本發(fā)明涉及一種念珠菌基因分型即時檢測試劑盒，特別涉及一種不依賴于高能量分子的恒溫擴增技術(shù)。
背景技術(shù)：
：念珠菌是一種真菌，通常引起陰道炎的是念珠菌中的白色念珠菌。此菌呈卵圓形，有芽孢及細胞發(fā)芽伸長而形成的假菌絲。念珠菌對熱的抵抗力不強，加熱至60℃1小時后即可死亡。但對干燥、日光、紫外線及化學(xué)制劑等抵抗力較強。念珠菌是真菌中最常見的條件致病菌。它常寄生于人的皮膚、口腔、陰道和腸粘膜等處，當(dāng)機體免疫機能低下或正常寄居部位的微生態(tài)環(huán)境失調(diào)，容易引起念珠菌病。念珠菌可引起皮膚粘膜淺層或全身系統(tǒng)性感染，感染不同部位可引起不同的疾患，除皮膚念珠菌病外，還有念珠菌性口腔炎、陰道炎、膀胱炎、腎盂腎炎、腦膜炎、菌血癥和膽道感染等。引起人類假絲酵母菌病主要是白假絲酵母菌，占80%～90%，已鑒別有200多種白色假絲酵母菌，所有菌株似乎均具有寄居或引起陰道炎的同等能力。隨著時代的變遷，假絲酵母菌耐藥的增加，其菌種發(fā)生改變，白假絲酵母菌在外陰陰道炎中的比例有所下降，而其他假絲酵母菌所致的外陰陰道炎增加。念珠稍屬于酵母樣真菌，迄今發(fā)現(xiàn)的念珠菌有270種以上，但臨床常的條件致病菌主要有以下幾種：白色念珠菌、熱帶念珠菌、白色念珠菌類星型變種、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌和都柏林念珠菌等。其中白色念珠菌和熱帶念珠菌致病力最強，引起人類念珠菌病的主要是白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌，占60~80%。近年來報道，念珠菌感染菌種存在變遷趨勢，引起念珠菌感染中非白色念珠菌增多，且在病灶中可存在多種致病念珠菌的混合感染；然而各種念珠菌對抗真菌藥的天然敏感度差異較大，所以即時檢測對念珠菌感染患者進行念珠菌分型有著積極意義?；诓≡wdna直接進行檢測，相比涂片敏感性大大提高，可以極大提升陽性檢出率。念珠菌的dna的檢測常用到傳統(tǒng)pcr技術(shù)，檢測程序需要設(shè)置多個循環(huán)，每個循環(huán)包括核酸的變性、退火、延伸，這導(dǎo)致pcr在技術(shù)應(yīng)用上有幾點限制：第一，pcr技術(shù)需要昂貴的實驗室儀器，同時儀器要具備精細的溫度控制程序和加熱模板，從而實現(xiàn)很高的溫度下的dna模板鏈的變性，較低的溫度下引物探針退火延伸模板，這樣重復(fù)溫度變化幾十個循環(huán)之后實現(xiàn)模板量的放大。由于每一個循環(huán)時間都較短，儀器必須能快速準確升降溫度，這就需要銀制或金制的加熱模塊，增加了儀器研制的成本。第二，pcr擴增體系中的聚合酶必須具有耐受高溫的能力，否則必須在每一個循環(huán)中重新加入新酶，以實現(xiàn)下一循環(huán)的擴增，這樣極容易造成污染也加大了成本。第三，在pcr循環(huán)中，每一個循環(huán)引物退火的時間都很短（幾秒到十幾秒）這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段，以實現(xiàn)延伸。這就要求pcr體系必須有過量的pcr引物。過量的引物會與模板錯配，錯誤引發(fā)擴增，引物二聚體等等，進而抑制pcr擴增，特別是在模板量低的情況，會使這種情況加劇。本發(fā)明恒溫擴增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下（如37℃）進行核酸的擴增，與傳統(tǒng)的pcr技術(shù)相比，不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對酶的損耗。同時恒溫擴增技術(shù)在體系中不需要加入過量的引物，降低了引物與模板錯配或生成引物二聚體的可能性。另外，恒溫擴增體系有多重工具酶匹配進行有效擴增，擴增效率遠遠高于傳統(tǒng)pcr技術(shù)，所用時間更短，最短可以在5min內(nèi)實現(xiàn)。最后，相對于目前其他恒溫擴增技術(shù)平臺相比，本發(fā)明所用的重組酶依賴擴增技術(shù)平臺是新一代核酸檢測的利器，在檢測的時效性，便捷性和技術(shù)參數(shù)等多個方面都優(yōu)于其它恒溫擴增技術(shù)平臺，通過試劑的有效匹配，甚至可以在人體腋下進行擴增反應(yīng)。在該技術(shù)平臺上，除了可以開發(fā)基于小型便攜式設(shè)備用于醫(yī)療檢測機構(gòu)如醫(yī)院急診科、婦產(chǎn)科、手術(shù)室；社區(qū)服務(wù)中心和基層醫(yī)療機構(gòu)；檢驗檢疫疾病防控機構(gòu)的分子診斷產(chǎn)品，還可以開發(fā)出適合家庭使用的分子診斷產(chǎn)品，使我國不同區(qū)域即便存在經(jīng)濟條件參差不齊的情況下，也可以展開全國性病毒性疾病、腫瘤和遺傳性疾病的定期和快速普查。這是一個非常巨大的潛在市場，其經(jīng)濟價值和社會效益不可估量。當(dāng)前我們已經(jīng)開發(fā)適用于醫(yī)療機構(gòu)和家庭使用的hiv檢測產(chǎn)品和宮頸癌hpv檢測產(chǎn)品。隨著平臺的不斷成熟，可進一步拓展到食品安全、檢驗檢疫、防恐等多個領(lǐng)域。本發(fā)明念珠菌基因分型即時檢測試劑盒將恒溫擴增技術(shù)應(yīng)用到念珠菌感染的檢測上，縮短了反應(yīng)時間，降低了體系對反應(yīng)條件的要求，大大地提高了檢測的效率，也不需要人為主觀判讀結(jié)果，同時檢測結(jié)果不受混合感染的干擾，因此能更準確的提示混合感染的類型，非常有利于臨床的快速診斷和對癥治療。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種念珠菌基因分型即時檢測試劑盒，包括反應(yīng)液，啟動液，反應(yīng)酶系，念珠菌特異性引物及探針。念珠菌基因分型即時檢測試劑盒反應(yīng)液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分數(shù)/質(zhì)量濃度）tris-hcl50mmkcl40mm二硫蘇糖醇2mm甜菜堿1m海藻糖3.5%peg5.5%bsa0.1mg/ml作為上述反應(yīng)液的進一步改進，tris-hcl的ph為7.0～9.0，優(yōu)選ph為8.3。念珠菌基因分型即時檢測試劑盒啟動液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂5mm~20mm作為上述啟動液的進一步改進，氯化鎂的優(yōu)選濃度為10mm。念珠菌基因分型即時檢測試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結(jié)合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm作為上述反應(yīng)酶系的進一步改進，重組酶選自e.colirect蛋白。念珠菌基因分型即時檢測試劑盒特異性引物及探針序列如下：上游引物1tcaacaacggatctcttggttctc（seqidno：1）下游引物1aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg（seqidno：2）熒光探針1catcgatgaagaacgcagcgaaatgcga(fam-dt)ta(dspacer)gt(bhq-dt)aatrtgaattgcaga（seqidno：3）上游引物2aactttcaacaacggatctcttgg（seqidno：4）下游引物2tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac（seqidno：5）熒光探針2cgtgaatcatcgaatct(fam-dt)t(dspacer)t(bhq-dt)gaacgcacattgcgccc（seqidno：6）上游引物3atcgaatctttgaacgcacattgcg（seqidno：7）下游引物3atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg（seqidno：8）熒光探針3catcgatgaagaacgcagcgaaa(fam-dt)gc(dspacer)at(bhq-dt)acgtaatrtgaattgcaga（seqidno：9）作為本發(fā)明方法的進一步改進，恒溫擴增的溫度為35～42℃，優(yōu)選擴增溫度為37℃。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的恒溫擴增體系，不依賴于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相對現(xiàn)有的恒溫擴增體系，其組成更為簡單，成本更為低廉，使用更為方便。本發(fā)明的恒溫擴增體系適用于復(fù)雜模板的擴增，擴增速度快且穩(wěn)定，可以在15min以內(nèi)完成擴增反應(yīng)，擴增的靈敏度和準確性高，不易出現(xiàn)錯配，擴增效果好。本發(fā)明的恒溫擴增體系使用熒光實時定量技術(shù)，應(yīng)用范圍更廣，適用于市面上大多數(shù)熒光定量擴增儀。本發(fā)明同時檢測3種致病念珠菌，分別是白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌。對比常規(guī)檢測的培養(yǎng)方法，時間更短，靈敏度高受培養(yǎng)條件限制少，人為誤操作幾率低。附圖說明：圖1至圖10依次分別為實施例1至實施例10的熒光結(jié)果圖，圖中熒光曲線的標(biāo)號對應(yīng)實施例中反應(yīng)管的標(biāo)號。具體實施方式一種念珠菌基因分型即時檢測試劑盒，采用了一種不依賴于高能能量分子的恒溫擴增技術(shù)。試劑盒成分包括反應(yīng)液，啟動液，反應(yīng)酶系，念珠菌特異性引物及探針，各成分的具體組分如下：念珠菌基因分型試劑盒念珠菌基因分型即時檢測試劑盒反應(yīng)液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分數(shù)/質(zhì)量濃度）tris-hcl（ph8.3）50mmkcl40mm二硫蘇糖醇2mm甜菜堿1m海藻糖3.5%peg5.5%bsa0.1mg/ml念珠菌基因分型即時檢測試劑盒啟動液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂10mm念珠菌基因分型即時檢測試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結(jié)合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm念珠菌基因分型即時檢測試劑盒特異性引物及探針序列如下：上游引物1tcaacaacggatctcttggttctc（seqidno：1）下游引物1aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg（seqidno：2）熒光探針1catcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata(fam-dt)tc(dspacer)at(bhq-dt)aatrtgaattgcaga（seqidno：3）上游引物2aactttcaacaacggatctcttgg（seqidno：4）下游引物2tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac（seqidno：5）熒光探針2cgtgaatcatcgaatct（fam-dt)tt(dspacer)tt(bhq-dt)gaacgcacattgcgccc（seqidno：6）上游引物3atcgaatctttgaacgcacattgcg（seqidno：7）下游引物3atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg（seqidno：8）熒光探針3catcgatgaagaacgcagcgaaa(fam-dt)tg(dspacer)gat(bhq-dt)acgtaatrtgaattgcaga（seqidno：9）下面結(jié)合具體的實驗，進一步說明念珠菌基因分型即時檢測試劑盒的優(yōu)勢，但并非限制本發(fā)明。實驗樣本來源：以念珠菌感染患者中分離的熱帶念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌、經(jīng)提取得到的核酸溶液作為樣本；以混合熱帶念珠菌-光滑念珠菌、熱帶念珠菌-白色念珠菌、光滑念珠菌-白色念珠菌的核酸溶液作為混合感染樣本；以外購金黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、加德納菌、陰道毛滴蟲、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌經(jīng)提取得到的核酸溶液作為特異性實驗的樣本；以正常人陰道分泌物提取物為陰性對照樣本。實施例1（3種念珠菌的檢測）：取6個200ul反應(yīng)管，分別標(biāo)記為反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1~6中分別加入20ul反應(yīng)液、5ul反應(yīng)酶系；在反應(yīng)管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）；在反應(yīng)管3、4中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、熒光探針2（150nm）；在反應(yīng)管5、6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、熒光探針3（150nm）。在反應(yīng)管1中加入熱帶念珠菌樣本2ul，反應(yīng)管3中加入光滑念珠菌樣本2ul、反應(yīng)管5加入白色念珠菌樣本2ul，反應(yīng)管2,、4、6都分別加入陰性對照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光。實施例2（非最優(yōu)擴增溫度條件的檢測）：同實施例1，不同之處在于上機條件改為：35℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖2。實施例3（非最優(yōu)擴增溫度條件的檢測）：同實施例1，不同處在于上機條件改為：42℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖3。實施例4（特異性實驗）：按照實施例1配制體系42管，分別標(biāo)記1~42反應(yīng)管。在1~14反應(yīng)管的體系中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）；在15~28反應(yīng)管的體系中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、熒光探針2（150nm；在28~42反應(yīng)管的體系中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、熒光探針3（150nm）。在1~13號反應(yīng)管中按順序分別加入熱帶念珠菌、黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、加德納菌、陰道毛滴蟲、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌樣本2ul；在14~26號反應(yīng)管中按順序分別加入光滑念珠菌、黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、加德納菌、陰道毛滴蟲、熱帶念珠菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌的樣本2ul；在27~34號反應(yīng)管中按順序分別加入白色念珠菌、黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、加德納菌、陰道毛滴蟲、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖4。實施例5（熱帶念珠菌重復(fù)性實驗）：按實施例1配制體系6管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1~6中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）。在反應(yīng)管1~3中均加入熱帶念珠菌樣本2ul，在反應(yīng)管4~6中加入陰性對照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖5。實施例6（光滑念珠菌重復(fù)性實驗）：按實施例1配制體系6管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1~6中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、熒光探針2（150nm）。在反應(yīng)管1~3中均加入光滑念珠菌樣本2ul，在反應(yīng)管4~6中加入陰性對照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖6。實施例7（白色念珠菌重復(fù)性實驗）：按實施例1配制體系6管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1~6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、熒光探針3（150nm）。在反應(yīng)管1~3中均加入白色念珠菌樣本2ul，在反應(yīng)管4~6中加入陰性對照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖7。實施例8（熱帶念珠菌和光滑念珠菌混合感染檢測）：按實施例1配制體系6管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、熒光探針1（150nm）；在反應(yīng)管3、4中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、熒光探針2（150nm）；在反應(yīng)管5、6中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、熒光探針3（150nm）。在反應(yīng)管1、3、5中均加入熱帶念珠菌和光滑念珠菌菌混合感染樣本2ul；在反應(yīng)管2、4、6中均加入陰性對照樣本2ul。各反應(yīng)管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻后各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖8。實施例9（熱帶念珠菌和白色念珠菌混合感染檢測）：同實施例8，不同處是往反應(yīng)管1、3、5中均加入熱帶念珠菌和白色念珠菌混合感染樣本2ul。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖8。實施例10（光滑念珠菌和白色念珠菌混合感染檢測）：同實施例8，不同處是往反應(yīng)管1、3、5中均加入光滑念珠菌和白色念珠菌混合感染樣本2ul。選擇熒光定量pcr儀進行擴增及收集熒光，具體上機條件為：37℃，30s，30個循環(huán)，每個循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖10。結(jié)論：1.從圖1的結(jié)果可以看出，對應(yīng)的病原體樣本擴增結(jié)果都有“s”型擴增曲線，說明本發(fā)明試劑盒的恒溫擴增效果好。2.從圖2、3的結(jié)果可以看出，即使不是在最適溫度下進行擴增反應(yīng)，仍然得到穩(wěn)定的陽性結(jié)果，說明本發(fā)明試劑盒的容錯率高、穩(wěn)定性強。3.從圖4的結(jié)果可以看出，非本試劑盒檢測范圍內(nèi)的其他陰道內(nèi)微生物（金黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、加德納菌、陰道毛滴蟲、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌）不會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，且本試劑盒可檢測的熱帶念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌的檢測相互之間不產(chǎn)生干擾，說明本試劑盒的特異性強。4.從圖5、6、7的結(jié)果可以看出，對熱帶念珠菌和光滑念珠菌、白色念珠菌進行了重復(fù)實驗，均得到相應(yīng)的“s”型擴增曲線，說明本試劑盒的靈敏度高。5.從圖8、9、10的結(jié)果可以看出，混合感染型的樣本中不同致病病原體相互之間不造成干擾，檢測結(jié)果無誤，說明本試劑盒的特異性好、穩(wěn)定性強。綜上，本發(fā)明試劑盒的擴增效果好，特異性強，容錯率高，穩(wěn)定性強，靈敏度高。sequencelisting<110>廣州和實生物技術(shù)有限公司<120>一種念珠菌基因分型即時檢測試劑盒<130>2016<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1tcaacaacggatctcttggttctc24<210>2<211>34<212>dna<213>人工序列<400>2aattgtggtggccactagcaaaataagcgttttg34<210>3<211>47<212>dna<213>人工序列<400>3catcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatagtaatrtgaattgcaga47<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<400>4aactttcaacaacggatctcttgg24<210>5<211>37<212>dna<213>人工序列<400>5tcaacaccgagttggtaaaacctaatacagtattaac37<210>6<211>36<212>dna<213>人工序列<400>6cgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccc36<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7atcgaatctttgaacgcacattgcg25<210>8<211>34<212>dna<213>人工序列<400>8atatacgtggtggacgttaccgccgcaagcaatg34<210>9<211>46<212>dna<213>人工序列<400>9catcgatgaagaacgcagcgaaagcatacgtaatrtgaattgcaga46當(dāng)前第1頁12