本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析挖掘玉米籽粒油脂代謝機(jī)制的方法。

背景技術(shù)：

玉米是世界三大主要農(nóng)作物之一，20世紀(jì)90年代以來，世界玉米總產(chǎn)量首次超越水稻和小麥，成為第一位的糧食作物。玉米籽粒中累積了大量的儲(chǔ)存物質(zhì)包括淀粉、油份和蛋白。隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的變化，以及淀粉和油脂加工業(yè)的發(fā)展，玉米品種由產(chǎn)量型逐漸向質(zhì)量型轉(zhuǎn)變，玉米品質(zhì)及其專用性變得越來越重要。

玉米油富含維生素e等多種微量元素，不飽和脂肪酸的含量達(dá)80%以上。長(zhǎng)期食用玉米油可防治夜盲癥、干眼病等多種疾病，并可降低人體血液中的膽固醇含量，預(yù)防粥樣動(dòng)脈硬化和冠狀動(dòng)脈硬化。因此玉米油享有―健康油的美譽(yù)。高油玉米是指籽粒含油量高于6%的玉米。玉米籽粒中85%左右的油份儲(chǔ)存在胚中，所以高油玉米往往具有一個(gè)較大的胚面，同時(shí)高油玉米具有較高的蛋白質(zhì)、賴氨酸、色氨酸含量。作為飼料，高油玉米可以顯著提高牲畜的產(chǎn)肉率。除籽粒品質(zhì)優(yōu)良外，高油玉米的秸稈含有較高的粗蛋白、粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可作青飼或青貯，是草食動(dòng)物的優(yōu)良飼料。因此，兼顧產(chǎn)量和抗逆性等重要農(nóng)藝性狀的前提下，提高玉米籽粒含油量成為當(dāng)代玉米育種的重要方向，研究玉米籽粒中油脂合成和累積的遺傳機(jī)理和調(diào)控機(jī)制對(duì)于增加玉米產(chǎn)量、提高籽粒品質(zhì)、培育高油特用型玉米具有重要意義和應(yīng)用前景。

玉米籽粒含油量是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，且具有較高的遺傳力。連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析是目前較為常見的用來解析玉米油脂代謝遺傳機(jī)理的方法，這兩種分析方法企在通過建立表型與基因型之間的聯(lián)系，挖掘控制油份表型性狀的遺傳位點(diǎn)，而這些遺傳位點(diǎn)之間相對(duì)獨(dú)立，它們之間的調(diào)控關(guān)系、遺傳和分子機(jī)制未知，并且傳統(tǒng)分析方法需要多年多點(diǎn)的表型鑒定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析挖掘玉米籽粒油脂代謝機(jī)制的方法，該方法通過動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析，以已知的玉米籽粒油份關(guān)聯(lián)基因?yàn)槟繕?biāo)基因，鑒定調(diào)控該基因?qū)脖磉_(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)的調(diào)控基因，從而解析玉米籽粒油脂代謝的調(diào)控機(jī)制以及遺傳和分子機(jī)制，對(duì)高油玉米的遺傳改良提供新的基因資源，以及為玉米其它農(nóng)藝性狀的調(diào)控機(jī)制研究提供思路和方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析挖掘玉米籽粒油脂代謝機(jī)制的方法，所述機(jī)制包括調(diào)控機(jī)制及遺傳和分子機(jī)制，均包括以下步驟：

（1）收集玉米自交系授粉后15天的籽粒轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得基因表達(dá)量數(shù)據(jù)；

（2）收集26個(gè)與玉米籽粒含油量相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)據(jù)；

（3）收集玉米自交系組成的關(guān)聯(lián)群體的籽粒含油量數(shù)據(jù)；

（4）動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析la模型的建立；

（5）全基因組范圍內(nèi)挖掘調(diào)控26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)變化的的調(diào)控基因及全基因范圍內(nèi)鑒定與26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)的候選基因；

（6）對(duì)候選基因進(jìn)行功能注釋；

（7）檢測(cè)候選基因是否落在油份性狀的qtl區(qū)間內(nèi)；

（8）提取候選基因上下游100kb范圍內(nèi)的所有snp標(biāo)記，與玉米自交系的油份表型數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)段關(guān)聯(lián)分析。

進(jìn)一步的，所述玉米自交系根據(jù)系譜信息分成了2組：熱帶和亞熱帶、溫帶，小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行，所有材料均進(jìn)行自交，收獲未成熟的授粉后15天的籽粒，每個(gè)自交系的兩個(gè)重復(fù)各取3-4穗，每穗取1-2粒籽粒，混合提取籽粒總rna，隨機(jī)選擇玉米自交系數(shù)量個(gè)樣品用于rna-seq。

上述rna-seq具體通過以下步驟：首先，用ploy（t）寡聚核苷酸從總rna中抽取全部帶ploy（a）尾的rna，主要為mrna，然后將截獲的mrna隨機(jī)打斷成片段，用六堿基隨機(jī)引物合成cdna第一鏈，并加入逆轉(zhuǎn)錄酶合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并對(duì)cdna片段進(jìn)行末端修飾，連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用illuminagaⅱ基因分析系統(tǒng)進(jìn)行序列測(cè)定及分析，獲得基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)。

進(jìn)一步的，所述基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行的缺失值預(yù)處理如下：對(duì)于數(shù)據(jù)集中的每個(gè)基因，如果其表達(dá)值在高于30%的樣本中缺失，則在后續(xù)的分析中舍棄該基因。

進(jìn)一步的，所述調(diào)控機(jī)制的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析la模型具體采用以下方法建立：la的數(shù)學(xué)定義如下：

la(x,y|z)=eg'(z)公式1

其中，所述x為26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)量，y為26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)量，z為全基因組基因表達(dá)量；假設(shè)x，y，z是均值為0，方差為1的連續(xù)隨機(jī)變量，則x，y的相關(guān)性表示為e(xy)；當(dāng)z=z時(shí)，g(z)=e(xy|z=z)，g(z)檢測(cè)的是當(dāng)z=z時(shí)，xy基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式。g(z)的導(dǎo)數(shù)表示為g'(z)，該值可用于共表達(dá)模式變化的期望測(cè)定，

當(dāng)z符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布時(shí)，la值可簡(jiǎn)單的表示為la(x,y|z)=e(xyz)。

x，y，z代表具有正態(tài)分布表達(dá)譜的三個(gè)基因，則la(x,y|z)表示為：e(xyz)=(x1y1z1+x2y2z2+...+xmymzm)/m公式2

la用來反應(yīng)基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化，即當(dāng)z基因表達(dá)量較高時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈正相關(guān)（co-regulated），e(xy|z=1)為正數(shù)；當(dāng)z基因表達(dá)量較低時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈負(fù)相關(guān)（contra-regulated，），e(xy|z=0)為負(fù)數(shù)，因此基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由正相關(guān)（co-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)（contra-regulated），la值記為正；相反，基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由負(fù)相關(guān)（contra-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)檎嚓P(guān)（co-regulated），la值記為負(fù)。

進(jìn)一步的，所述遺傳和分子機(jī)制的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析la模型具體采用以下方法建立：la的數(shù)學(xué)定義如下：

la(x,y|z)=eg'(z)公式1

其中，所述x為26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)量，y為全基因組基因表達(dá)量，z為全基因組基因表達(dá)量；假設(shè)x，y，z是均值為0，方差為1的連續(xù)隨機(jī)變量，則x，y的相關(guān)性表示為e(xy)；當(dāng)z=z時(shí)，g(z)=e(xy|z=z)，g(z)檢測(cè)的是當(dāng)z=z時(shí)，xy基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式。g(z)的導(dǎo)數(shù)表示為g'(z)，該值可用于共表達(dá)模式變化的期望測(cè)定，

當(dāng)z符合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布時(shí)，la值可簡(jiǎn)單的表示為la(x,y|z)=e(xyz)。

x，y，z代表具有正態(tài)分布表達(dá)譜的三個(gè)基因，則la(x,y|z)表示為：e(xyz)=(x1y1z1+x2y2z2+...+xmymzm)/m公式2

la用來反應(yīng)基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化，即當(dāng)z基因表達(dá)量較高時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈正相關(guān)（co-regulated），e(xy|z=1)為正數(shù)；當(dāng)z基因表達(dá)量較低時(shí)，xy基因?qū)Φ谋磉_(dá)量呈負(fù)相關(guān)（contra-regulated，），e(xy|z=0)為負(fù)數(shù)，因此基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由正相關(guān)（co-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān)（contra-regulated），la值記為正；相反，基因?qū)Φ谋磉_(dá)調(diào)控模式由負(fù)相關(guān)（contra-regulated）轉(zhuǎn)變?yōu)檎嚓P(guān)（co-regulated），la值記為負(fù)。

上述動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析模型中的顯著性水平評(píng)估步驟如下：混合所有基因的表達(dá)量值；在每次模擬中，用放回隨機(jī)抽樣法隨機(jī)抽取一對(duì)基因（x，y）的表達(dá)量值,z基因取全基因組所有基因，計(jì)算xy基因?qū)υ谌蚪M的la值，可分別得到la的正極大值和負(fù)極小值；重復(fù)模擬一百萬次，分別得到la的正值參考分布和負(fù)值參考分布（圖4），用la正負(fù)參考分布的99%分位數(shù)作為la正負(fù)顯著性閾值。

進(jìn)一步的，所述關(guān)聯(lián)分析采用混合線性模型，統(tǒng)計(jì)模型如下：

y=xβ+sα+zμ+qυ+e

所述y為表型觀察值；β為除標(biāo)記和群體結(jié)構(gòu)以外的未知固定效應(yīng)值；α為標(biāo)記的效應(yīng)值；υ為群體結(jié)構(gòu)的效應(yīng)值；μ為多基因遺傳背景的效應(yīng)值；e為殘差；q為群體結(jié)構(gòu)的矩陣；x、s、z分別為y與β、α、μ相關(guān)的矩陣，關(guān)聯(lián)分析采用tassel3.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

進(jìn)一步的，所述區(qū)段關(guān)聯(lián)分析的具體方法如下：提取候選基因5'utr上游50kb和3'utr下游50kb共100kb范圍內(nèi)的所有snp標(biāo)記，結(jié)合關(guān)聯(lián)群體的含油量表型數(shù)據(jù)，采用混合線性模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

本發(fā)明采用的是轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得的368個(gè)玉米自交系中28769個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用la分析方法，全基因組范圍內(nèi)挖掘調(diào)控26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因的共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)的調(diào)控基因；通過功能注釋、qtl共定位分析、區(qū)段關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步闡述玉米籽粒油脂代謝的調(diào)控機(jī)制。我們將創(chuàng)新性的利用基因?qū)脖磉_(dá)模式的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析的新方法，全基因組范圍內(nèi)挖掘調(diào)控油脂代謝途徑的基因，探索基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，解析籽粒油脂代謝的調(diào)控機(jī)制。該研究思路創(chuàng)新，在植物學(xué)領(lǐng)域該項(xiàng)研究尚無報(bào)道。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明基于表達(dá)模式越相近的基因，其功能相近的可能性越大這一科學(xué)假設(shè)，以調(diào)控已知的油份關(guān)聯(lián)基因共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)為突破口，可快速有效的鑒定調(diào)控籽粒油脂代謝的調(diào)控基因；

（2）通過基因?qū)脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，可鑒定基因之間的調(diào)控關(guān)系；

（3）本發(fā)明可以為玉米數(shù)量性轉(zhuǎn)的調(diào)控機(jī)制及遺傳和分子機(jī)制鑒定提供新思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1分析調(diào)控機(jī)制的流程圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2遺傳和分子機(jī)制的流程圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1玉米籽粒含油量關(guān)聯(lián)的26個(gè)基因。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1隨機(jī)模擬生成la值評(píng)估la分析的顯著性。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1grmzm2g319022基因的la分析。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1grmzm2g319022基因的基因結(jié)構(gòu)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1grmzm2g319022基因的區(qū)段關(guān)聯(lián)分析。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例2候選基因grmzm2g451672的區(qū)段關(guān)聯(lián)分析。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例2grmzm2g451672基因的結(jié)構(gòu)圖和功能域。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下述說明僅是實(shí)例性的，不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析挖掘玉米籽粒油脂代謝調(diào)控機(jī)制的方法，包括六步，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集、26個(gè)油份關(guān)聯(lián)基因的收集、玉米籽粒含油量qtl定位結(jié)果的收集、關(guān)聯(lián)群體籽粒含油量數(shù)據(jù)的收集、油份關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析，具體見圖1。

（1）基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集：

368份自交系（本發(fā)明所使用的玉米品種可為任意品種，包括中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)宋同明教授培育的35份高油玉米自交系（yang等，2010b））于2010年在湖北荊州種植，根據(jù)系譜信息分成了2組（熱帶和亞熱帶、溫帶），小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。所有材料均進(jìn)行自交，收獲未成熟的授粉后15天（15dap）的籽粒，每個(gè)自交系的兩個(gè)重復(fù)各取3-4穗，每穗取1-2粒籽粒，混合提取籽?？俽na，隨機(jī)選擇368個(gè)樣品用于rna-seq。樣品的rna-seq工作是由深圳華大基因研究院（beijinggenomicsinstitute，bgi）完成，測(cè)序方法簡(jiǎn)要描述如下：首先，用ploy（t）寡聚核苷酸從總rna中抽取全部帶ploy（a）尾的rna，主要為mrna，然后將截獲的mrna隨機(jī)打斷成片段，用六堿基隨機(jī)引物（randomhexamers）合成cdna第一鏈，并加入逆轉(zhuǎn)錄酶等合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并對(duì)cdna片段進(jìn)行末端修飾，連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用illuminagaⅱ基因分析系統(tǒng)進(jìn)行序列測(cè)定及分析。轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得的368個(gè)玉米自交系中28769個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，對(duì)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)集進(jìn)行的缺失值預(yù)處理如下：基因表達(dá)數(shù)據(jù)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中的噪聲、檢測(cè)技術(shù)等原因而存在缺失。對(duì)于數(shù)據(jù)集中的每個(gè)基因，如果其表達(dá)值在高于30%的樣本中缺失，則在后續(xù)的分析中舍棄該基因。

（2）26個(gè)油份關(guān)聯(lián)基因的收集：

在前期的一項(xiàng)研究中，我們結(jié)合覆蓋全基因組的最小等位基因頻率≥0.05的55萬個(gè)snp標(biāo)記和368份玉米自交系籽粒含油量性狀的表型值，利用mlm模型挖掘與籽粒含油量顯著關(guān)聯(lián)的snp位點(diǎn)。在全基因組顯著水平下（p<1.89×10^-6），共檢測(cè)到26個(gè)遺傳位點(diǎn)與含油量顯著關(guān)聯(lián)（圖3），對(duì)遺傳位點(diǎn)的候選基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)8個(gè)候選基因?yàn)閿M南芥中參與油脂代謝的同源基因，該結(jié)果為含油量關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析提供了目標(biāo)基因。

（3）玉米籽粒含油量qtl定位結(jié)果的收集：

收集玉米籽粒油份性狀qtl定位（表1），如果la分析檢測(cè)到的顯著基因落于控制玉米籽粒含油量的qtl之內(nèi)，則表明該基因有qtl的支持和驗(yàn)證。

表1玉米籽粒含油量和組分性狀qtl定位結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

（4）關(guān)聯(lián)群體籽粒含油量數(shù)據(jù)的收集

關(guān)聯(lián)群體分別于2009年春在四川雅安、2009年冬在云南西雙版納和海南三亞、2010年春在廣西南寧種植。508份材料根據(jù)系譜信息分成了2組（熱帶和亞熱帶、溫帶），小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。每個(gè)材料自交5-7穗，成熟后收獲授粉的果穗，自然晾干，每行選擇3個(gè)以上生長(zhǎng)良好的果穗，脫粒后混合取大小均一的50粒，于45℃烘60h以保證所有材料含水量基本一致。該群體每個(gè)環(huán)境只測(cè)定了1個(gè)重復(fù)的表型，一共測(cè)定了10個(gè)脂肪酸組分性狀，所有脂肪酸含量之和作為玉米籽粒含油量（li等，naturegenetics,2013）。脂肪酸的提取參照sukhija等（1988）的方法。

（5）油份關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析

具體按照上述建模步驟進(jìn)行建模；

以x=26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因，y=26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因，z=全基因組基因進(jìn)行l(wèi)a分析，發(fā)現(xiàn)grmzm2g319022基因表達(dá)量較低時(shí)，grmzm2g176542表達(dá)量與grmzm2g410515的表達(dá)量顯著正相關(guān)，而grmzm2g319022基因表達(dá)量較高時(shí)，grmzm2g176542表達(dá)量與grmzm2g410515表達(dá)量負(fù)相關(guān)（圖5）。

結(jié)合z基因的功能注釋和區(qū)段關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)grmzm2g319022編碼鋅脂蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)保守（圖6），區(qū)段關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該基因也是和油份性狀顯著關(guān)聯(lián)的。（圖7）

結(jié)合z基因的功能注釋、共定位分析、區(qū)段關(guān)聯(lián)分析（以基因grmzm2g451672為例，結(jié)果見圖8和圖9），共驗(yàn)證2個(gè)與含油量顯著關(guān)聯(lián)的候選基因（表2），這兩個(gè)候選基因均參與油脂代謝途徑。

表2兩個(gè)調(diào)控含油量關(guān)聯(lián)基因共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)變化的z候選基因

^a該基因區(qū)段關(guān)聯(lián)分析最顯著的snp位點(diǎn)，位置信息參照的是5b.60版本的b73基因組序列；^b候選基因至少落在其中一個(gè)先前報(bào)道的qtl區(qū)間內(nèi)。

該實(shí)施例發(fā)現(xiàn)第三個(gè)基因表達(dá)量的高低影響基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式，比如grmzm2g319022基因表達(dá)量較低時(shí)，grmzm2g176542表達(dá)量與grmzm2g410515的表達(dá)量顯著正相關(guān)，而grmzm2g319022基因表達(dá)量較高時(shí)，grmzm2g176542表達(dá)量與grmzm2g410515表達(dá)量負(fù)相關(guān)；又比如ac196475.3_fg005基因表達(dá)量較低時(shí)，grmzm2g079236表達(dá)量與grmzm2g176542的表達(dá)量顯著正相關(guān)，而ac196475.3_fg005基因表達(dá)量較高時(shí)，grmzm2g079236表達(dá)量與grmzm2g176542表達(dá)量負(fù)相關(guān)；因此基因grmzm2g319022和ac196475.3_fg005調(diào)控含油量關(guān)聯(lián)基因的共表達(dá)模式，推測(cè)這兩個(gè)基因參與調(diào)控油脂代謝途徑。

對(duì)la顯著的候選基因進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)，主要用到了兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)：歐洲生物信息研究所蛋白功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白結(jié)構(gòu)與功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)。此外，利用同源基因功能相似的原則，候選基因的蛋白序列還提交到了擬南芥基因數(shù)據(jù)庫(kù)tair中進(jìn)行比對(duì)，查看同源基因的功能注釋，并作為玉米候選基因功能預(yù)測(cè)的依據(jù)。

以上的這些結(jié)果證明了本發(fā)明的有效性，通過鑒定調(diào)控已知含油量關(guān)聯(lián)基因的共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)變化的調(diào)控基因，并結(jié)合功能注釋、共定位分析和區(qū)段關(guān)聯(lián)分析，從而解析玉米籽粒油脂代謝的調(diào)控機(jī)制，為高油玉米的遺傳改良提供了新的基因資源，為玉米其它數(shù)量性狀的調(diào)控機(jī)制研究提供了新的思路和方法。

實(shí)施例2

一種本發(fā)明所述基于動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)分析解析玉米籽粒油脂代謝的遺傳和分子機(jī)制的方法，主要包括六步，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集、26個(gè)油份關(guān)聯(lián)基因的收集、玉米籽粒含油量qtl定位結(jié)果的收集、關(guān)聯(lián)群體籽粒含油量數(shù)據(jù)的收集、油份關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析，具體流程見圖2。

（1）基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集：

368份自交系（同實(shí)施例1）于2010年在湖北荊州種植，根據(jù)系譜信息分成了2組（熱帶和亞熱帶、溫帶），小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。所有材料均進(jìn)行自交，收獲未成熟的授粉后15天（15dap）的籽粒，每個(gè)自交系的兩個(gè)重復(fù)各取3-4穗，每穗取1-2粒籽粒，混合提取籽?？俽na，隨機(jī)選擇368個(gè)樣品用于rna-seq；樣品的rna-seq工作是由深圳華大基因研究院（beijinggenomicsinstitute，bgi）完成，測(cè)序方法簡(jiǎn)要描述如下：首先，用ploy（t）寡聚核苷酸從總rna中抽取全部帶ploy（a）尾的rna，主要為mrna，然后將截獲的mrna隨機(jī)打斷成片段，用六堿基隨機(jī)引物（randomhexamers）合成cdna第一鏈，并加入逆轉(zhuǎn)錄酶等合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并對(duì)cdna片段進(jìn)行末端修飾，連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用illuminagaⅱ基因分析系統(tǒng)進(jìn)行序列測(cè)定及分析。轉(zhuǎn)錄本測(cè)序獲得的368個(gè)玉米自交系中28769個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，對(duì)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)集進(jìn)行的缺失值預(yù)處理如下：基因表達(dá)數(shù)據(jù)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中的噪聲、檢測(cè)技術(shù)等原因而存在缺失。對(duì)于數(shù)據(jù)集中的每個(gè)基因，如果其表達(dá)值在高于30%的樣本中缺失，則在后續(xù)的分析中舍棄該基因。

（2）26個(gè)油份關(guān)聯(lián)基因的收集：

在前期的一項(xiàng)研究中，我們結(jié)合覆蓋全基因組的最小等位基因頻率≥0.05的55萬個(gè)snp標(biāo)記和368份玉米自交系籽粒含油量性狀的表型值，利用mlm模型挖掘與籽粒含油量顯著關(guān)聯(lián)的snp位點(diǎn)。在全基因組顯著水平下（p<1.89×10^-6），共檢測(cè)到26個(gè)遺傳位點(diǎn)與含油量顯著關(guān)聯(lián)（圖3），對(duì)遺傳位點(diǎn)的候選基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)8個(gè)候選基因?yàn)閿M南芥中參與油脂代謝的同源基因，該結(jié)果為含油量關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析提供了目標(biāo)基因。

（3）玉米籽粒含油量qtl定位結(jié)果的收集：

收集玉米籽粒油份性狀qtl定位（表3），如果la分析檢測(cè)到的顯著基因落于控制玉米籽粒含油量的qtl之內(nèi)，則表明該基因有qtl的支持和驗(yàn)證。

表3玉米籽粒含油量和組分性狀qtl定位結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

（4）關(guān)聯(lián)群體籽粒含油量數(shù)據(jù)的收集

關(guān)聯(lián)群體分別于2009年春在四川雅安、2009年冬在云南西雙版納和海南三亞、2010年春在廣西南寧種植。508份材料根據(jù)系譜信息分成了2組（熱帶和亞熱帶、溫帶），小組內(nèi)采用完全隨機(jī)區(qū)組法，設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)自交系每個(gè)重復(fù)播種1行。每個(gè)材料自交5-7穗，成熟后收獲授粉的果穗，自然晾干，每行選擇3個(gè)以上生長(zhǎng)良好的果穗，脫粒后混合取大小均一的50粒，于45℃烘60h以保證所有材料含水量基本一致。該群體每個(gè)環(huán)境只測(cè)定了1個(gè)重復(fù)的表型，一共測(cè)定了10個(gè)脂肪酸組分性狀，所有脂肪酸含量之和作為玉米籽粒含油量352（368份材料中部分材料的表型無效）份總油份含量的標(biāo)準(zhǔn)化處理的表型數(shù)據(jù)見（表4）。脂肪酸的提取參照sukhija等（1988）的方法。

表4，368份玉米自交系總含油量列表

（5）油份關(guān)聯(lián)基因的全基因組la分析

具體按照上述建模步驟進(jìn)行建模；

以x=26個(gè)含油量關(guān)聯(lián)基因，y=全基因組基因，z=全基因組基因進(jìn)行l(wèi)a分析，重點(diǎn)關(guān)注la絕對(duì)值最大的前100個(gè)lap列表。結(jié)合y基因的功能注釋、共定位分析、區(qū)段關(guān)聯(lián)分析和基因組選擇分析（以基因grmzm2g451672為例，結(jié)果見圖7和圖8），共驗(yàn)證2個(gè)與含油量顯著關(guān)聯(lián)的候選基因（表5），這兩個(gè)候選基因均參與油脂代謝途徑。

（6）所述關(guān)聯(lián)分析采用混合線性模型

模型統(tǒng)計(jì)模型如下：

y=xβ+sα+zμ+qυ+e

所述y為表型觀察值；β為除標(biāo)記和群體結(jié)構(gòu)以外的未知固定效應(yīng)值；α為標(biāo)記的效應(yīng)值；υ為群體結(jié)構(gòu)的效應(yīng)值；μ為多基因遺傳背景的效應(yīng)值；e為殘差；q為群體結(jié)構(gòu)的矩陣；x、s、z分別為y與β、α、μ相關(guān)的矩陣，關(guān)聯(lián)分析采用tassel3.0軟件進(jìn)行計(jì)算。所述區(qū)段關(guān)聯(lián)分析的具體方法如下：提取候選基因5'utr上游50kb和3'utr下游50kb共100kb范圍內(nèi)的所有snp標(biāo)記，結(jié)合關(guān)聯(lián)群體的含油量表型數(shù)據(jù)，采用混合線性模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表5grmzm2g426556和grmzm2g451672兩個(gè)基因被qtl驗(yàn)證

^a該基因區(qū)段關(guān)聯(lián)分析最顯著的snp位點(diǎn)，位置信息參照的是5b.60版本的b73基因組序列；^b候選基因至少落在其中一個(gè)先前報(bào)道的qtl區(qū)間內(nèi)。

本實(shí)施例發(fā)現(xiàn)基因?qū)Φ墓脖磉_(dá)模式受到第三個(gè)基因表達(dá)量的影響，比如grmzm5g818791基因表達(dá)量較低時(shí)，grmzm2g410515表達(dá)量與grmzm2g426556的表達(dá)量顯著正相關(guān)，而grmzm5g818791基因表達(dá)量較高時(shí)，grmzm2g410515表達(dá)量與grmzm2g426556表達(dá)量負(fù)相關(guān)；再比如grmzm2g375904基因表達(dá)量較低時(shí)，grmzm2g410515表達(dá)量與grmzm2g451672的表達(dá)量顯著正相關(guān)，而grmzm2g375904基因表達(dá)量較高時(shí)，grmzm2g410515表達(dá)量與grmzm2g451672表達(dá)量負(fù)相關(guān)；推測(cè)與基因grmzm2g410515共表達(dá)模式動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)的基因grmzm2g426556和grmzm2g451672可能與控制籽粒含油量有關(guān)。

以上的這些結(jié)果證明了本發(fā)明的有效性，通過鑒定與已知含油量關(guān)聯(lián)基因的共表達(dá)模式的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)，并結(jié)合功能注釋、共定位分析、區(qū)段關(guān)聯(lián)分析和基因組選擇分析，從而解析玉米籽粒油脂代謝的遺傳和分子機(jī)制，為高油玉米的遺傳改良提供了新的基因資源，為玉米其它數(shù)量性狀的遺傳機(jī)理研究提供了新的思路和方法。