一種新型兩親性離子型多肽及其在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型兩親性離子型多肽。具有如下序列DFEFKDFEFKYRGD(F為苯丙氨酸，DF為D構(gòu)型的苯丙氨酸，E為谷氨酸，K為賴氨酸，Y為酪氨酸，R為精氨酸，G為甘氨酸，D為天冬氨酸)的多肽化合物。實(shí)驗(yàn)表明兩親性多肽能在中性介質(zhì)中快速形成小分子水凝膠。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明該類水凝膠形成的三維納米結(jié)構(gòu)更接近于細(xì)胞生長的真實(shí)環(huán)境，非常適合細(xì)胞的三維培養(yǎng)。
【專利說明】—種新型兩親性離子型多肽及其在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于自組裝領(lǐng)域，特別涉及一種能在中性條件性自組裝的小分子水凝膠多肽及其在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自二十世紀(jì)九十年代以來，多肽通過非共價(jià)鍵自組裝形成的小分子水凝膠由于良好的生物相容性，低毒性，生物可降解等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)發(fā)展成一種新型的極佳生物材料。小分子水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程、傷口愈合、再生醫(yī)學(xué)及藥物載體等方面取得了廣泛應(yīng)用。小分子水凝膠的成膠方法包括調(diào)節(jié)pH和溫度，改變離子強(qiáng)度，光催化，酶催化，水溶性有機(jī)溶劑輔助，超聲等。其中改變離子強(qiáng)度，光催化，酶催化的成膠方法最為溫和，生物相容性與其它方法比較相對(duì)較好。但是現(xiàn)有的光催化和酶催化方法在可控性，成膠前體分子的選擇方面有更多的要求，因此通過改變離子強(qiáng)度的方法是目前來說最理想的成膠方法。但是現(xiàn)在已有的通過改變離子強(qiáng)度成膠的多肽分子中，大部分都是在酸性條件下成膠，這就限制了它的應(yīng)用，而且即使能在細(xì)胞培養(yǎng)，傷口愈合等方面應(yīng)用，體系也相對(duì)復(fù)雜。因此能夠在中性條件或者模擬人體環(huán)境下成膠的多肽分子的探索尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的內(nèi)容在于提供一種新型的，通過改變離子強(qiáng)度能在中性條件下形成小分子水凝膠的兩親性多肽。
[0004]本發(fā)明把D構(gòu)型氨基酸和L構(gòu)型的氨基酸結(jié)合起來開發(fā)了一種新型的成膠分子，通過某個(gè)氨基酸構(gòu)型的改變形成一種在中性條件下能穩(wěn)定性存在的水凝膠。其主要原理是通過分子間非共價(jià)鍵的相互作用，D構(gòu)型與L構(gòu)型的氨基酸通過某些特定的空間排列形成納米纖維相互纏繞的三維空間結(jié)構(gòu)，本發(fā)明提供的短肽成分明確，多肽序列為dFEFKdFEFKYRGD(F為苯丙氨酸，dF為D構(gòu)型的苯丙氨酸，E為谷氨酸，K為賴氨酸，Y為酪氨酸，R為精氨酸，G為甘氨酸，D為天冬氨酸)。
[0005]實(shí)驗(yàn)表明可以通過控制離子強(qiáng)度的大小改變所形成多肽dFEFKdFEFKYRGD的納米結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。此種多肽的在中性條件下，濃度大于或者等于0.15% (質(zhì)量/體積)都可以形成水凝膠，形成的水凝膠大部分都是由水組成。
[0006]實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明形成的多肽水凝膠形成均勻的納米纖維結(jié)構(gòu)，所形成的納米纖維結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞的三維培養(yǎng)，本發(fā)明實(shí)例中培養(yǎng)的Hela(宮頸癌細(xì)胞)細(xì)胞形成集落結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有別于二維培養(yǎng)的單分散伸展?fàn)顟B(tài)，而這種集落結(jié)構(gòu)被認(rèn)為更接近于細(xì)胞真實(shí)的三維生長環(huán)境。(Yamada,K.M., Cukierman,E.Modeling Tissue Morphogenesis and Cancerin3D.(2007) Cell, 130(4)，pp.601-610.)
[0007]所述新型小分子水凝膠的制備方法包含以下步驟:
[0008](I)固相合成序列為dFEFKdFEFKYRGD的多肽化合物。
[0009](2)使所述多肽以0.15%到5%的濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶于水性介質(zhì)，再通過與高離子強(qiáng)度溶液混合增強(qiáng)離子強(qiáng)度誘導(dǎo)形成小分子水凝膠。
[0010](3)用濃度為I %的小分子水凝膠應(yīng)用于Hela細(xì)胞的三維培養(yǎng)
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]I提供了一種新型兩親性離子型自組裝多肽，增加了自組裝多肽領(lǐng)域的類型
[0013]2提供一種新型自組裝多肽水凝膠材料，在中性條件下形成可注射的水凝膠，該類水凝膠合成簡單，成膠條件溫和，有非常廣闊的應(yīng)用前景。
[0014]3應(yīng)用該類水凝膠培養(yǎng)癌細(xì)胞，提供非常接近于實(shí)際中細(xì)胞三維生長的環(huán)境，有利于體外腫瘤的生長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:多肽化合物的1HNMR譜圖；
[0016]圖2:多肽在PBS中形成的果凍狀水凝膠；
[0017]圖3:多肽在DMEM中形成的果凍狀水凝膠；
[0018]圖4:用透射電子顯微鏡觀察小分子水凝膠的三維形貌結(jié)構(gòu)；
[0019]圖5:小分子水凝膠三維培養(yǎng)HeLa細(xì)胞死活染色照片；
[0020]圖6:CCK-8測得的HeLa細(xì)胞在不同濃度多肽和不同時(shí)間的增值率。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:多肽化合物(dF`EFKdFEFKYRGD)的合成
[0022]多肽化合物采用多肽固相合成法合成。使用2-氯三苯甲基氯樹脂和相應(yīng)的Fmoc (荷甲氧羰?；?保護(hù)氨基，tert-butyl (叔丁基)、Pbf (2, 2,4,6, 7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)或Boc (叔丁氧羰基)保護(hù)側(cè)鏈的氨基酸。在樹脂上的第一個(gè)從C-端氨基酸連接上之后，用含20%哌啶的無水N，N' - 二甲基甲酰胺，脫保護(hù)基團(tuán)Fmoc。接著下一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸在HBTU(苯并三氮唑-N，N，N' ,N1-四甲基脲六氟磷酸酯)作為偶合試劑和DIEA(二異丙基乙胺)作為催化試劑的條件下被連接到游離的氨基上。根據(jù)固相合成技術(shù)的步驟增長肽鏈。最后一個(gè)氨基酸連接后，除去過量的試劑，用N，N' - 二甲基甲酰胺洗滌5分鐘(5毫升每克樹脂)，二氯甲烷洗滌5次，持續(xù)2分鐘(5毫升每克樹脂)。用95%的三氟乙酸，2.5%的三甲基硅烷和2.5%的水作用30分鐘將合成的多肽從樹脂上切下。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，再在溶液中加入冰乙醚(每克樹脂20毫升)。所得沉淀物在4°C以1000Orpm下離心10分鐘后，去上層清液，將得到的固體溶解在DMSO中，用含有
0.05%的三氟乙酸的甲醇和含甲醇5%的水作為洗脫劑進(jìn)行HPLC(高效液相色譜)分離。
[0023]實(shí)施例2:小分子水凝膠的制備I
[0024]稱取3.0mg多肽，加入雙蒸水1000 μ L，使多肽在水中的濃度為0.3%，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的2X PBS (磷酸鹽緩沖液，成分)混合。最終多肽化合物的濃度為0.15%。
[0025]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠。
[0026]實(shí)施例3:小分子水凝膠的制備2
[0027]稱取3.0mg多肽，加入雙蒸水1000 μ L，使多肽在水中的濃度為0.3%，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的DMEM培養(yǎng)基混合。最終多肽化合物的濃度為0.15%。
[0028]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠。
[0029]實(shí)施例4:小分子水凝膠的制備3
[0030]稱取4.0mg多肽，加入雙蒸水200 μ L，使多肽在水中的濃度為2 %，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的2X PBS (磷酸鹽緩沖液)混合。最終多肽化合物的濃度為I %。
[0031]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠(如圖2)。
[0032]實(shí)施例5:小分子水凝膠的制備4
[0033]稱取4.0mg多肽，加入雙蒸水200 μ L，使多肽在水中的濃度為2%，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的DMEM培養(yǎng)基混合。最終多肽化合物的濃度為1%。
[0034]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠(如圖3)。
[0035]實(shí)施例6:小分子水凝膠的制備5
[0036]稱取20.0mg多肽，加入雙蒸水200 μ L，使多肽在水中的濃度為10%，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的2X PBS (磷酸鹽緩沖液)混合。最終多肽化合物的濃度為5%。
[0037]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠。
[0038]實(shí)施例7:小分子水凝膠`的制備6
[0039]稱取4.0mg多肽，加入雙蒸水200 μ L，使多肽在水中的濃度為10%，加四倍當(dāng)量的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值，此時(shí)形成粘稠透明液體。將上述溶液與等體積的DMEM培養(yǎng)基混合。最終多肽化合物的濃度為5%。
[0040]上述溶液靜置立即成膠，最終形成透明均一的果凍狀小分子水凝膠。
[0041]實(shí)施例8:小分子水凝膠的三維結(jié)構(gòu)
[0042]上述多肽形成的水凝膠通過透射電子顯微鏡觀察其三維形貌
[0043]稱取4.0mg多肽，加入雙蒸水200 μ L，用碳酸氫鈉小心調(diào)節(jié)pH至7.4，形成粘稠液體。與等體積2X PBS混合均勻，靜置成膠(時(shí)間)。
[0044]用移液槍吸取大約15 μ L左右的水凝膠滴加到表面干凈的銅網(wǎng)上，用氮?dú)馓幚硎蛊渚鶆?，于干燥器中靜置干燥在透射電子顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)(如圖4)。其形貌為網(wǎng)狀的納米纖維結(jié)構(gòu)。
[0045]實(shí)施例9:小分子水凝膠應(yīng)用于細(xì)胞的三維培養(yǎng)
[0046]將含有2%多肽的雙蒸水與等體積的含3Χ106個(gè)/mL HeLa (實(shí)驗(yàn)用增殖表皮癌細(xì)胞)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基混合，將細(xì)胞混懸液向九十六孔板中每孔加50 μ L，靜置成膠。最終多肽化合物的濃度為I %，細(xì)胞密度為1.5Χ106個(gè)/mL。放入37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2)培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)1、3、5、7天的癌細(xì)胞進(jìn)行死活染色(如圖5)，得到結(jié)果表明癌細(xì)胞在上述水凝膠中成活率極高，且不擴(kuò)散生長，形成細(xì)胞集落。
[0047]實(shí)施例10 =HeLa細(xì)胞在小分子水凝膠中增值率的測定
[0048]將含有0.6%、1%、2%多肽的雙蒸水與等體積的含3乂106個(gè)/1^ HeLa(實(shí)驗(yàn)用增殖表皮癌細(xì)胞)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基混合，將細(xì)胞混懸液向九十六孔板中每孔加50 μ L，靜置成膠。最終多肽化合物的濃度為0.3^^0.5^^1 %、細(xì)胞密度為1.5Χ106個(gè)/mL。放入37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2)培養(yǎng)。在1、3、5、7天取出細(xì)胞，用不含血清的DMED洗滌后，向每孔加入100 μ LlO % (體積/體積)的CCK-B (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)。將九十六孔板放入37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱(5%C02)4小時(shí)。取出，用酶標(biāo)儀(MultiskaniMark，Bio-Rad，USA)測定其在450nm出的吸收值。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)五次并將結(jié)果取平均值得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖6) 。
【權(quán)利要求】
1.一種新型兩親性離子型多肽，其特征在于它的氨基酸序列為dFEFKdFEFKYRGD。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列中I位和4位的氨基酸為D構(gòu)型的苯丙氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，能夠自組裝形成納米結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，具有D、L構(gòu)型的中性疏水氨基酸及間隔的正、負(fù)電荷氨基酸，并含有RGD序列。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，溶于水性介質(zhì)。加入高強(qiáng)度的離子溶液，能夠自組裝成小分子水凝膠。
6.如權(quán)利要求1所述兩親性多肽在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述制備方法得到的一種新型兩親性離子型多肽及其在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103509088SQ201310421701
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】楊志謀, 王玲, 馮趙騫琦, 史洋 申請(qǐng)人:南開大學(xué)