本發(fā)明屬于木材材種鑒定的分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別檀香紫檀和染料紫檀的微型dna條形碼及其鑒別方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

檀香紫檀(pterocarpussantalinusl.f.)，隸豆科紫檀屬，主產(chǎn)于印度，是一種名貴的紅木樹(shù)種。由于巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，檀香紫檀木材資源逐漸匱乏，被列入瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(cites)附錄ii管制。近年來(lái)，木材市場(chǎng)出現(xiàn)一種與檀香紫檀構(gòu)造極為相近的染料紫檀(pterocarpustinctoriuswelw.)，俗稱“血檀”或“贊比亞血檀”，主產(chǎn)于非洲。由于構(gòu)造特征的相似性，不法商家經(jīng)常將其用于作為檀香紫檀的混偽品，嚴(yán)重?cái)_亂了木材貿(mào)易市場(chǎng)，同時(shí)也侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。由于二者宏觀及微觀構(gòu)造極為近似，通過(guò)傳統(tǒng)的木材解剖技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)鑒別區(qū)分。而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的dna條形碼技術(shù)卻為木材“種”水平識(shí)別提供了可能。同時(shí)，針對(duì)檀香紫檀和染料紫檀物種的序列差異，開(kāi)發(fā)特異專屬性的dna引物，為有效鑒別二者提供了科學(xué)途徑。

木材進(jìn)出口貿(mào)易中所需鑒定的樣品大多是經(jīng)過(guò)干燥處理或較長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)的干木材。受干燥處理及存儲(chǔ)時(shí)間等因素影響，木材細(xì)胞中殘存的dna會(huì)進(jìn)一步發(fā)生降解及片段化。有研究表明，僅能從存儲(chǔ)數(shù)十年的干木材中獲取長(zhǎng)度小于200bp的dna片段。然而，用于物種識(shí)別的植物dna條形碼片段長(zhǎng)度通常大于650bp，這就給dna條形碼技術(shù)應(yīng)用于已發(fā)生嚴(yán)重dna降解的木材樣本的識(shí)別帶來(lái)了很大難度。

而微型dna條形碼是一段長(zhǎng)度通常為100-250bp的可用于物種識(shí)別的短dna片段，針對(duì)博物館動(dòng)物標(biāo)本等dna發(fā)生降解材料提出。與完整dna條形碼(～650bp)相比，微型dna條形碼具有更高的獲取成功率，同時(shí)與完整dna條形碼物種識(shí)別能力也較為接近。因此，微型dna條形碼為dna發(fā)生嚴(yán)重降解的干燥處理或長(zhǎng)期存儲(chǔ)木材的物種識(shí)別提供科學(xué)新途徑。

總體來(lái)說(shuō)，基于木材解剖學(xué)的傳統(tǒng)識(shí)別技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)木材“種”水平的識(shí)別，而新興的微型dna條形碼技術(shù)逐步成為木材識(shí)別技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)傳統(tǒng)木材識(shí)別技術(shù)無(wú)法準(zhǔn)確鑒別檀香紫檀和染料紫檀，而提供一種基于質(zhì)體基因間隔ndhf-rpl32微型dna條形碼序列差異實(shí)現(xiàn)二者準(zhǔn)確區(qū)分的分子鑒別方法。

所以，本發(fā)明的第一目的是提供一種鑒別檀香紫檀和染料紫檀的微型dna條形碼。

本發(fā)明的第二目的是提供一種鑒別檀香紫檀和染料紫檀的分子方法。

本發(fā)明的第三目的是提供所述微型dna條形碼和分子方法在鑒別檀香紫檀和染料紫檀中的應(yīng)用。

基于此，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供了一種鑒別檀香紫檀和染料紫檀的微型dna條形碼，所述微型dna條形碼為dna序列ndhf-rpl32或該序列的一部分。

優(yōu)選的，所述微型dna條形碼為dna序列ndhf-rpl32的部分序列，如，檀香紫檀的微型dna條形碼如seqidno.1所示，染料紫檀的微型dna條形碼如seqidno.2所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種鑒別檀香紫檀和染料紫檀的分子方法，該方法是利用微型dna條形碼ndhf-rpl32序列差異，檀香紫檀的微型dna條形碼如seqidno.1所示，染料紫檀的微型dna條形碼如seqidno.2所示，并利用分子生物學(xué)的方法來(lái)鑒別檀香紫檀和染料紫檀。

具體地，所述方法包括以下步驟：

(1)將木材樣品研磨處理成木粉；

(2)提取步驟(1)所得木粉樣品的dna；

(3)以步驟(2)提取得到的dna為模板，用序列ndhf-rpl32正反引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(4)將步驟(3)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序產(chǎn)物分別與seqidno.1和seqidno.2進(jìn)行比對(duì)后鑒別檀香紫檀與染料紫檀。

優(yōu)選的，步驟(1)中所述木粉研磨至200目及以上。

優(yōu)選的，步驟(2)中所述dna需進(jìn)行純化，dna終濃度為1-200ng/μl。

優(yōu)選的，步驟(3)中所述pcr擴(kuò)增的引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

優(yōu)選的，步驟(3)中所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為0.5-3udna聚合酶、1.0-2.0mmmgcl2、200μm單一dntp、0.1-5.0μm單一引物、ph7.0-8.0的0.1-1.5mg/ml牛血清白蛋白和10-1000ng模板dna；pcr反應(yīng)條件為94-96℃預(yù)變性0.5-10min；94-96℃變性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循環(huán)20-50次；72℃終延伸2-15min。

優(yōu)選的，步驟(4)的鑒別標(biāo)準(zhǔn)為若測(cè)序產(chǎn)物與seqidno.1序列一致或相似度為99％及以上，則該樣品為檀香紫檀；若測(cè)序序列與seqidno.2序列一致或相似度為99％及以上，該樣品為染料紫檀。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述微型dna條形碼，或鑒別檀香紫檀和染料紫檀的分子方法在鑒別檀香紫檀和染料紫檀中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明基于一種微型dna條形碼序列差異，可以實(shí)現(xiàn)檀香紫檀與染料紫檀的準(zhǔn)確鑒別，突破了傳統(tǒng)木材識(shí)別技術(shù)的局限；

2、本發(fā)明設(shè)計(jì)的鑒別引物特異性好，擴(kuò)增及測(cè)序成功率高；

3、本發(fā)明優(yōu)選的dna條形碼對(duì)于檀香紫檀與染料紫檀樹(shù)種存在明顯的差異位點(diǎn)，具有較高的鑒別能力；

4、本發(fā)明適用范圍廣，適用于氣干、干燥窯處理、標(biāo)本、考古及其他長(zhǎng)期存儲(chǔ)方式等各種加工處理?xiàng)l件下的檀香紫檀和染料紫檀木材的鑒別；

5、本發(fā)明取樣量極少，且不受取材位置(邊材、心邊材過(guò)渡區(qū)及心材)、樣品原始狀態(tài)(木塊、木粉)因素影響；

6、本發(fā)明實(shí)驗(yàn)條件依賴少，一般pcr實(shí)驗(yàn)室均可滿足；

7、本發(fā)明為木材識(shí)別技術(shù)提供了一種新的途徑和思路。

總之，本發(fā)明提供的鑒別檀香紫檀和染料紫檀的微型dna條形碼及其方法可實(shí)現(xiàn)檀香紫檀和染料紫檀的準(zhǔn)確鑒別，解決了依靠傳統(tǒng)木材解剖手段無(wú)法鑒別二者的難題，為海關(guān)、質(zhì)量檢驗(yàn)檢疫等木材貿(mào)易監(jiān)管執(zhí)法部門(mén)和木材經(jīng)營(yíng)貿(mào)易人員提供一種高效可靠的檀香紫檀和染料紫檀鑒別方法，具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1檀香紫檀與染料紫檀ndhf-rpl32序列比對(duì)；

圖2三種dna序列的pcr擴(kuò)增成功率及測(cè)序成功率對(duì)比。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的發(fā)明范圍。該技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)性的改進(jìn)和調(diào)整。

實(shí)施例1：檀香紫檀與染料紫檀特異性引物設(shè)計(jì)

(1)下載genbank中檀香紫檀和染料紫檀的質(zhì)體dna序列rbcl、matk和ndhf-rpl32(表1)；

表1genbank中檀香紫檀和染料紫檀三種dna片段登錄號(hào)

(2)應(yīng)用clustalx1.81軟件比對(duì)序列，并查找確定檀香紫檀和染料紫檀二者各片段序列的差異位點(diǎn)；

(3)應(yīng)用primerpremier5.0軟件對(duì)rbcl、matk和ndhf-rpl32三個(gè)條形碼設(shè)計(jì)引物。所述擴(kuò)增引物如表2所示。

表2三個(gè)條形碼引物信息

實(shí)施例2：檀香紫檀與染料紫檀標(biāo)準(zhǔn)樣品的微型dna條形碼序列選優(yōu)與確定

(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品采集。

檀香紫檀標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)9號(hào)，其中從中國(guó)林科院木材標(biāo)本館選取檀香紫檀樹(shù)種4號(hào)木材標(biāo)本cafw23674，cafw23675，cafw23676，cafw22653；從中國(guó)海南省樂(lè)東縣尖峰嶺采集進(jìn)行植物學(xué)鑒定的檀香紫檀葉片5號(hào)，分別為txl01，txl02，txl03，txl04，txl05。染料紫檀標(biāo)準(zhǔn)樣品3號(hào)，為rlw01，rlw02，rll01，分別采自剛果民主共和國(guó)的木材邊材、木材心材及葉片。

(2)樣品制備。

選取木材樣品，利用70％酒精消毒后的解剖刀片將木材試樣外表面切除，以避免外源污染；將木材試樣切成若干木屑，并置于低溫冷凍研磨儀中低溫預(yù)冷3min，研磨3min，運(yùn)行頻率10cps；研磨結(jié)束后，過(guò)200目篩網(wǎng)，將細(xì)木粉分裝到若干50ml的微量離心管中，每管木粉量500mg，并置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

針對(duì)葉片樣品，在液氮環(huán)境中人工研磨。研磨結(jié)束后，分裝置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)dna提取。

在消毒處理的超凈工作環(huán)境中，對(duì)木材(或葉片)進(jìn)行dna提取。

(4)pcr擴(kuò)增反應(yīng)與測(cè)序。

引物對(duì)為實(shí)施例1中的三個(gè)dna序列引物對(duì)，以dna提取物為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系為30μl：其中premixextaq15μl(包括l.25uextaqdna聚合酶，2mmmgcl2，200μm單一dntp)，0.2μm單一引物和約20ng模板dna。所有pcr反應(yīng)均在pcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，50℃(rbcl)、52℃(matk)及47℃(ndhf-rpl32)退火30s，72℃延伸20s，循環(huán)40次；72℃終延伸7min，即可獲得高效擴(kuò)增的dna目的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向直接測(cè)序。

(5)序列比對(duì)分析。

應(yīng)用contigexpress軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，去除兩端低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接及校對(duì)。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，檀香紫檀和染料紫檀2個(gè)樹(shù)種中長(zhǎng)度485bp的rbcl片段之間僅存在1個(gè)差異位點(diǎn)，片段長(zhǎng)度為273bp的matk存在2個(gè)差異位點(diǎn)，而片段長(zhǎng)度為177bp的微型條形碼ndhf-rpl32(檀香紫檀如seqidno.1所示，染料紫檀如seqidno.2所示)存在8個(gè)差異位點(diǎn)(包含6個(gè)連續(xù)插入缺失和2個(gè)堿基突變(圖1)。表明微型條形碼ndhf-rpl32具有更高的鑒別能力。

(6)微型dna條形碼優(yōu)選與確定。

對(duì)比rbcl、matk和ndhf-rpl32三個(gè)條形碼的擴(kuò)增成功率、測(cè)序成功率。微型dna條形碼ndhf-rpl32相比其他普通條形碼rbcl和matk具有更高的擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率(圖2)；基于k2p距離(kimura-2-parameterdistance)比對(duì)種間種內(nèi)差異表明，檀香紫檀與染料紫檀種間遺傳距離(0.018)明顯大于種內(nèi)遺傳距離(0)，得出微型條形碼ndhf-rpl32存在條形碼間隔(barcodinggap)，即種間差異大于種內(nèi)差異，滿足理想dna條形碼的要求。

綜上，通過(guò)三種質(zhì)體dna條形碼的優(yōu)選比對(duì)，發(fā)明人認(rèn)定了ndhf-rpl32作為鑒別檀香紫檀和染料紫檀的條形碼。

實(shí)施例3：染料紫檀新鮮木材樣品dna鑒別

(1)染料紫檀新鮮木材樣品采集。

于2015年4月16日從剛果民主共和國(guó)加丹加省(s10°e28°)采集染料紫檀新鮮木材樣品rlw03。木材解剖學(xué)觀察表明，該木材樣品具有《紅木》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb/t18107—2000中紫檀木類(lèi)木材特征，然而木材解剖特征不能區(qū)別該樣品為檀香紫檀還是染料紫檀。

(2)制備木粉并研磨至200目及以上。

(3)木材dna提取。

在消毒處理的超凈工作環(huán)境中，對(duì)木材進(jìn)行dna提取。所述dna還需進(jìn)行純化，dna終濃度為1-200ng/μl。

(4)pcr擴(kuò)增反應(yīng)與測(cè)序。

木材dna提取物為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增引物如seqidno.7和seqidno.8所示。反應(yīng)體系為30μl：其中premixextaq15μl(包括l.25uextaqdna聚合酶，2mmmgcl2，200μm單一dntp)，0.2μm單一引物和約20ng模板dna。所有pcr反應(yīng)均在pcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，47℃退火30s，72℃延伸20s，循環(huán)40次；72℃終延伸7min，即可獲得高效擴(kuò)增的dna目的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向直接測(cè)序。

(5)序列比對(duì)分析與樹(shù)種鑒別。測(cè)序序列結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與序列seqidno.2相似度高于99％，確定為染料紫檀。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。