本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因安全生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa引物、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，目前，在我國(guó)已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因作物品系進(jìn)入安全評(píng)價(jià)階段，申請(qǐng)商業(yè)化種植。與此同時(shí)，因轉(zhuǎn)基因作物擴(kuò)散引起的安全性問(wèn)題受到了公眾的廣泛關(guān)注。為保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，落實(shí)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度、防止轉(zhuǎn)基因作物未經(jīng)安全批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)，迫切需要建立快速簡(jiǎn)便的核酸檢測(cè)方法，用于市場(chǎng)監(jiān)管和例行監(jiān)測(cè)。而在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，目前，常規(guī)pcr檢測(cè)方法存在操作繁瑣、成本高、單一性等問(wèn)題，不能適應(yīng)現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和頻繁的貿(mào)易往來(lái)。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)，與普通pcr不同，其模仿體內(nèi)復(fù)制機(jī)理，反應(yīng)不需要退火過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。利用該方法建立的檢測(cè)技術(shù)體系，適合于大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)，可以極大的提高現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)效率，并為我國(guó)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)方面躋身世界前列奠定良好的基礎(chǔ)。rpa方法的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。pcr引物多半是不適用的，這是因?yàn)?，rpa引物比一般pcr引物長(zhǎng)，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基，引物過(guò)短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度。因此，rpa的引物設(shè)計(jì)難度較大。探針?lè)ǖ娜秉c(diǎn)則是探針設(shè)計(jì)上有難度。另外，探針?lè)ㄔ跀U(kuò)增反應(yīng)完畢后需要用熒光讀取儀器才可以完成最后的結(jié)果顯示。并且，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)顯示結(jié)果采用電泳法時(shí)，需要用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠，不僅危害操作人的健康，而且無(wú)法排除假陽(yáng)性的問(wèn)題，也不能進(jìn)行田間的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)，這嚴(yán)重限制了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)效率，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全管理是最大的制約。目前，國(guó)際上已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中，如水稻、玉米、油菜、大豆等種子產(chǎn)品及以此為基礎(chǔ)的深加工食品、制品，很多品系均是采用camv35s啟動(dòng)子，即p-camv35s，常規(guī)的檢測(cè)手段需要將被檢樣品送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa引物、試劑盒及檢測(cè)方法，無(wú)需探針，利用生物素、地高辛和fitc分別標(biāo)記rpa正反向引物的5’端，能快速檢測(cè)被檢制品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，具有高度專一性，靈敏度高，檢測(cè)速度快，直觀性強(qiáng)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一組檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa引物，包括：rpa-35s-f：5'-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3'；rpa-35s-r：5'-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3'。檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa標(biāo)記引物組，其由正向引物rpa-35s-f-地和反向引物rpa-35s-r-fitc組成，或由正向引物rpa-35s-f-生和反向引物rpa-35s-r-fitc組成，或由正向引物rpa-35s-f-生和反向引物rpa-35s-r-地組成；其中，所述正向引物為經(jīng)生物素或地高辛對(duì)rpa引物rpa-35s-f的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：rpa-35s-f-地：5'-dig-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3'；rpa-35s-f-生：5'-biotin-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3'；所述反向引物為用fitc或地高辛對(duì)rpa引物rpa-35s-r的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：rpa-35s-r-fitc：5'-6-fam-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3'；rpa-35s-r-地：5'-dig-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3'。一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa檢測(cè)試劑盒，其含有所述的rpa引物或所述的rpa標(biāo)記引物組。一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)提取待測(cè)樣品的dna；2)rpa擴(kuò)增以待測(cè)樣品的dna作為模板，將所述的rpa標(biāo)記引物組加入到rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到雙標(biāo)記的核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)將吸附著生物素抗體及異硫氰酸熒光素(fitc)抗體的核酸檢測(cè)試紙條插入步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物中，側(cè)向?qū)游?～10分鐘，根據(jù)顯色條帶進(jìn)行判定：試紙條在檢測(cè)線和對(duì)照線處都有紫色條帶，則表示待測(cè)樣品中含有camv35s啟動(dòng)子；若僅在對(duì)照線處有紫色條帶，則表示待測(cè)樣品中不含有camv35s啟動(dòng)子，若對(duì)照線處均無(wú)紫色條帶，則表示無(wú)擴(kuò)增或試紙條無(wú)效。進(jìn)一步，所述的rpa反應(yīng)體系中，dna模板的終濃度為0.5～2ng/μl，正、反向標(biāo)記引物的終濃度各為0.3～0.6μmol/l。優(yōu)選地，所述rpa反應(yīng)體系總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/l的正、反向標(biāo)記引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2μl，rpa反應(yīng)緩沖液29.5μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl。進(jìn)一步，步驟2)中，所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣?7-39℃，14～20分鐘。優(yōu)選地，所述步驟2)中，rpa擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣胤磻?yīng)37℃4分鐘，取出，混合均勻，再擴(kuò)增15分鐘。本發(fā)明利用重組酶聚合酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinasepolymeraseamplification，rpa)快速檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子，根據(jù)外源基因插入調(diào)控元件的dna序列，設(shè)計(jì)了大量的rpa特異性引物，從中篩選出一組rpa引物，再利用生物素、地高辛和異硫氰酸熒光素fitc分別標(biāo)記正、反向引物的5’端后進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)中，異硫氰酸熒光素(fitc)標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物結(jié)合在橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)具有生物素抗體的檢測(cè)線上；未雜交的異硫氰酸熒光素標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物；通過(guò)檢測(cè)線，結(jié)合在控制線上，可以快速有效檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及制品中是否含有camv35s啟動(dòng)子。本發(fā)明僅需將試紙條插入擴(kuò)增后的反應(yīng)液中，即可肉眼判讀結(jié)果，簡(jiǎn)潔明了，所用的側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測(cè)技術(shù)，是將正向和反向引物的5’端分別標(biāo)記上異硫氰酸熒光素(fitc)引物、生物素或地高辛，經(jīng)過(guò)rpa反應(yīng)得到雙標(biāo)記的核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，將吸附著生物素抗體及異硫氰酸熒光素抗體的核酸檢測(cè)試紙條插入到該擴(kuò)增產(chǎn)物中，其會(huì)與膠體金標(biāo)記的其特異性抗體相結(jié)合，在檢測(cè)線處顯示，反之，未雜交的引物會(huì)與其膠體金標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，并在對(duì)照線處顯示，肉眼可以觀察到顯示結(jié)果，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，在準(zhǔn)確性及快速檢測(cè)方面得到了顯著的提高，此檢測(cè)方法可以省去電泳的步驟，無(wú)需引入探針，也無(wú)需用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠。與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的rpa引物，具有高度專一性，用生物素、地高辛和fitc分別進(jìn)行標(biāo)記后，在rpa擴(kuò)增反應(yīng)中，無(wú)需引入探針，就能快速檢測(cè)被檢制品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，靈敏度高，檢測(cè)速度快，直觀性強(qiáng)。利用本發(fā)明的檢測(cè)方法，無(wú)需引入探針，利用雙標(biāo)記核酸產(chǎn)物檢測(cè)試紙條，僅需5～10分鐘，就可以觀察檢測(cè)結(jié)果，省去了電泳的步驟，也無(wú)需用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，在準(zhǔn)確性及快速檢測(cè)方面得到了顯著的提高，可以對(duì)含有camv35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行田間篩查，快速檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的有無(wú)，大大節(jié)約了檢測(cè)成本。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中rpa標(biāo)記引物為rpa-35s-f-地和rpa-35s-r-fitc的擴(kuò)增電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；1：rrs：轉(zhuǎn)基因大豆；2：bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；3：bt176：轉(zhuǎn)基因玉米；4：kf：轉(zhuǎn)基因水稻；5：kmd：轉(zhuǎn)基因水稻；6：mon531：轉(zhuǎn)基因棉花；7：mon863：轉(zhuǎn)基因玉米；8：ntc：空白對(duì)照。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中rpa標(biāo)記引物為rpa-35s-f-生和rpa-35s-r-地的擴(kuò)增電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；1：ntc：空白對(duì)照；2：rrs：轉(zhuǎn)基因大豆；3：bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；4：bt176：轉(zhuǎn)基因玉米；5：kf：轉(zhuǎn)基因水稻；6：kmd：轉(zhuǎn)基因水稻；7：mon531：轉(zhuǎn)基因棉花；8：mon863：轉(zhuǎn)基因玉米。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中rpa標(biāo)記引物為rpa-35s-f-生和rpa-35s-r-地的靈敏度擴(kuò)增電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；dna采用rrs(轉(zhuǎn)基因大豆)不同梯度稀釋為：1：0copies；2：20copies；3：50copies；4：100copies；5：200copies；6：500copies；7：1000copies；8：2000copies。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)結(jié)果；其中，rpa-35s-f：正向引物；camv35s：p-camv35s全序列；35s-kf：轉(zhuǎn)基因水稻；35s-kmd：轉(zhuǎn)基因水稻；35s-m531：轉(zhuǎn)基因棉花；35s-mon863：轉(zhuǎn)基因玉米；35s-rrs：轉(zhuǎn)基因大豆；35s-bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；35s-bt176：轉(zhuǎn)基因玉米；35s-rpa-35s-123-f：反向引物。圖5-6為本發(fā)明實(shí)施例中試紙條插入后結(jié)果顯示結(jié)果；其中，1：ntc：空白對(duì)照；2：rrs：轉(zhuǎn)基因大豆；3：bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；4：bt176：轉(zhuǎn)基因玉米；5：kf：轉(zhuǎn)基因水稻；6：kmd：轉(zhuǎn)基因水稻；7：mon531：轉(zhuǎn)基因棉花；8：mon863：轉(zhuǎn)基因玉米。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa引物的獲得通過(guò)查閱文獻(xiàn)和用blast軟件分析，以10ng/μl的轉(zhuǎn)基因大豆gts40-3-2品系作為模板進(jìn)行優(yōu)化篩選，篩選出camv35s啟動(dòng)子的基因核酸序列，并進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選。在rpa引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮到以下幾個(gè)要點(diǎn)：(1)引物長(zhǎng)度的選擇rpa引物的長(zhǎng)度一般為30至35個(gè)核苷酸；(2)引物gc含量在40％～60％之間，堿基隨機(jī)分布，5'端的3-5個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥(niǎo)嘌呤；(3)引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物-引物互作、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，減少引物二聚體的形成；(4)設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量選擇在camv35s啟動(dòng)子的構(gòu)建特異性內(nèi)部，以增加篩選元件的通用性。篩選后得到一對(duì)rpa引物，具體序列如下：rpa-35s-f：5'-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3'；rpa-35s-r：5'-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3'。實(shí)施例2一種檢測(cè)camv35s啟動(dòng)子的rpa檢測(cè)方法驗(yàn)證以常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大豆、玉米、棉花、水稻、油菜等作為對(duì)象，進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)，并利用試紙條進(jìn)行了檢測(cè)，以電泳法為對(duì)比進(jìn)行驗(yàn)證。1)分別提取待測(cè)樣品dna(rrs：轉(zhuǎn)基因大豆；bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；bt176：轉(zhuǎn)基因玉米kf：轉(zhuǎn)基因水稻；kmd：轉(zhuǎn)基因水稻；mon531：轉(zhuǎn)基因棉花；mon863：轉(zhuǎn)基因玉米)；2)標(biāo)記rpa引物對(duì)實(shí)施例1中獲得的rpa引物，分別在5’端進(jìn)行生物素、地高辛和fitc標(biāo)記，具體如表1。表1引物名稱引物序列rpa-35s-f-地5’-dig-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3’rpa-35s-r-fitc5’-6-fam-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3’rpa-35s-f-生5’—biotin-cctctgccgacagtggtcccaaagatggacc-3’rpa-35s-r-地5’-dig-cccttacgtcagtggagatatcacatcaatcc-3’3)恒溫?cái)U(kuò)增將表1中引物利用twistdx公司開(kāi)發(fā)的rpa試劑盒進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μl，濃度為10μmol/l的正向引物rpa-35s-f-地和反向引物rpa-35s-r-fitc(或正向引物rpa-35s-f-生和反向引物rpa-35s-r-fitc、或正向引物rpa-35s-f-生和反向引物rpa-35s-r-地)各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2μl，rpa反應(yīng)緩沖液29.5μl，ddh2o加入11.2μl補(bǔ)足至總體積50μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間分兩部分：放入pcr儀器或恒溫?cái)U(kuò)增儀中反應(yīng)4分鐘，拿出上下顛倒10次，再擴(kuò)增15分鐘。4)產(chǎn)物檢測(cè)產(chǎn)物檢測(cè)通過(guò)兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證：(1)電泳法：將步驟3)的等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物按照twistdx公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行酚氯仿純化后電泳分析，電泳圖譜如圖1-2所示，圖1-2中，有擴(kuò)增條帶則為含有camv35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，反之，無(wú)條帶則表示該產(chǎn)品為不含有camv35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。對(duì)引物進(jìn)行靈敏度擴(kuò)增驗(yàn)證，將含有目的條帶的片段克隆至質(zhì)粒上，以質(zhì)粒為模板，在2×103拷貝—20拷貝之間設(shè)7個(gè)梯度進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，結(jié)果參見(jiàn)圖3，由圖3可知，100拷貝以上可以擴(kuò)增出條帶，50、20拷貝則無(wú)擴(kuò)增。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序后，比對(duì)結(jié)果如圖4所示，由圖4可以表明，擴(kuò)增產(chǎn)物均為camv35s啟動(dòng)子。(2)試紙條法：將固定有生物素抗體和異硫氰酸熒光素抗體的雙標(biāo)記核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條插入到步驟3)的擴(kuò)增反應(yīng)體系中，5-10分鐘內(nèi)，顯示結(jié)果。檢測(cè)試紙條在檢測(cè)線和對(duì)照線處都有條帶，則表示該產(chǎn)品為含有camv35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，反之，僅在對(duì)照線處有條帶，則表示該產(chǎn)品為不含有camv35s啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，若檢測(cè)線和對(duì)照線處均無(wú)條帶，則表示無(wú)擴(kuò)增或試紙條無(wú)效，具體如圖5-6。由圖5-6可以看出，利用本發(fā)明的rpa方法，準(zhǔn)確度高，與電泳法結(jié)果相吻合，彌補(bǔ)了電泳法的不足，應(yīng)用性更加廣泛。當(dāng)前第1頁(yè)12