本發(fā)明屬于菌核病技術領域，具體涉及一種由肉阜狀杯盤菌引起的桑椹菌核病鑒定的特異性引物及其應用。

背景技術：

桑椹菌核病又稱白果病，是桑椹的主要病害，該病由真菌引起，病菌在桑椹開花時開始侵入。健康的桑椹成熟時呈紫紅色，受桑實杯盤菌侵染的桑椹變白色或灰白色，花被顯著肥大。病椹落地后，花被部分脫離變成黑色菌核。隨著桑椹種植面積的不斷擴大，桑椹菌核病持續(xù)大面積爆發(fā)，且呈蔓延趨勢，嚴重果園甚至顆粒無收，極大地影響種植戶的經濟效益，威脅著桑椹產業(yè)的發(fā)展。桑椹菌核病的病原菌主要有4種，分別為核盤菌、桑實杯盤菌、肉阜狀杯盤菌和核地杖菌。經研究，廣東地區(qū)的桑椹菌核病病原菌主要為肉阜狀杯盤菌。

目前，鑒定桑椹菌核病的主要方法是表型鑒定。表型鑒定即通過觀測桑椹的發(fā)病表型特征來判定桑椹菌核病是否發(fā)生。由于植株病癥表型在發(fā)病中后期才能觀測到，而病原菌在桑椹開花時即已侵入體內，因此表型鑒定方法對桑椹菌核病的防控意義不大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于鑒定桑椹菌核病的特異性引物，應用該引物可進行由肉阜狀杯盤菌引起的桑椹菌核病的檢測。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種應用該特異性引物鑒定由肉阜狀杯盤菌引起的桑椹菌核病的方法，該方法在桑椹菌核病的發(fā)病早期即能快速鑒定桑椹菌核病。

本發(fā)明的第三個目的在于提供上述桑椹菌核病鑒定的特異性引物在制備具有鑒定桑椹菌核病功能的藥物中的應用。

本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

一種用于鑒定由肉阜狀杯盤菌引起的桑椹菌核病的特異性引物，其特征在于：由上游引物cc-18s-f和下游引物cc-18s-r組成，所述上游引物cc-18s-f的核苷酸序列如seqidno：1中所示，所述下游引物cc-18s-r的核苷酸序列如seqidno：2中所示。

根據ncbi數(shù)據庫中桑椹肉阜狀杯盤菌的18srrna(genbankid：ky449059)序列特征，利用primerpremier5.0和oligo6.0設計和篩選了上述肉阜狀杯盤菌的熒光pcr特異性引物(cc-18s-f:gagtgagcataagctcaccccga，如seqidno：1中所示；cc-18s-r:ctccaccccccgagagcggtc，如seqidno：2中所示)。該引物對理論擴增片段大小為344bp，該引物可由華大基因等公司合成。

本發(fā)明的特異性引物可用于常規(guī)pcr和熒光定量qpcr

本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

一種應用上述的特異性引物進行桑椹菌核病的鑒定的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)取發(fā)病桑椹和健康桑椹各10個，提取這些桑椹的dna；

(2)以提取的所述發(fā)病桑椹和健康桑椹的dna為模板，利用上述肉阜狀杯盤菌的特異性引物進行熒光定量qpcr；記錄發(fā)病桑椹和健康桑椹dna的qpcr反應體系的ct值；將測得的所有所述健康桑椹dna的qpcr反應體系的ct值中的最小值作為評判該桑椹是否具有桑椹菌核病的臨界值；

(4)取待檢測的桑椹，并提取該桑椹的dna；

(5)以步驟(4)中提取的待檢測桑椹的dna為模板，利用所述肉阜狀杯盤菌的特異性引物進行熒光定量qpcr，并記錄所述待檢測桑椹dna的qpcr反應體系的ct值；

(6)當所述待檢測桑椹dna的qpcr反應體系的ct值小于所述的臨界值時，表明所述待檢測的桑椹已感染桑椹菌核??；當所述待檢測桑椹dna的qpcr反應體系的ct值大于或等于所述的臨界值時，表明所述待檢測的桑椹為健康桑椹。

在上述的方法中，優(yōu)選地采用dna提取試劑盒進行桑椹dna的提取。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，上述的熒光定量qpcr的反應體系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0μl、濃度為10μm的上游引物rs-16s-f0.8μl、濃度為10μm的下游引物rs-16s-r0.8μl、模板2.0μl、雙蒸水6.4μl。

步驟(2)中熒光定量qpcr的擴增程序優(yōu)選為：第一步95℃預變性30s，第二步95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，共45個循環(huán)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述的臨界值為35。

本發(fā)明的第三個目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

上述桑椹菌核病鑒定的特異性引物在制備具有鑒定桑椹菌核病功能的藥物中的應用。

所述的藥物包括試劑盒等。

有益效果：

本發(fā)明的用于鑒定由肉阜狀杯盤菌引起的桑椹菌核病的特異性引物靈敏、高效、特異性好。將該特異性引物結合熒光定量pcr所得的桑椹菌核病鑒定的方法能夠在發(fā)病早期快速鑒定桑椹菌核病，為桑椹菌核病的早期防治提供可靠的依據。

附圖說明

圖1為實施例1中青枯菌熒光pcr引物特異性檢測。泳道1模板為桑椹肉阜狀杯盤菌dna；泳道2模板為木霉dna；泳道3模板為核盤菌dna；泳道4模板為灰霉dna；泳道5模板為黑曲霉dna；泳道6模板為黃曲霉dna；泳道7模板為酵母dna；m為2000bpdnaladder；

圖2是實施例3中不同發(fā)病程度桑椹和健康桑椹樣本的ct值。

具體實施方式

在下文的實施例中，所使用的常規(guī)pcr儀為由abi公司生產的abi-9700型pcr儀。所使用的taqpcrmix(2×)、dnaisoreagentkit和t-easy載體均由寶生物公司所生產。qpcr實驗采用羅氏公司(roche)生產的lightcycler480實時熒光pcr儀以及寶生物公司生產的sybrpremixextaq^tm試劑盒進行。

實施例1

桑椹肉阜狀杯盤菌特異引物的設計與驗證

1.根據ncbi數(shù)據庫中桑椹肉阜狀杯盤菌的18srrna(genbankid：ky449059)序列特征，利用primerpremier5.0和oligo6.0設計和篩選了肉阜狀杯盤菌的pcr特異性引物(cc-18s-f:gagtgagcataagctcaccccga/cc-18s-r:ctccaccccccgagagcggtc)。該引物對理論擴增片段大小為344bp，該引物由華大基因公司合成。引物稀釋前先在4℃條件下，以1×10⁴rpm離心2min，然后加入去離子水配成10μm的貯存液保存于-20℃待用；

2.以木霉、核盤菌、灰霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母等6種真菌為對照，所有實驗菌株均接種于pda培養(yǎng)基中，在恒溫氣浴搖床中以200rpm的轉速，在28℃條件下培養(yǎng)24h。采用dnaisoreagentkit提取各菌株的dna，保存于-20℃條件下待用；

3.以肉阜狀杯盤菌和各對照菌株dna為模板，利用肉阜狀杯盤菌熒光pcr特異性引物cc-18s-f和cc-18s-r進行常規(guī)pcr擴增，pcr反應體系如下：25μl的反應體系中包含12.5μltaqpcrmix(2×)，8.5μl雙蒸水，2μl模板，1μl上游引物cc-18s-f，1μl下游引物cc-18s-r。擴增反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。pcr完成后，產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

4.同時將電泳條帶切膠回收，連接到t-easy載體上，并轉化至e.coli中，獲得陽性菌落并進行測序。將測序結果在ncbi上進行比對，確定其菌屬類型。

結果

以木霉、核盤菌、灰霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母等6種真菌為對照，利用肉阜狀杯盤菌熒光pcr特異性引物cc-18s-f和cc-18s-r進行常規(guī)pcr擴增，電泳分析結果如圖1所示：僅肉阜狀杯盤菌能擴增出條帶，而對照菌株木霉、核盤菌、灰霉、黑曲霉、黃曲霉和酵母等6種真菌均未擴增出條帶。

將電泳條帶回收轉化并測序后，將測序結果在ncbi上已知的肉阜狀杯盤菌18srrna序列(ky449059)進行比對，比對結果顯示該序列為肉阜狀杯盤菌的18srrna特征序列。

綜上所述，該肉阜狀杯盤菌引物的特異性好，可用于后續(xù)肉阜狀杯盤菌的熒光定量分析實驗。

實施例2

早期快速鑒定桑椹菌核病的方法

ct值的確定

1.取發(fā)病桑椹和健康桑椹各10個，采用dnaisoreagentkit試劑盒提取這些桑椹的dna；

2.以步驟1提取的dna為模板，利用上述的肉阜狀杯盤菌的特異性引物cc-18s-f/cc-18s-r進行熒光定量qpcr實驗。20μlqpcr反應體系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0ul、上游引物cc-18s-f(10μm)0.8μl、下游引物cc-18s-r(10μm)0.8μl、模板2.0μl、雙蒸水6.4μl。熒光定量qpcr的擴增程序為：第一步95℃預變性30s，第二步95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，共45個循環(huán)。pcr結束后立即進行溶解曲線分析，驗證擴增的特異性。每個qpcr反應重復3次。記錄qpcr反應體系的ct值，將其記錄在表1中；

3.如表1中的數(shù)據所示，10個健康桑椹的ct值在35-38之間，而10個發(fā)病桑椹的ct值在11-29之間。取所有健康桑椹dna的qpcr反應體系的ct值，即35，作為檢測桑椹是否具有桑椹菌核病的臨界值，即當桑椹樣本qpcr檢測的ct值小于35時，表明有肉阜狀杯盤菌的存在，該樣本為發(fā)病桑椹；當桑椹樣本qpcr檢測的ct值大于35時，表明沒有桑椹肉阜狀杯盤菌的存在，該樣本為健康桑椹。

桑椹菌核病的鑒定

1.取處于桑椹菌核病發(fā)病程度為1期(僅桑椹小瘦果未膨大、內部輕微感染)、2期(桑椹小瘦果膨大并嚴重感染)、3期(桑椹小瘦果感染至發(fā)黑，并部分感染外部花被)和4期(桑椹小瘦果和花被整體感染并發(fā)黑)的桑椹樣本和健康桑椹樣本，將其用自來水沖洗干凈、用70％酒精表面消毒1min、用無菌水沖洗1次、液氮速凍后，存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

2.以1g桑椹樣本為材料，采用dnaisoreagentkit提取所有桑椹樣本的dna，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20℃條件下待用；

3.對于每個桑椹樣本，取1μl的桑椹樣本dna為模板，利用實施例1中的引物cc-18s-f/cc-18s-r進行熒光定量qpcr實驗。qpcr采用lightcycler480實時熒光pcr儀和sybrpremixextaq^tm試劑盒進行。20μlqpcr反應體系包括：sybrpremixextaqⅱ(2×)10.0ul、上游引物cc-18s-f(10μm)0.8μl、下游引物cc-18s-r(10μm)0.8μl、模板1.0μl，雙蒸水6.4μl。擴增程序如下：第一步95℃預變性30s，第二步95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸15s，45個循環(huán)，pcr結束后立即進行溶解曲線分析，驗證擴增的特異性。每個qpcr反應重復3次；

4.記錄各樣本qpcr反應體系的ct值，并將實驗結果總結在圖2中。

由圖2可見：

(1)健康桑椹樣本ct值為36.5，大于臨界值35。

(2)發(fā)病1、2、3、4期的桑椹樣本的ct值分別為25.4、18.3、14.2、12.2，均小于臨界值35。

故本方法可用于桑椹菌核病的鑒定。

表1

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所

<120>一種用于鑒定桑椹菌核病的特異性引物及應用該引物進行桑椹菌核病鑒定的方法

<160>2

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物cc-18s-f的核苷酸序列

<400>1

gagtgagcataagctcaccccga23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cc-18s-r

<400>2

ctccaccccccgagagcggtc21