時(shí)間為16小時(shí)出現(xiàn)可見清晰雜交信號(hào)，充分說(shuō)明了本發(fā)明制備的探針雜交所用時(shí)間短及雜交信號(hào)強(qiáng)的特點(diǎn)，也說(shuō)明了本發(fā)明制備的探針具有極高的信噪比，很高的特異性和樣本檢出率。同時(shí)本發(fā)明制備的探針不含重復(fù)系列，且探針長(zhǎng)短均一，探針與靶基因結(jié)合示意圖如圖2所示，從圖2看出，所述探針與靶基因非重復(fù)系列區(qū)域的結(jié)合特異性非常高。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。