優(yōu)化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了優(yōu)化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用。本發(fā)明綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA二級結構及密碼子分布不同而引起的蛋白翻譯速率之間的差異等影響因素，按照畢赤酵母的偏愛密碼子對牛凝乳酶原基因進行改造分別獲得SEQ?ID?NO.1、2、3所示的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因。本發(fā)明還提供了一種重組牛凝乳酶原的生產(chǎn)方法，包括：將含有優(yōu)化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組牛凝乳酶原的表達，回收并純化所表達的產(chǎn)物。相比原始牛凝乳酶原基因，優(yōu)化后的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中的分泌表達量以及酶活均有顯著提升。
【專利說明】優(yōu)化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及優(yōu)化的凝乳酶原基因，尤其涉及將來源于牛凝乳酶原基因進行密碼子優(yōu)化后所得到的凝乳酶原基因，本發(fā)明還涉及優(yōu)化的凝乳酶原基因在生產(chǎn)凝乳酶中的應用，屬于重組凝乳酶的制備領域。
【背景技術】
[0002]干酪營養(yǎng)豐富，味道鮮美，貯存期長且種類繁多，是世界食品中的重要組成部分，素有“乳制品之王”之稱。在干酪的生產(chǎn)工藝過程中，凝乳是影響干酪產(chǎn)率和品質(zhì)的關鍵性工藝。凝乳酶(chymoSin，EC3.4.23.4)是制造干酪的凝乳過程中起凝乳作用的關鍵性酶，它是天冬氨酸蛋白酶中的一種，能夠?qū)Ｒ恍粤呀鈑-酪蛋白中的Pheici5Jfetltl6肽鍵，弓丨起乳蛋白凝聚，在乳制品特別是干酪加工中具有重要作用，同時凝乳酶對干酪的質(zhì)構和特有風味的形成起著非常重要的作用。
[0003]傳統(tǒng)的凝乳酶主要是通過宰殺未斷奶小牛從其皺胃中提取，凝乳酶在小牛皺胃中以含381個氨基酸的前體聚肽一凝乳酶原前體的形式合成，在分泌過程中，會去掉16個信號肽形成含有365個氨基酸的凝乳酶原，大小為40.SkDa0凝乳酶原無活性，在酸性條件下會自動催化，去掉N端42個氨基酸形成有活性的凝乳酶，該酶含有323個氨基酸，大小為35.6kDa。隨著干酪產(chǎn)業(yè)的劇增，小牛皺胃提取的凝乳酶無法滿足需求。目前使用較多的代替品主要是羊、豬和雞的胃蛋白酶，但是這些酶都具有較強的蛋白分解能力，單獨制作的干酪都會存在出現(xiàn)苦味、凝乳時間長、質(zhì)地較軟，出品率低等問題。近年來，一些研究者也從水生動物中提取到了凝乳酶，如鱉魚胃粘液中發(fā)現(xiàn)具有凝乳活性的酸性蛋白酶，Kristinsson等人從海豹的胃和胃粘液中提取出一種在PH值為6.0-6.8范圍內(nèi)有很好凝乳活性的蛋白酶，用該蛋白酶制造出的干酪風味正常，適合商業(yè)化生產(chǎn)，是牛皺胃酶的潛力替代品。
[0004]盡管研究人員發(fā)現(xiàn)了一些動物源的牛凝乳酶替代品，但動物資源仍不如植物和微生物豐富，因此，各國學者紛紛將研究目標轉(zhuǎn)向植物和微生物源凝乳酶。許多植物蛋白酶都具有凝乳的功能，主要分布在植物的果實、葉、莖和根等部位。世界凝乳酶中這類酶用量約占1%左右。目前已報道的植物來源凝乳酶主要為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、合歡樹蛋白酶等。由于動物和植物來源凝乳酶的局限性，微生物凝乳酶逐漸被人們所關注和研究。微生物源的凝乳酶具有來源廣泛、生長周期短，產(chǎn)量大、便于提取、利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢。迄今未止，已有40多種微生物可產(chǎn)生具有一定凝乳活力的蛋白酶，主要是細菌、放線菌和真菌。目前應用最多的微生物來源凝乳酶是由微小毛霉(Mucor pusillus)產(chǎn)生的，該酶的蛋白分解能力比牛凝乳酶強，但比其它來源的蛋白酶弱。其它常見的用于產(chǎn)凝乳酶的微生物有米根霉(Rhizopus oryzae)、寄生內(nèi)坐殼菌(Endothaparasitisa)、根毛霉屬(Rhizomucor)等。與植物來源凝乳酶相比,微生物來源的凝乳酶制作的干酪的質(zhì)量和品質(zhì)都有所提高，但在正常巴氏殺菌條件下，因其較高的耐熱性，會造成乳清中蛋白酶活性較高，影響后期工作。與牛凝乳酶比較后，其凝乳酶活性與蛋白酶活性比值(c/p)仍然偏低，干酪質(zhì)量較差，且成熟干酪風味也有所改變，還會伴隨苦味。[0005]隨著基因工程的飛速發(fā)展，利用DNA重組技術實現(xiàn)動物凝乳酶在微生物宿主中表達逐漸成為生產(chǎn)凝乳酶的一個新的有效途徑?；蚬こ棠槊钢饕菍游镄缘哪槊富?qū)胛⑸锼拗骷毎羞M行表達，從而緩解天然凝乳酶緊缺的狀況，滿足奶酪工業(yè)的生產(chǎn)。目前，已有多種動物來源凝乳酶在不同的微生物表達系統(tǒng)中進行了表達。1980年，Uchiyama等首次在體外成功翻譯出牛凝乳酶mRNA并嘗試在大腸桿菌中生產(chǎn)凝乳酶。之后Nishimori等構建了用于表達牛凝乳酶原cDNA的表達質(zhì)粒pCR301，并成功表達在宿主細胞的細胞漿中。Beppu等人利用凝乳酶原cDNA在大腸桿菌中表達，表達產(chǎn)物最終以包涵體的形式在細胞內(nèi)積累。雖然用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)凝乳酶已經(jīng)取得了許多進展，但是表達產(chǎn)物多以包涵體的形式存在，給后續(xù)工作帶來困難，同時還會引起細胞膜脆弱、細胞呼吸能力和繁殖能力喪失等問題。真核表達系統(tǒng)具有不產(chǎn)生內(nèi)毒素、能夠進行翻譯后修飾、下游提取方便和易被消費者接受等優(yōu)點，被越來越多的應用于外源蛋白的生產(chǎn)當中。常用的真核表達系統(tǒng)主要是酵母表達系統(tǒng)和絲狀真菌表達系統(tǒng)。Ward等利用泡盛曲霉作為表達宿主，構建了一個牛凝乳酶原基因與葡萄糖淀粉酶基因(glaA)融合的表達載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到曲霉中，得到大量凝乳酶并分泌到胞外。2004年，Vega-Hemandez MC等成功克隆了公山羊的凝乳酶原基因于酵母中并表達，經(jīng)過乳品凝集試驗證明獲得了有活性的凝乳酶。2008年，Vallejo等構建了牛凝乳酶前體、牛凝乳酶原和牛凝乳酶三種表達載體并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，通過誘導測定，只有凝乳酶原形式的表達載體能夠產(chǎn)生有活性的牛凝乳酶。馮鎮(zhèn)等成功的構建了凝乳酶原酵母分泌型表達載體，并在乳酸克魯維酵母GG799中得到了分泌表達。2009年，張莉等將牛凝乳酶原基因插入到酵母表達載體pPICZaA a，構建的表達質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，在甲醇誘導下進行凝乳酶的表達，培養(yǎng)基上清液中凝乳酶的活性為12.2SU/mL。該研究為國內(nèi)首次應用畢赤酵母表達牛凝乳酶。2010年，袁偉等人通過對牛凝乳酶原進行密碼子優(yōu)化改造后轉(zhuǎn)入乳酸克魯維酵母GG799菌株中，培養(yǎng)96h后，從上清檢測到凝乳活力最高可達到99.67SU/mL，為國內(nèi)外首次對經(jīng)密碼子優(yōu)化的牛凝乳酶原基因在乳酸克魯維酵母中獲得表達(袁偉等，牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克魯維酵母中的表達?生物工程學報，2010年9月25 ;26 (9): 1281-1286)。
[0006]綜上所述，牛凝乳酶原基因乃至文獻中公開的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中的表達均存在分泌表達量低`、所表達的重組牛凝乳酶酶酶活較低等缺陷，有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要目的是針對原始的牛凝乳酶原基因或文獻中公開的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因在酵母菌株中表達時所存在的分泌表達量較低、酶活不高的問題，提供一種新的密碼子經(jīng)過改造且mRNA 二級結構穩(wěn)定性好的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因，該牛凝乳酶原優(yōu)化基因在酵母菌株中分泌表達量高，所表達的重組牛凝乳酶酶活有顯著提升；
[0008]本發(fā)明目的之二是提供含有該優(yōu)化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；
[0009]本發(fā)明目的之三是利用所述的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因生產(chǎn)重組牛凝乳酶原；
[0010]本發(fā)明的目的之四是提供一種提高原始的牛凝乳酶原基因或優(yōu)化的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中分泌表達量的方法。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先將牛凝乳酶原原始基因進行密碼子優(yōu)化等修飾改造得到三條不同的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因，分別命名為pcm, pcm-1,和pcm-2,其中，pcm的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示、pcm-1的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示、pcm_2的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0012]本發(fā)明為克服由于牛凝乳酶原原始基因和畢赤酵母在密碼子使用頻率上的差異所帶來的低水平表達的問題，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性對牛凝乳酶原原始基因(PCW)(SEQ ID N0.4所示)在不改變其蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調(diào)整、不穩(wěn)定序列的刪除、mRNA 二級結構等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子首先對牛凝乳酶原原始基因(pew)進行修飾改造，進而考慮到在mRNA翻譯過程中，密碼子使用頻率越高，其翻譯速率越快，反之則越慢。但活性蛋白的表達量除了與密碼子整體使用頻率相關外，還與密碼子的分布情況相關。在密碼子優(yōu)化過程中，并不能將所有的區(qū)段都改造為較快翻譯速率的密碼子，而是需要進行合理搭配，這樣才能保證翻譯速率和蛋白質(zhì)折疊速率向匹配。因此，設計了三個密碼子使用頻率相同但分布情況不同(蛋白翻譯速率不同)的三條序列(pcm，pcm-1, pcm-2)，三條序列所示的優(yōu)化后的牛凝乳酶原基因分別為SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，這三條優(yōu)化的序列與原始基因相比，均改變218個堿基，占堿基總數(shù)的19.8% ;涉及187個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的51.2%。優(yōu)化后的基因的GC含量由57.4降為47.3% ;此外，相比原始基因，優(yōu)化后牛凝乳酶原基因的mRNA二級結構自由能也得到了較大幅度的提高，降低了轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高了轉(zhuǎn)錄效率，最終有效提高了在畢赤酵母中的分泌表達量和酶活。
[0013]本發(fā)明另一目的是提供含有所述優(yōu)化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；
[0014]優(yōu)選的，所述重組表達載體是重組真核表達載體，更優(yōu)選為重組酵母表達載體，最優(yōu)選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。
[0015]所述的重組宿主細胞優(yōu)選為重組酵母細胞，更優(yōu)選為重組畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞。
[0016]將優(yōu)化的牛凝乳酶原基因可操作的與酵母的表達調(diào)控序列相連就可得到在酵母細胞中分泌表達牛凝乳酶原的重組酵母表達載體；為了達到更好的分泌表達效果，本發(fā)明將優(yōu)化的牛凝乳酶原基因可操作的與畢赤酵母的表達調(diào)控序列相連得到在畢赤酵母細胞中分泌表達重組牛凝乳酶原的重組畢赤酵母表達載體。
[0017]本發(fā)明所述的酵母細胞包括能夠表達優(yōu)化的牛凝乳酶原基因的各種酵母中的任何一種酵母細胞。選擇用于表達重組牛凝乳酶原的合適酵母是在所屬領域的普通技術人員的能力范圍之內(nèi)。在選擇用于表達的酵母宿主中，合適的宿主可包括具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白產(chǎn)生和總體穩(wěn)固等特性的酵母。這些酵母包括但不限于產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales)、擔孢子酵母和屬于半知菌(芽孢綱(Blastomycetes))類的酵母。所述產(chǎn)子囊酵母分為兩科，即:蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四個亞科，Schizosaccharomycoideae (例如裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))> Nadsonioideae>Lipomycoideae和Saccharomycoideae (例如畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces)。擔抱子酵母包括 Leucosporidium 屬、紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、Filobasidium屬和線黑粉菌屬(Filobasidiella)0
[0018]優(yōu)選的,本發(fā)明所述的酵母為畢赤酵母(Pichia pastoris)。
[0019]用于酵母表達載體的表達調(diào)控序列對于所屬領域的普通技術人員是眾所周知的，包括但不限于來自諸如以下基因的啟動子區(qū)域:
[0020]醇脫氫酶(ADH)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶和丙酮酸激酶(PYK)。其它用于酵母宿主的合適啟動子序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.(1980)255:2073)及其它諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡糖異構酶的糖解酶的啟動子(Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900 ；Hess et al., J.Adv.ENZYMEREG.(1968)7:149)。酵母增強子也可與酵母啟動子一起使用。此外，合成啟動子也可起到酵母啟動子的作用。酵母啟動子可包括具有結合酵母RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄的能力的天然產(chǎn)生的非酵母來源的啟動子，可包含部分酵母表達載體的其它控制元件包括例如來自 GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(Holland et al.，J.Biol.Chem.(1981)256:1385)。用于酵母中的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒中的trpl基因，所述trpl基因提供用于缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株的選擇標記。
[0021]進一步的，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組牛凝乳酶的方法，包括^fSEQID N0.USEQID N0.2或SEQ ID N0.3所示的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組牛凝乳酶的表達，回收并純化所表達的重組牛凝乳酶，即得。
[0022]上述生產(chǎn)重組牛凝乳酶的方法中，所述的重組表達載體優(yōu)選為重組真核表達載體，進一步優(yōu)選為重組酵母表達載體，更優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞優(yōu)選為酵母細胞，更優(yōu)選為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
[0023]將優(yōu)化的牛凝乳酶原 基因轉(zhuǎn)化到酵母宿主中的方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的。舉例而言，酵母轉(zhuǎn)化可根據(jù)以下文獻中描述的方法進行:Hsial et al.，P.Natl.Acad.SC1.USA(1979) 76:3829 和 Van Solingen et al., J.Bact.(1977) 130:946 ;也可按照通常在 SAMBR00K et al., Molecular Cloning:A Lab Manual (2001)中所述的方法進行轉(zhuǎn)化，諸如通過核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合等方式，將牛凝乳酶原優(yōu)化基因引入到酵母細胞中；只要構建了重組宿主細胞菌株(即將重組酵母表達載體引入酵母細胞中并分離具有合適表達載體的重組酵母宿主細胞)，則在適于產(chǎn)生重組牛凝乳酶原的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞菌株，培養(yǎng)重組宿主細胞菌株的方法依賴于所用表達載體的性質(zhì)和宿主細胞的特性，這對所屬領域的普通技術人員來說屬于常規(guī)的技術手段，其包括但不限于發(fā)酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應器、空心纖維生物反應器、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌槽生物反應器系統(tǒng)等方法，這些方法的每一種都可以采用分批、補料或連續(xù)模式等方法進行，同時以分批或連續(xù)型式采集細胞或采集培養(yǎng)物上清液。在含有碳、氮和無機鹽的可吸收源和視情況含有維生素、氨基酸、生長因子及其它眾所周知的蛋白培養(yǎng)補充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細胞。用于培養(yǎng)宿主細胞的液體培養(yǎng)基可視情況含有抗生素或抗真菌劑以防止不希望的微生物生長和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以選擇含有表達載體的宿主細胞。
[0024]用于在酵母宿主細胞中表達異源蛋白的其它方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的。可在擴增階段使用所屬領域的普通技術人員眾所周知的標準補料發(fā)酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在發(fā)酵罐內(nèi)生長。所述發(fā)酵法可經(jīng)調(diào)適以解決特定酵母宿主的碳利用路徑或表達控制模式中的差異。舉例而言，酵母屬酵母宿主的發(fā)酵可能需要單個葡萄糖、復合氮源(例如酪蛋白水解產(chǎn)物)和多種維生素補充。通常為碳的生長限制營養(yǎng)素可在擴增階段加入發(fā)酵罐中以允許最大生長。另外，發(fā)酵法通常應用設計為含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷及其它次要營養(yǎng)素(例如維生素、微量礦物質(zhì)和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。[0025]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0026]術語“酵母宿主”或“酵母宿主細胞”包括可用作或者已經(jīng)用作重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的接受體的酵母。所述術語包括已經(jīng)接收重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細胞的后代。由于偶然或有意的突變，單個親本細胞的后代可不必在形態(tài)上或與原始親本互補的基因組或總DNA上完全一致。
[0027]術語“重組宿主細胞”或“宿主細胞”意指包括外源性多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導、f?配對或所屬領域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
[0028]術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ; Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Cassol et al., (1992);Rossolini et al., Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0029]術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP，針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。
[0030]術語“表達”指外源基因在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0031]術語“轉(zhuǎn)化”指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。
[0032]術語“外源基因”指對特定的宿主細胞而言，該基因序列是屬于外來的來源，或是來自相同的來源但其原始序列進行了修飾或改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1牛凝乳酶原原始基因(pew)的密碼子使用頻率。
[0034]圖2優(yōu)化的牛凝乳酶原基因(pcm、pcm_l、pcm_2)的密碼子使用頻率。[0035]圖3牛凝乳酶原原始基因(pew)和優(yōu)化基因(pcm、pcm_l、pcm-2)翻譯速率的比較。
[0036]圖4酵母重組表達質(zhì)粒pPIC9_pcw(pcm、pcm-1、pcm-2)的構建示意圖。
[0037]圖5轉(zhuǎn)優(yōu)化基因pcm-1酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0038]圖6轉(zhuǎn)優(yōu)化基因pcm-2酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0039]圖7轉(zhuǎn)優(yōu)化基因pcm酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0040] 圖 8 轉(zhuǎn) pew (pcw_105#)、轉(zhuǎn) pcm_l (pcml_220#)、轉(zhuǎn) pcm_2 (pcm2_116#)、轉(zhuǎn)pcm(pcm-4#)的酵母菌株3升發(fā)酵罐中牛凝乳酶原酶活結果。
[0041]圖9pcm-4#酵母菌株在3升發(fā)酵罐中牛凝乳酶原經(jīng)甲醇誘導不同時間內(nèi)的表達量的SDS-PAGE ；M:蛋白分子量marker。
【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0043]說明:以下具體實施例中所用到重組遺傳學技術均為本領域中的常規(guī)技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節(jié)或部分來進行，包括:Sambrook et al, Molecular Cloning, ALaboratory Manual (第 3 版? 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression:ALaboratory Manual(1990) ；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al, 1994)。
[0044]實施例1凝乳酶原始基因的優(yōu)化
[0045]1.1凝乳酶原原始基因的優(yōu)化
[0046]選用了牛來源的凝乳酶原基因pew (GenBank Accession N0.FJ768675.1)為原始基因序列。凝乳酶原原始基因(pew)全長1098bp(SEQ IDN0.4)，編碼365個氨基酸和一個終止密碼子。通過對牛凝乳酶原原始基因序列特征的分析，按照不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的原則，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量，常用酶切位點，酵母不穩(wěn)定序列ATTTA、AACCAA、AATAA，翻譯起始區(qū)mRNA 二級結構等多種影響因素，按照巴斯德畢赤酵母密碼子的偏愛性對牛凝乳酶原基因序列進行初步改造。共改變218個堿基，占堿基總數(shù)的19.8% ;涉及187個氨基酸，占氨基酸總數(shù)的51.2%。改造前后密碼子使用頻率如圖1和圖2。修飾改造后獲得優(yōu)化的牛凝乳酶原基因分別為pcm、pcm-1、pcm-2，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3所示，其GC含量由57.4降為47.3%(表1);優(yōu)化后的基因(pcm、pcm-1、pcm-2)通過軟件預測(RNA structure4.5),其mRNA 二級結構自由能相比pew (SEQID N0.4)得到了較大幅度的提高，這樣有利于降低轉(zhuǎn)錄能量屏障，提高轉(zhuǎn)錄效率，進而提高蛋白表達量(表2)。同時，優(yōu)化前后基因的mRNA的二級結構也發(fā)生了很大的改變，優(yōu)化基因的mRNA 二級結構減少了發(fā)夾結構，更加簡單，有利于基因的轉(zhuǎn)錄。此外，3條優(yōu)化基因雖然密碼子的使用頻率相同但由于在序列中的位置有差異，所以造成蛋白翻譯速率間有差異(圖3)。這三條優(yōu)化序列人工合成后連接在通用載體上,構建質(zhì)粒pGH-pcm-l,pGH-pcm-2,pGH—pcm。[0047]表1凝乳酶原基因優(yōu)化前后的堿基組成比較
【權利要求】
1.優(yōu)化的牛凝乳酶原基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQID N0.1、SEQ ID N0.2或 SEQ ID N0.3 所示。
2.含有權利要求1所述優(yōu)化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體。
3.按照權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于:所述的重組表達載體是重組真核表達載體。
4.按照權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述的重組真核表達載體是重組酵母表達載體，優(yōu)選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。
5.含有權利要求2-4任何一項所述重組表達載體的重組宿主細胞。
6.按照權利要求5所述的重組宿主細胞，其特征在于:所述重組宿主細胞是重組酵母細胞，優(yōu)選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
7.—種重組牛凝乳酶的生產(chǎn)方法，包括:將權利要求1所述的優(yōu)化的牛凝乳酶原基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導重組牛凝乳酶的表達，回收并純化所表達的重組牛凝乳酶，即得。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于:所述的重組表達載體優(yōu)選為重組真核表達載體，優(yōu)選為重組酵母表達載體，更優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體。
9.按照權利要求7所述的方法，其特征在于:所述的宿主細胞為酵母細胞，優(yōu)選為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
【文檔編號】C12N9/64GK103484488SQ201310421943
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權日:2013年9月16日
【發(fā)明者】張偉, 張宇宏, 劉波, 張艷麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所