專(zhuān)利名稱(chēng)：逆境特異誘導(dǎo)雙向表達(dá)活性的水稻啟動(dòng)子cpip的鑒定和利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)涉及一種植物逆境特異誘導(dǎo)啟動(dòng)子的分離鑒定和應(yīng)用。該啟動(dòng)子被命名為CPIP，被干旱或鹽誘導(dǎo)并具有雙向誘導(dǎo)表達(dá)活性，將其應(yīng)用于植物抗逆基因特別是用于重要作物抗逆基因的遺傳轉(zhuǎn)化，達(dá)到提高植物抗逆性的目的。
背景技術(shù)：
水稻是最重要的糧食作物之一，我國(guó)是世界上第一種稻大國(guó)。非生物逆境(干旱、冷害和土壤鹽漬化等)嚴(yán)重威脅著水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。在面臨逆境脅迫時(shí)，植物的許多信號(hào)傳遞系統(tǒng)被開(kāi)啟，一批應(yīng)答基因被誘導(dǎo)，包括直接起保護(hù)作用的功能蛋白基因(滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、功能蛋白等)和在信號(hào)傳遞與脅迫應(yīng)答基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用的調(diào)控基因(轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等)(Xiong等，Cell signaling during cold，droughtand salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。盡管已有文獻(xiàn)報(bào)道從植物中分離了大量抗逆相關(guān)基因并且在植物中超量表達(dá)這些基因?qū)μ岣咧参锟鼓嫘杂幸欢ㄐЧ?Thomashow等，Plant coldacclimationFreezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol Biol 50571-599，1999；Shinozaki等，Molecular response to dehydration and low temperatureDifferences and cross-talk between two stress signaling pathways.Curr Opin Plant Biol 3217-223.2000；Saijo等，Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold andsalt/drought tolerance on rice plants.Plant J 23319-327，2000；Kim等，CIPK3，a calciumsensor-associated protein kinase that regulates abscisic acid and cold signal transduction inArabidopsis.Plant Cell 15411-423，2003)，但超量表達(dá)往往會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)面的影響，如影響植物原來(lái)的產(chǎn)量潛力或?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株的致死效應(yīng)或強(qiáng)烈的多重效應(yīng)(Shavindra等，Transgenic approaches toincrease dehydration-stress tolerance in plants.Mol Breed 5493-503，1999)。利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)控制抗逆基因的表達(dá)越來(lái)越受到重視，一些逆境應(yīng)答的啟動(dòng)子，如SalT啟動(dòng)子(Garcia等，Theexpression of the salt-responsive gene salT from rice is regulated by hormonal and developmentalcues，Planta.207172-180，1998)，RD29A啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozaki等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of itspromoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 23331-340，1993；Kasuga等，A combination of theArabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperaturestress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol 45346-350，2004)，HVA1啟動(dòng)子(Xu等，Expression of a late embryogenesis abundant protein gene，HVA1，from barley conferstolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.Plant Physiol 110249-257，1996；Ho和Wu等，Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants USpatent，US5981842，1999)也已經(jīng)鑒定出來(lái)并嘗試了在一些作物的抗逆改良中應(yīng)用。但已經(jīng)鑒定的啟動(dòng)子要么特異性不強(qiáng)(即非誘導(dǎo)情況下表達(dá)量較高)，要么誘導(dǎo)強(qiáng)度不高，使得實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值大打折扣。另一方面，出于生物安全性的考慮，更是迫切需要條件誘導(dǎo)型(如鹽誘導(dǎo))啟動(dòng)子來(lái)控制遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中篩選標(biāo)記基因的表達(dá)。此外，由于到目前為止幾乎所有用于遺傳轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)子都只有單方向上的表達(dá)活性；即使個(gè)別啟動(dòng)子在另一方向有表達(dá)活性，但由于活性通常很低而無(wú)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。具有雙向強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子不僅在構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體時(shí)能減少外源片段的數(shù)量，而且可以用于控制需要協(xié)同表達(dá)才能起作用的多基因的載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化。但是迄今為止尚無(wú)雙向強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子的鑒定和在遺傳轉(zhuǎn)化中利用的報(bào)道。
本發(fā)明是鑒定一個(gè)鹽和干旱等逆境強(qiáng)烈誘導(dǎo)的水稻蛋白酶抑制子基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有雙向逆境強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)活性并且分別控制一個(gè)蛋白酶抑制子基因的表達(dá)。通過(guò)啟動(dòng)子活性分析，將具有雙向逆境強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子區(qū)段用于調(diào)控篩選標(biāo)記基因和抗逆基因(或同時(shí)控制多個(gè)抗逆基因)在水稻中的表達(dá)，從而有效地提高了植物的抗逆性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆、鑒定一個(gè)鹽和干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)且具有雙向表達(dá)活性的植物內(nèi)源啟動(dòng)子，并利用該啟動(dòng)子構(gòu)建抗逆相關(guān)基因的表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到提高植物的抗逆性。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)首先是分離鹽和干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。所分離的鹽和干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子(該啟動(dòng)子的序列如SEQ ID NO1所示)來(lái)源于水稻。該啟動(dòng)子控制的水稻內(nèi)源基因?yàn)槊拥鞍酌敢种谱?ChymotrypsinProteinase inhibitor)家族的兩個(gè)成員，即這兩個(gè)基因反向串聯(lián)排列共同受一個(gè)具有雙向表達(dá)活性的啟動(dòng)子控制(如圖2所示)。該啟動(dòng)子命名為CPIP(Chymotrypsin Proteinase Inhibitor Promoter)。這兩個(gè)基因分別命名為OsCPI1(GenBank登錄號(hào)AY878695)和OsCPI2(GenBank登錄號(hào)AY878694)，它們都能被干旱、高鹽脅迫、冷害以及脫落酸(ABA)誘導(dǎo)(如圖3所示)。該啟動(dòng)子CPIP的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，序列全長(zhǎng)1893個(gè)堿基，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，例如Skriver等，Cis-acting DNA elements responsive togibberellin and its antagonist abscisic acid.Proc Natl Acad Sci USA.887266-7270.1991；Simpson等，Two different novel cis-acting elements of erd1，a clpA homologous Arabidopsis gene functionin induction by dehydration stress and dark-induced senescence.Plant J 33259-270，2003和Urao等，An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.Plant Cell 51529-1539，1993；Abe等，Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptional activators in abscisic acid signalling.Plant Cell1563-78，2003，我們得知其中在307-311，423-427，571-575，1173-1177堿基位含有逆境相關(guān)的ABA應(yīng)答元件ABRELATERD1，并在堿基位325-330，801-806，878-883，1384-1389，1849-1854含有MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的干旱應(yīng)答順式作用元件。
本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子CPIP區(qū)域含有多個(gè)逆境相關(guān)順式作用元件(如圖1所示)，能特異性地對(duì)逆境和ABA起應(yīng)答反應(yīng)。申請(qǐng)人利用啟動(dòng)子CPIP的正向和反向構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-CPIP(如圖4所示)可以在植物受到逆境脅迫時(shí)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)報(bào)告基因GUS的表達(dá)(如圖5、6、7所示)。本發(fā)明的效果詳見(jiàn)具體實(shí)施方式
。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述一種被干旱或鹽誘導(dǎo)并具有雙向誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子CPIP，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。具體地說(shuō)它是SEQ ID NO1所示1-1893位堿基所示的序列。
如附圖1所述，上述啟動(dòng)子序列的區(qū)域內(nèi)除含有基本啟動(dòng)子元件外(例如CAAT-box，TATA-box)，還包含多個(gè)逆境應(yīng)答順式作用元件(例如ACGTATERD1，ABRELATERD1，MYB1AT和MYBCORE)的組合。
申請(qǐng)人將所述的啟動(dòng)子CPIP全部或部分序列構(gòu)建成一種植物表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-CPIP(如附圖4所述)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述的植物表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-CPIP轉(zhuǎn)化水稻栽培品種植株，得到耐鹽或抗旱的轉(zhuǎn)基因水稻植株，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、種子或細(xì)胞無(wú)性系。
按照以上的技術(shù)方案，很顯然，申請(qǐng)人或申請(qǐng)人以外的其他人可以利用本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子CPIP構(gòu)建抗逆相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物的抗逆性。受體植物可以是包括水稻、小麥、玉米等在內(nèi)的禾谷類(lèi)作物，當(dāng)然也可以包括其他一些重要的經(jīng)濟(jì)作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄作物上的應(yīng)用。


序列表SEQ ID NO1，公開(kāi)了本發(fā)明克隆的水稻啟動(dòng)子CPIP的序列。
圖1顯示的是啟動(dòng)子CPIP序列。下劃線(xiàn)序列為擴(kuò)增啟動(dòng)子CPIP所用的引物序列。陰影顯示的是基本啟動(dòng)子元件序列。ABRE類(lèi)的逆境應(yīng)答元件核心序列用文本框表示。MYB類(lèi)逆境應(yīng)答元件序列用波浪線(xiàn)表示。
圖2顯示的是啟動(dòng)子CPIP與OsCPI1和OsCPI2兩個(gè)基因在水稻基因組(位于第一染色長(zhǎng)臂，加紅框)中的位置關(guān)系。啟動(dòng)子CPIP包含了OsCPI1和OsCPI2兩個(gè)基因各自的第一個(gè)外顯子以保證轉(zhuǎn)錄活性。
圖3顯示的是OsCPI1和OsCPI2基因能被多種逆境(干旱、200mM/L NaCl、100μM/L ABA)誘導(dǎo)表達(dá)。
圖4是本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-CPIP物理圖譜。該載體含潮霉素(HRG)抗性篩選基因，啟動(dòng)子CPIP被融合到GUS基因5’端非翻譯區(qū)。引物CPIP-F/M13F若能擴(kuò)增出約1900bp片段，即CPIP正向連入；否則CPIP被反向連入。
圖5顯示的是啟動(dòng)子CPIP正向控制下的GUS基因在干旱脅迫處理下的誘導(dǎo)表達(dá)。CPIP-GUS融合基因的水稻轉(zhuǎn)化植株干旱進(jìn)行處理后，按圖中標(biāo)注的時(shí)間點(diǎn)取樣，Northern檢測(cè)GUS表達(dá)量的變化(A)并定量測(cè)定對(duì)應(yīng)植株取樣點(diǎn)的GUS蛋白活性(B)。野生型植株(CK)與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株b是在土壤中干旱脅迫；陽(yáng)性植株a是在吸干根部水分后暴露空氣中干旱脅迫。
圖6顯示的是啟動(dòng)子CPIP正向控制下的報(bào)告基因GUS轉(zhuǎn)基因水稻在高鹽(200mM/L NaCl)下葉片中GUS表達(dá)量(A)和GUS活性分析(B)。圖中CK為野生型對(duì)照，a、b為兩棵獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株。
圖7顯示的是CPIP反向控制下的報(bào)告基因GUS轉(zhuǎn)基因水稻在干旱、高鹽(200mM/L NaCl)脅迫下葉片中GUS表達(dá)量(A)和GUS活性分析(B)。ck1干旱處理野生型植株；(a)干旱處理轉(zhuǎn)化植株；ck2NaCl處理野生型植株；(b)NaCl處理轉(zhuǎn)化植株。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、啟動(dòng)子CPIP分離和鑒定通過(guò)水稻品種“中旱5號(hào)”(由中國(guó)上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的商業(yè)品種)的干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達(dá)量提高12倍以上)的cDNA，經(jīng)序列分析確定該cDNA為一完整的全長(zhǎng)cDNA編碼一個(gè)糜蛋白酶抑制子基因，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為AY878695；為方便分析，把該基因命名為OsCPI1。用OsCPI1的DNA序列搜尋水稻基因組序列，在離該基因約1118堿基對(duì)的位置存在一個(gè)序列相似性達(dá)82％的同源基因(命名為OsCPI2)，其轉(zhuǎn)錄方向與OsCPI1相反。在KOME數(shù)據(jù)庫(kù)(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中找到一個(gè)與該OsCPI2序列100％匹配的全長(zhǎng)cDNA編號(hào)為AK062495。
在已知OsCPI1和OsCPI2是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向相反且只間隔1118bp的基因的基礎(chǔ)上，下一步就是分離可能控制這兩個(gè)基因的共同啟動(dòng)子。具體步驟如下根據(jù)OsCPI1全長(zhǎng)cDNA序列在GeneBank中找到了對(duì)應(yīng)的粳稻“日本晴”的基因組序列(GenBank登錄號(hào)為AP002866)并選取該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2Kb的范圍作為候選啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物CPIP-F(GGATCCGCTTGCTGTCTGATGAACTC)和CPIP-R(GGATCCAAACAATCGAGAAGATCCAA)斜體下劃線(xiàn)表示添加的限制性酶切位點(diǎn)BamHI。首先利用引物CPIP-F、CPIP-R以日本晴基因組DNA(CTAB法抽提，參照Z(yǔ)hang等報(bào)道的方法genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2mim，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳挖膠回收后連入pGEM-T Easy載體上，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序(ABI3730測(cè)序儀，Applied Biosystem，測(cè)序在國(guó)家植物基因中心[武漢]完成)，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增序列為預(yù)期的后動(dòng)子CPIP序列，其包含多個(gè)旱、ABA逆境應(yīng)答順式作用元件(如圖1)。
實(shí)施例2、檢測(cè)水稻內(nèi)源基因OsCPI1和OsCPI2的誘導(dǎo)表達(dá)以水稻品種“珍汕97”(一個(gè)中國(guó)廣泛推廣栽培的水稻品種)為材料，在3葉期分別進(jìn)行干旱、高鹽脅迫以及脫落酸(ABA)處理。干旱處理是將水稻幼苗根部水分吸干暴露于空氣中于0h，30min，2h，4h，6h取樣，高鹽脅迫是將土壤中種植的幼苗種灌澆200mM NaCl溶液中并在0h，3h，1h，3d后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100μM ABA溶液中并在0h，30min，3h，6h，24h和72h后取樣。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，Invitrogen)后進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜(參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)，并以O(shè)sCPI1、OsCPI2分別為探針做Northern雜交。結(jié)果表明，OsCPI1、OsCPI2均能被干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)(如圖3)。
實(shí)施例3、啟動(dòng)子CPIP干旱誘導(dǎo)活性鑒定本發(fā)明的實(shí)施方案就是構(gòu)建啟動(dòng)子CPIP的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種“中花11”(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)品種)中定量地檢測(cè)啟動(dòng)子CPIP的干旱誘導(dǎo)表達(dá)活性。具體操作如下首先將實(shí)施例1中分離的啟動(dòng)子CPIP的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體(購(gòu)自Promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購(gòu)自Promega公司)并藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。因?yàn)樵O(shè)計(jì)引物時(shí)在加入了BamHI酶切位點(diǎn)，通過(guò)單酶切連接將產(chǎn)物連入表達(dá)載體pCAMBIA1391Z(來(lái)自CAMBIA公開(kāi)使用的載體，載體含有GUS報(bào)告基因)的多克隆位點(diǎn)獲得報(bào)告基因表達(dá)載體pCAMBIA1391Z-CPIP-GUS(推定其正向、反向均有可能實(shí)現(xiàn))。通過(guò)酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆確定片段連入載體中后，再通過(guò)pCAMBIA1391Z載體上的通用引物M13F與所設(shè)計(jì)引物CPIP-F(序列同實(shí)施例1)做PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定啟動(dòng)子CPIP連入載體中的表達(dá)載體正、反方向性(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4)。將正、反兩方向報(bào)告基因表達(dá)載體分別通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種中花11中，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見(jiàn)Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，1994，Plant Journal 6271-282)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫(xiě)本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫(xiě)表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制)硝酸鉀(KNO3) 28.3克磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0克硫酸銨((NH4)2SO4) 4.63克硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85克氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66克將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000毫升。
2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI) 0.08克硼酸(H3BO3)0.16克硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44克硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15克將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至70℃溫浴2小時(shí)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)煙酸(Nicotinic acid) 0.1克維生素B1(Thiamine HCl) 0.1克維生素B6(Pyridoxine HCl)0.1克甘氨酸(Glycine) 0.2克肌醇(Inositol) 10克加蒸餾水定容至1000毫升，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配制)硝酸銨(NH4NO3) 16.5克硝酸鉀 19.0克磷酸二氫鉀 1.7克硫酸鎂 3.7克氯化鈣 4.4克將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制)硫酸錳(MnSO4·4H2O) 2.23克硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.86克硼酸(H3BO3) 0.62克碘化鉀(KI) 0.083克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.025克硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025克氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.0025克將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
7)2，4-D貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，于室溫下保存。
8)6-BA貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升 蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，室溫保存。
9)萘乙酸(NAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升 蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升 蒸餾水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 11)葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 12)AS貯存液的配制秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分裝至1.5毫升離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 13)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液(取已經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同)100毫升N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) 10毫升維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升2，4-D貯存液(取上述制備好的)2.5毫升脯氨酸(Proline) 0.3克CH 0.6克蔗糖30克Phytagel3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121℃下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。
2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 10毫升維生素貯存液(100X)10毫升2，4-D貯存液 2.0毫升脯氨酸0.5克CH0.6克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.75毫升CH0.15克蔗糖 5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5毫升N6mix母液(100X) 1.25毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.75毫升CH0.2克蔗糖 5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/每皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5毫升N6mix母液(100X) 0.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 0.5毫升維生素貯存液(100X)1毫升2，4-D貯存液 0.2毫升CH0.08克蔗糖 2克加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入1毫升無(wú)菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升2，4-D貯存液 0.625毫升CH0.15克蔗糖 7.5克瓊脂粉1.75克加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25毫升N6mix母液(100X) 2.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 2.5毫升維生素貯存液(100X)2.5毫升6-BA貯存液0.5毫升KT貯存液 0.5毫升
NAA貯存液50微升IAA貯存液50微升CH 0.15克蔗糖 7.5克瓊脂粉 1.75克加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100毫升N6mix母液(100X) 10毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 10毫升維生素貯存液(100X)10毫升6-BA貯存液2毫升KT貯存液 2毫升NAA貯存液 0.2毫升IAA貯存液 0.2毫升CH1克蔗糖 30克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50毫升MSmix母液(100X) 5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X) 5毫升維生素貯存液(100X)5毫升蔗糖 20克Phytagel 3克加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(該菌株來(lái)自CAMBIA公司公開(kāi)使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28℃；2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。
3.5農(nóng)桿菌侵染1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD600.8-1.0；3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。
3.7分化1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃。
3.8生根1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。
申請(qǐng)人采用構(gòu)建的pCAMBIA1391Z-CPIP載體(圖4)轉(zhuǎn)化水稻。對(duì)產(chǎn)生的抗性植株進(jìn)行干旱、高鹽脅迫，通過(guò)檢測(cè)脅迫后的植株中GUS蛋白活性來(lái)評(píng)價(jià)啟動(dòng)子CPIP受逆境脅迫誘導(dǎo)強(qiáng)度。其中高鹽處理是將培養(yǎng)水稻抗性植株的水培液中加入200mM NaCl；干旱處理及取樣方法參照實(shí)施例2進(jìn)行。水培培養(yǎng)液各元素濃度N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。
將對(duì)照與脅迫后植株各時(shí)間點(diǎn)所取樣品在液氮中磨成粉末，分成兩管。一管抽提RNA(Trizol試劑，Invitrogen)，轉(zhuǎn)膜后以GUS基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Northern雜交(方法同實(shí)施例2)來(lái)分析逆境脅迫后啟動(dòng)子CPIP控制的報(bào)告基因的表達(dá)情況。對(duì)應(yīng)另一管樣品通過(guò)GUS提取緩沖液(50mM Na2HPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na2EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白質(zhì)，從樣品蛋白質(zhì)提取物中取10μl進(jìn)行GUS活性的定量分析。具體操作如下將10μl樣品蛋白質(zhì)提取物+0.4mlGUS提取緩沖液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl-β-D-glucuronide)在37℃水浴20min后，加入1.6ml反應(yīng)終止液(0.2M Na2CO3)；DyNA Quant 200熒光計(jì)調(diào)零后，將50nM MU的滅光吸收值定為500作為參比，測(cè)出這2ml反應(yīng)液反應(yīng)所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相對(duì)熒光吸收值，；然后對(duì)各樣品的總蛋白質(zhì)通過(guò)Bradford法(參見(jiàn)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding.1976，Anal Biochem，72248-254)進(jìn)行濃度測(cè)量以便對(duì)各樣品的GUS活性相對(duì)值進(jìn)行比較分析。綜合以上數(shù)據(jù)得出各個(gè)樣品的GUS活性的絕對(duì)值(pmol MU/min/mg protein)。
通過(guò)在p1391Z-CPIP轉(zhuǎn)化植株中GUS的Northern雜交和GUS蛋白活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子CPIP正、反兩方向均具備受干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)活性。在p1391Z-CPIP正向轉(zhuǎn)化植株中，啟動(dòng)子在干旱脅迫下呈現(xiàn)梯度上升趨勢(shì)(附圖5)，高鹽脅迫6小時(shí)后，啟動(dòng)子正向控制的GUS活性是脅迫前的三倍(附圖6)。同時(shí)，啟動(dòng)子CPIP反向控制下的GUS表達(dá)量也受到干旱、高鹽強(qiáng)烈誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化植株的GUS蛋白活性在干旱脅迫下比脅迫前升高達(dá)到四倍，鹽脅迫后誘導(dǎo)量上升將近六倍(如附圖7所示)。
序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>逆境特異誘導(dǎo)雙向表達(dá)活性的水稻啟動(dòng)子CPIP的鑒定和利用<130>
<141>2006-01-13<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1893<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>promoter<222>(1)..(1893)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(1762)..(1765)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(1418)..(1421)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(639)..(642)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(618)..(621)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(562)..(565)
<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(467)..(470)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(312)..(315)<223>
<220>
<221>CAAT_signal<222>(155)..(158)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(1483)..(1488)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(1325)..(1331)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(1250)..(1256)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(985)..(990)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(923)..(928)<223>
<220>
<221>TATA_signal
<222>(578)..(584)<223>
<220>
<221>TATA_signal<222>(377)..(383)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(1874)..(1893)<223>
<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>1gcttgctgtc tgatgaactc attctggtca cagcaaatta atgaagcaaa attcctgcaa 60atatagctag gattaatttg ttgttgtgta cacgcaaggc acttaattcg aaacactctt120tcatcaaatt aagatcagaa caggtactta caaccaattg aaactgcttg ctatcgagac180tgaaacgggt gttattgtcc agcagaatga tagatgctct attgatcgat tcttaagttg240tgtgtgcgtt tggtgtatga gggatggagt tgtgtggtgt atttataaga tgagaaaaga300agcaaaacgt gcaatttttc ggtgccgtta atggataggc ttcccagttt gctgagatga360gatatacttg tagacttatt aatccttctg gactcagaaa attcacggat gtaaagggtg420gcacgtgtgt gtggtggaga ctctactagt cagagaaaga aagtgtcaat ttgttaaggt480agtactcttc tgcatatacc acttggtgcc cagatttgca gaaaacgata tgattaataa540acattttaca ggtcaaattt acaatgtgca acgtggatat aaatatgatt cattggatca600tgccattgta acttcttcaa tactaaaata taccactaca atttatggaa ttttagacat660gcttaattta ataggtattt caaatatgcc actacatgtg tatttcttcg atgaaccaac720ttgtccatgt cttctttttt ttttttcatc ccctcctcct gttcatcttc tgcaccatta780ccatcagaga tggactcggc cagttatcag catggagcta tagcttagag cagcactgca840gcaggcagcc aaatccatcc aagcttgttg ccgctgcctg ttaaatgcat cgaatagcta900agcactgaca tatcactaat gcttattttt ggttctacca tgattatggt ttcatttcct960ctctgcgcca catagctact actattattt agctcgaaat taattaaatc ttcctagctc 1020caaatgcgtt tagaagaatt aattatactc agctctatat gtgcaaggtt catcgtcaaa 1080attcaaatct gcaacccaca agtagccacg caccatatgg ccaaatgtcc ccatgtccaa 1140atcgttgaat atgcatccaa caacccctct acacgtgggt gcacatgcat gaagattgaa 1200
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1.一種被干旱或鹽誘導(dǎo)并具有雙向誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子CPIP，它的核苷酸序列如SEQID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子CPIP，它是SEQ ID NO1所示1-1893位堿基所示的序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子CPIP的全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體為啟動(dòng)子CPIP的全部序列。
5.權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體，該載體是pCAMBIA1391Z-CPIP。
6.權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子CPIP在培育抗逆植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中包括在培育耐旱或抗鹽植物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6或7的應(yīng)用，其中包括在培育耐旱或抗鹽水稻中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。從水稻(Oryza Sativa L.)中分離克隆并鑒定了一種被干旱或鹽誘導(dǎo)并具有雙向誘導(dǎo)表達(dá)活性的啟動(dòng)子CPIP，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，能同時(shí)控制兩個(gè)糜蛋白酶抑制子基因。由啟動(dòng)子CPIP在正反方向控制的糜蛋白酶抑制子基因都能特異性地對(duì)干旱、鹽脅迫和對(duì)脫落酸(ABA)起應(yīng)答反應(yīng)，所述的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)逆境應(yīng)答順式作用元件。將啟動(dòng)子CPIP以正反兩個(gè)方向分別控制GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化水稻，GUS轉(zhuǎn)基因在干旱、鹽脅迫時(shí)都能強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明還公開(kāi)了利用該啟動(dòng)子構(gòu)建逆境特異誘導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體以及通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法培育耐鹽、抗旱等抗逆植物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1807629SQ20061001815
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者熊立仲, 黃越敏 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)