一種微小rna啟動子活性檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微小RNA啟動子活性檢測的方法，該微小RNA啟動子活性檢測的方法包括以下步驟：利用分子生物學技術，在無啟動子、增強子的真核載體基礎上，構建含miRNAs啟動子、miRNA和3’段側翼序列在內的重組真核載體；將重組真核載體體外轉染真核細胞，利用熒光定量PCR儀檢測miRNAs成熟體的表達；通過體外實驗觀察啟動子表達miRNAs后的生物學效應。本發(fā)明提供的微小RNA啟動子活性檢測的方法可以在不依賴昂貴儀器的條件下，廣泛用于分子生物學和細胞生物學實驗中檢測miRNAs啟動子活性，方便地觀察miRNAs表達后的生物學效應，檢測方便并準確反映啟動子活性。
【專利說明】—種微小RNA啟動子活性檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因啟動子活性檢測領域，尤其涉及一種微小RNA啟動子活性檢測的方法。
【背景技術】
[0002]目前，公知的微小RNA啟動子活性檢測方法是利用分子生物學手段，將微小RNA啟動子構建到pGL3-Basic載體上,重組載體轉染真核細胞后，利用Luminometer突光素酶檢測儀檢測熒光素酶活性來判斷miRNA啟動子活性。
[0003]但是，該方法不僅需要依賴昂貴的專業(yè)檢測儀器Luminometer熒光素酶檢測儀，且無法直接觀察該啟動子是否可以啟動miRNAs的表達及其后續(xù)的生物學效應，給廣大科研工作者帶來了極大的不便。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種微小RNA啟動子活性檢測的方法，旨在解決目前微小RNA啟動子活性檢測方法需要依賴昂貴的專業(yè)檢測儀器Luminometer熒光素酶檢測儀，且無法直接觀察該啟動子是否可以啟動miRNAs的表達及其后續(xù)的生物學效應的問題。
[0005]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種微小RNA啟動子活性檢測的方法，該微小RNA啟動子活性檢測的方法包括以下步驟:
[0006]步驟一、首先通過GeneBank獲得miRNA前段5’端-1064位點到其3’端側翼+124位點的序列，通過Primer5設計對應引物；根據(jù)無啟動子、增強子的真核載體pGL3.0-Basic的MCS區(qū)的酶切位點，篩選并在引物上游和下游分別引入酶切位點XhoI和BgIII ;接下來抽取人肺癌％D細胞的DNA，利用PCR實驗，通過引物擴增目的片度，常規(guī)純化目的片度后，經XhoI和BgIII雙酶切、純化，與同樣經XhoI和BgIII雙酶切、純化的真核載體進行連接；30分鐘后，將連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，常規(guī)涂板后，放置37°培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時；挑選單個陽性克隆，在Amp+LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，進行菌液PCR、酶切和測序鑒定；
[0007]步驟二、將構建成功的重組真核載體抽提，鑒定純度和濃度后，-80C保存；常規(guī)培養(yǎng)人肺癌％D細胞，按5X IO4個細胞鋪于24孔板中，將IOug重組載體和對照載體體外分別利用Lipofectamine2000瞬時轉染細胞后，繼續(xù)在5% C02，37°C條件下培養(yǎng)，48小時后，抽取各組細胞總RNA，利用Realtime PCR探針法檢測miRNA表達水平；
[0008]步驟三、通過體外實驗觀察啟動子表達miRNAs后的生物學效應；利用MTT實驗檢測各轉染組中％D細胞生長的變化。
[0009]進一步,步驟一中真核載體是pGL3.0-Basic。
[0010]進一步，步驟二中miRNA 是 miR_7。
[0011]進一步,步驟二中重組真核載體是pGL3.0-Basic-miR-7-promoter。
[0012]本發(fā)明提供的的微小RNA啟動子活性檢測的方法可以在不依賴昂貴儀器的條件下，廣泛用于分子生物學和細胞生物學實驗中檢測miRNAs啟動子活性，方便地觀察miRNAs表達后的生物學效應，檢測方便并準確反映啟動子活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明實施例提供的微小RNA啟動子活性檢測的方法流程圖；
[0014]圖2是本發(fā)明實施例提供的表達載體構建的設計原理圖；
[0015]圖中:MCS、多克隆位點(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信號(Polyadenylation signal) ;0r1、復制起始位點(origin ofreplication) ;Ampr、氨節(jié)西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、啟動子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌體復制起始位點(Flphageorigin ofreplication)；
[0016]圖3是本發(fā)明實施例提供的以miRNA家族成員miR_7和載體pGL3.0-Basic為例的表達載體構建示意圖；
[0017]圖中:MCS、多克隆位點(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信號(Polyadenylation signal) ;0r1、復制起始位點(origin ofreplication) ;Ampr、氨節(jié)西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、啟動子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌體復制起始位點(Flphageorigin of replication)；
[0018]圖4是本發(fā)明實施例提供的表達載體構建過程中的PCR、酶切和測序結果；
[0019]圖中:A、啟動子PCR擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳；B、克隆菌液PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳；C、重組質粒雙酶切；D、重組質粒測序；
[0020]圖5是本發(fā)明實施例提供的表達載體轉染細胞后miR-7表達水平檢測示意圖；
[0021]圖6是本發(fā)明實施例提供的重組載體轉染細胞后miR-7生物學效應檢測示意圖；
[0022]圖中:A、光鏡；B、MTT實驗。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0024]圖1示出了本發(fā)明提供的微小RNA啟動子活性檢測的方法的流程，為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關的部分。下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述。
[0025]本發(fā)明提供的【具體實施方式】如下:
[0026]1.以miRNAs家族成員miR_7和載體pGL3.0-Basic為例，首先通過GeneBank獲得miR-7前段5’端-1064位點到其3’端側翼+124位點的序列，通過Primer5設計對應引物；根據(jù)pGL3.0-Basic的MCS區(qū)的酶切位點，篩選并在引物(上游和下游)分別引入酶切位點(XhoI 和 BgIII);引物序列:h游，5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’:下游引物(引A BgIII 位點):5’ GAAGATCTTCGA—GTCTGCCGATGGGTGT-3?。預期產物大小，1302bp。
[0027]2.抽取人肺癌％D細胞的DNA，利用PCR實驗，通過引物成功擴增目的片度(圖4A)；
[0028]3.常規(guī)純化目的片度后，經XhoI和BgIII雙酶切、純化，與同樣經XhoI和BgIII雙酶切、純化的PGL3.0-Basic進行連接；
[0029]4.30分鐘后，將連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，常規(guī)涂板后，放置37°培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時；
[0030]5.挑選單個陽性克隆，共6個，在Amp+LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，進行菌液PCR鑒定，結果顯示，所挑取的6個克隆均為陽性(圖4B);
[0031]6.常規(guī)抽取質粒后，經酶切鑒定后，送測序。如圖4C和4D顯示，成功構建pGL3.0-Basic-miR-7-promoter 表達載體，命名為 p-miR-7-pro (對應的 pGL3.0-Basic 命名為 p-Cont)。
[0032]7.將質粒p-miR-7-pro大量抽提后，鑒定純度和濃度。結果顯示，0D260/280 =
1.86，濃度為 148mg/L, _80°C保存；
[0033]常規(guī)培養(yǎng)人肺癌9?細胞，按5X104個細胞鋪于24孔板中，將IOug質粒p-miR-7-pro 和對照質粒 p-Cont (pGL3.0-Basic)體外分別利用 Lipofectamine2000 瞬時轉染細胞后，繼續(xù)在5% CO2, 37°C條件下培養(yǎng)。48小時后，抽取各組細胞總RNA，利用RealtimePCR探針法檢測miR-7表達水平。
[0034]結果顯示，p-miR-7-pro轉染組中，miR-7表達水平明顯增加(圖5),提示該啟動子可以啟動miR-7的表達。
[0035]進一步檢測了各轉染組中％D細胞生長的變化。如圖6顯示，與p-Cont轉染組相t匕，培養(yǎng)72小時后，p-miR-7-pro載體轉染組中％D細胞的生長明顯減弱(p < 0.05)，提示miR-7表達水平增加，可顯著削弱腫瘤細胞體外生長，這與以往的研究報道一致。
`[0036]總之，結果表明，該啟動子可以啟動miR-7在真核細胞中的表達，同時，也觀察到了 miR-7表達后的生物學效應。
[0037]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，該微小RNA啟動子活性檢測的方法包括以下步驟: 步驟一、首先通過GeneBank獲得miRNA前段5’端-1064位點到其3’端側翼+124位點的序列，通過Primer5設計對應引物；根據(jù)無啟動子、增強子的真核載體pGL3.0-Basic的MCS區(qū)的酶切位點，篩選并在引物上游和下游分別引入酶切位點XhoI和BgIII ;接下來抽取人肺癌％D細胞的DNA，利用PCR實驗，通過引物擴增目的片度，常規(guī)純化目的片度后，經XhoI和BgIII雙酶切、純化，與同樣經XhoI和BgIII雙酶切、純化的真核載體進行連接；30分鐘后，將連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，常規(guī)涂板后，放置37°培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時；挑選單個陽性克隆，在Amp+LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，進行菌液PCR、酶切和測序鑒定； 步驟二、將構建成功的重組真核載體抽提，鑒定純度和濃度后，-80°C保存；常規(guī)培養(yǎng)人肺癌％D細胞，按5X IO4個細胞鋪于24孔板中，將IOug重組載體和對照載體體外分別利用Lipofectamine2000瞬時轉染細胞后，繼續(xù)在5% C02，37°C條件下培養(yǎng)，48小時后，抽取各組細胞總RNA，利用Realtime PCR探針法檢測miRNA表達水平； 步驟三、通過體外實驗觀察啟動子表達miRNAs后的生物學效應；利用MTT實驗檢測各轉染組中％D細胞生長的變化。
2.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟一中真核載體是 pGL3.0-Basic。
3.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟二中miRNA是 miR—7。
4.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟二中重組真核載體是 pGL3.0-Basic-miR-7-promotero
【文檔編號】C12Q1/02GK103484544SQ201310421926
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權日:2013年9月17日
【發(fā)明者】徐林, 周涯, 廖珍媛, 李永菊, 羅軍敏 申請人:遵義醫(yī)學院